Лекарственные препараты, получаемые методом генной инженерии

Десять лет назад выдвинута концепция использования трансгенных растений для производства так называемых «съедобных» вакцин (edible vaccines). Действительно, если какой-либо съедобный орган растения будет синтезировать белок-антиген, обладающий сильными оральными иммуногенными свойствами, то при употреблении этих растений в пищу параллельно будет усваиваться и белок-антиген с выработкой соответствующих антител.

Получены растения табака, несущие ген, кодирующий антиген оболочки вируса гепатита В под растительным промотором. Наличие антигена в листьях трансгенных растений подтверждено иммуноферментным анализом. Показано сходство физико-химического строения и иммунологических свойств образующегося рекомбинантного антигена и антигена сыворотки человека.

Идентификация антител, продуцируемых в растениях, показала возможность сборки двух рекомбинантных генных продуктов в одну белковую молекулу, что невозможно в прокариотических клетках. Сборка антител происходила, когда обе цепи были синтезированы с сигнальной последовательностью. При этом, наряду с возможностью введения двух генов в одно растение, возможно также соединение индивидуальных полипептидных цепей, синтезируемых в разных трансгенных растениях, в полноценный белок при гибридизации этих двух растений. Возможно введение нескольких генов на одной плазмиде.

Трансгенные растения-продуценты аутоантигенов могут использоваться также при других аутоиммунных болезнях, таких как множественный склероз, ревматический артрит, инсулинозависимый диабет и даже отторжения при трансплантации органов. Инсулинозависимый диабет является аутоиммунным заболеванием, при котором продуцирующие инсулин клетки поджелудочной железы разрушаются собственными цитотоксичными Т-лимфоцитами. Оральное профилактическое потребление значительных количеств иммуногенных белков может привести к предохранению и значительной задержке появления симптомов аутоиммунных болезней. Однако оно возможно только при наличии значительного количества аутоантигенов. Белки инсулин и панкреатическая декарбоксилаза глютаминовой кислоты (GAD65) рассматриваются в качестве оральных вакцин для предотвращения инсулинозависимого диабета. Недавно канадские биотехнологи получили трансгенные растения картофеля, синтезирующие панкреатическую декарбоксилазу глютаминовой кислоты. При скармливании предрасположенным к диабету мышам отмечено как снижение встречаемости диабета, так и величины аутоиммунного ответа.

Приведенные выше результаты генноннженерных разработок убедительно свидетельствуют о возможности создания «съедобных» вакцин на основе трансгенных растений. Учитывая тот факт, что разработка вакцин для человека потребует гораздо больше времени и более тщательной проверки на безвредность для здоровья, следует ожидать, что первые съедобные вакцины будут разработаны для животных. Исследования на животных помогут раскрыть механизмы действия «съедобных» вакцин и только потом, после длительного изучения и всесторонней оценки, такие вакцины можно будет использовать в клинической практике. Тем не менее, работы в этом направлении активно продолжаются, а идея использования растений для производства вакцин уже запатентована в США, что свидетельствует о коммерческом интересе к этим разработкам.

Несмотря на столь обнадеживающие результаты, проблема создания коммерческих «съедобных» вакцин против диареи требует дальнейших исследований. В патогенезе энтеротоксической формы бактериальных и холерных диарей первичным является обеспечение возможности бактериям размножаться в тонком отделе кишечника. Этот процесс зависит от способности Escherichia coli к адгезии, что обусловлено наличием на поверхности бактериальных клеток специальных нитевидных образовании белковой природы -- фимбрий. На стенках тонкого кишечника больных диареей обнаруживается значительно больше бактерий, чем в просвете того же участка кишечника, что связано с наличием у Escherichia coli фимбриальных адгезинов -- белков, обеспечивающих связывание с рецепторами на поверхности кишечного эпителия.

Даже непатогенные штаммы Escherichia coll, которые содержали плазмиду, кодирующую синтез адгезина, были способны колонизировать кишечник и вызывать диарею, не вырабатывая при этом энтеротоксинов. В связи с этим вполне вероятно, что иммунности только против токсинов будет недостаточно для предотвращения патогенных эффектов, вызываемых холерным вибрионом или кишечной палочкой. Возможно, что для преодоления этих эффектов в добавление к антигенам энтеротоксинов необходимо будет экспрессировать нейтрализующие эпитопы структурных антигенов, таких как липополисахариды, белки внешней мембраны бактерий или адгезинов, ассоциированных с фимбриями этих бактерий, ответственных за связывание со слизистой оболочкой кишечника. Недавно один из таких адгезинов -- FimH -- был успешно использован для иммунизации мышей против бактериальной диареи.

Еще одна важная проблема, связанная с разработкой «съедобных» вакцин -- уровень экспрессии гетерологичного антигена в растениях. Поскольку при пероральном введении вакцины требуются большие количества антигена, чем при парентеральном, количество синтезируемого в растениях антигена,которое сейчас составляет не более 0,3% от общего растворимого белка, должно быть увеличено. В то же время уровень экспрессии должен быть достаточно высоким для того, чтобы вызывать иммунный ответ, но быть меньше уровня, который вызывает толерантность к антигену, как это происходит с веществами, потребляемыми с обычной пищей. А так как иммунный ответ (иммуногенность против толерантности) может быть антиген-специфичным, то уровни экспрессии для каждого потенциального антигена надо будет подбирать индивидуально.

Как показывают эксперименты, уровень экспрессии гетерологичного антигена в растениях может быть увеличен путем использования тканеспецифичных промоторов и энхансеров, энхансеров транскрипции и трансляции, добавлением транспортирующих пептидов, а также путем изменения нуклеотидной последовательности соответствующих генов с использованием кодонов, предпочтительных для растений. Однако, вопрос о том, какие растения лучше использовать и в каком съедобном органе лучше экспрессировать антиген, требует дальнейших исследований, так как в различных растениях могут содержаться вещества, блокирующие или замедляющие иммунный ответ или просто токсичные для человека и животных, как, например, алкалоиды в клетках табака.

Растения-биореакторы

Одним из перспективных направлений ДНК-технологий растений является создание растений-биореакторов, способных продуцировать белки, необходимые в медицине, фармакологии и др. К достоинствам растений-биореакторов относится отсутствие необходимости в кормлении и содержании, относительная простота создания и размножения, высокая продуктивность. Кроме того, чужеродные белки не вызывают иммунных реакций у растений, чего трудно добиться у животных.

Существует потребность в получении целого набора биологически активных белков, которые, из-за очень низкого уровня синтеза в специфических тканях или продуктах, недоступны для изучения по механизму действия, широкого использования или определения областей дополнительного применения. К таким белкам относится, например, лактоферрин, который находится в небольшом количестве в молоке млекопитающих, лейкоцитах крови.

Лактоферрин человека (hLF) перспективно использовать в качестве пищевой добавки и лечебного препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта детей раннего возраста, повышения иммунного ответа организма при злокачественных и ряде вирусных (СПИД) заболеваний. Получение лактоферрина из молока крупного рогатого скота, вследствие его низкого содержания, приводит к высокой стоимости препарата. При введении кДНК гена лактоферрина в клетки табака получен ряд каллусных тканей, синтезирующих укороченный лактоферрин, антибактериальные свойства которого были значительно сильнее антибактериальных свойств нативного лактоферрина. Концентрация этого укороченного лактоферрина в клетках табака составляла 0,6-2,5%.

В геном растений встраиваются гены, продукты которых индуцируют у человека и животных иммунный ответ, например, на оболочечные белки возбудителей различных заболеваний, в частности, холеры, гепатита, диареи, а также на антигены плазматических мембран некоторых опухолей.

Создаются трансгенные растения, несущие гены, продуцирующие некоторые гормоны, необходимые для гормонотерапии людей и так далее.

Примером использования растений для создания вакцин являются работы, выполненные в Стенфордском университете. В работе были получены антитела к одной из форм рака с помощью модернизированного вируса табачной мозаики, в который был встроен гипервариабельный участок иммуноглобулина лимфомы. Растения, зараженные модернизированным вирусом, продуцировали антитела правильной конформации в достаточном для клинического применения количестве. 80% мышей, получавших антитела, пережили лимфому, в то время как все мыши, не получавшие вакцины, погибли. Предложенный метод позволяет быстро получать специфичные для пациента антитела в достаточном для клинического применения количестве.

Велики перспективы использования растений для производства антител. Кевин Узил с сотрудниками показал, что антитела, продуцируемые соей, эффективно защищали мышей от инфекции вирусом герпеса. В сравнении с антителами, продуцируемыми в культурах клеток млекопитающих, антитела, продуцируемые растениями, имели сходные физические свойства, оставались стабильными в человеческих клетках и не имели отличий в способности связывать и нейтрализовать вирус. Клинические испытания показали, что использование антител, продуцируемых табаком, эффективно препятствовало размножению мутантных стрептококков, вызывающих кариес.

Было проведено создание вакцины, продуцируемой картофелем, против инсулинозависимого диабета. В клубнях картофеля накапливался химерный белок, состоящий из субъединицы В токсина холеры и проинсулина. Наличие субъединицы В облегчает потребление данного продукта клетками, что делает вакцину в 100 раз более эффективной. Скармливание клубней с микрограммовыми количествами инсулина мышам, больным диабетом, позволяло затормозить прогрессирование болезни.

2. Моноклональные антитела

В основе технологии получения моноклональных антител лежат два метода: получение линий миеломных клеток и метод гибридизации соматических клеток, в том числе метод слияния миеломных и нормальных антителообразующих клеток. Это позволило получать гибридомы, которые наследуют от миеломных клеток способность к неограниченному росту, а от антителообразующих клеток -- секрецию специфических антител. Для слияния клеток используют раствор полиэтиленгликоля, гибридомы сначала выращивают в селективной среде, затем проводят клонирование гибридом, тестируя их на способность вырабатывать моноклональные антитела. Отобранный клон клеток выращивают в больших объемах, моноклональные антитела получают из надосадочной жидкости культуры гибридом in vitro или из экссудата сингенных мышей, которым предварительно была введена гибридома.

В силу гетерологичности мышиных моноклональных антител они редко используются для иммунотерапии заболеваний человека. К сожалению, пока не удается разработать технологию получения гибридом на основе клеток человека. Проблема решается с помощью метода «гуманизации» мышиных антител. Суть метода заключается в создании генетических структур, которые объединяют V-гены мышиных моноклональных антител с С-генами иммуноглобулина человека необходимого изотипа. В результате специфичность образующихся гибридных антител определяется генами мыши, а их антигенные свойства -- преимущественно генами человека. Более сложный, но радикальный способ заключается в объединении гипервариабельных частей У-генов мыши с человеческими С-генами и генами, кодирующими каркасную последовательность У-гена.

Моноклональные антитела широко используются в качестве инструмента для молекулярного анализа антигенного состава различных биологических субстанций и решения фундаментальных проблем иммунологии. Они применяются для диагностических целей, создания сложных диагностических систем. Методы «гуманизации» моноклональных антител открывают перспективу получения больших объемов моноклональных антител, которые могут использоваться для иммунотерапии самых разнообразных патологических состояний человека. В современном производстве имеются примеры, когда для синтеза моноклональных антител используют многотонные культиваторы, что позволяет получать килограммы моноклональных антител.

Можно получить моноклональные антитела всех основных классов с разнообразной специфичностью. Для усиления действия моноклональных антител используют смесь антител с разной специфичностью к одной и той же белковой молекуле. Это многократно усиливает действие антител. В области антиинфекционной иммунотерапии моноклональные антитела испытаны на людях при бактериемии и сепсисе, вызванном грамотрицательными бактериями. У нас в стране пока нет производства лечебных моноклональных антител. В России зарегистрированы препараты, применяемые для иммунотерапии онкологических заболеваний (США) и профилактики кризов отторжения пересаженных органов (Великобритания, Куба).

Одним из основных достижений биотехнологии в области медицины является создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов с использованием методов генной инженерии. Это в полной мере касается лекарственных средств, разработанных на основе генно-инженерных моноклональных антител (МкАТ). Создание лекарственных препаратов на основе антител (АТ), специфичных к определенным антигенам (АГ), является перспективным, поскольку иммунная защита организма во многом обусловлена его способностью синтезировать АТ в ответ на чужеродные АГ и удалять их из организма. Обычно Th2-зависимый иммунный ответ, при котором основным действующим началом, определяющим специфичность механизмов защиты, являются гуморальные АТ, развивается на микроорганизмы или их токсины при их внеклеточной локализации. При лечении патологии, вызываемой подобными инфекционными агентами, успешно используют препараты иммуноглобулинов, обогащенных специфическими АТ.

Препараты АТ, полученные при иммунизации животных, даже при использовании современных способов выделения и очистки имеют ограниченные возможности применения, поскольку содержат АТ различной специфичности, а также из-за большого числа побочных эффектов за счет гетерологичных белков.

Таблица 2. Препараты МкАТ, используемые при лечении онкологических заболеваний

Препараты иммуноглобулинов человека не являются чужеродными для человеческого организма. Их получают из смеси сывороток крови здоровых доноров (не менее чем от 5000 доноров), используя в производстве усовершенствованные технологии - частичное расщепление протеолитическими ферментами, восстановление и алкилирование, обработку сольвентдетергентами, хроматографическую очистку, фильтрацию, ультрафильтрацию и т.д. Использование современных высокоэффективных методов выделения и очистки позволяет снизить возможность развития побочных реакций на препараты иммуноглобулинов. Однако получение широкого спектра специфических АТ в препаратах иммуноглобулинов человека, а также получение достаточного количества АТ необходимой специфичности значительно ограничены, кроме того, не исключена возможность контаминации препаратов инфекционными агентами.

Разработка технологии получения МкАТ с использованием методов генной инженерии дает возможность реализации терапевтического потенциала лекарственных препаратов на основе АТ.

Препараты МкАТ, характеризующиеся высокой специфичностью, стандартностью и технологичностью получения, при определенных клинических показаниях часто способны успешно заменить иммунные сыворотки и препараты иммуноглобулинов.

Таблица 3. Препараты МкАТ, используемые при лечении аутоиммунных заболеваний

Источником получения МкАТ являются клонированные клетки или организм животного. АТ могут быть получены путем использования иммортализованных («бессмертных») В-лимфоцитов в перевиваемой культуре клеток, либо путем использования клеточных линий, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК.

МкАТ характеризуются постоянством физико-химических свойств, высокой специфичностью, направленностью к строго определенной детерминанте АГ, секретируются одним клоном антителообразующих клеток или клетками гибридом. Получение рекомбинантных препаратов значительно дешевле, чем получение препаратов из другого биологического сырья, они оказывают меньше побочных эффектов, их специфическая фармацевтическая активность выше, однако возможно формирование АТ против рекомбинантных иммуноглобулинов, имеющих антигенные характеристики мышиных АТ (HAMA-ответ, Human Anti-Mouse Antibody).

Для снижения чужеродности МкАТ используют молекулярно-генетическую технологию, которая позволяет приблизить структуру МкАТ к структуре иммуноглобулина человека. С помощью данной технологии создают генетические комплексы, в которых ген, кодирующий вариабельный домен иммуноглобулина мышиных МкАТ (V-ген), объединен с геном, кодирующим константный домен иммуноглобулина человека нужного изотипа (С-ген). При этом специфичность АТ определяется генами мыши, а их антигенная характеристика, в значительной степени, - генами человека. На основе данной технологии разработаны химерные и гуманизированные МкАТ [5].

Таблица 4. Препараты МкАТ, используемые в трансплантологии

В химерных МкАТ вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека замещены соответствующими доменами иммуноглобулина мыши или крысы, которые и определяют требуемую антигенную специфичность АТ.

В гуманизированных МкАТ участки, определяющие комплементарное связывание антигена (CDRs), т.е. три короткие гипервариабельные последовательности вариабельных доменов каждой цепи иммуноглобулина имеют мышиное (или другое) происхождение, они встроены в вариабельный домен иммуноглобулина человека. Гуманизированные МкАТ содержат минимум последовательностей грызунов.

Таблица 5. Препараты МкАТ, используемые при лечении инфекционных, аллергических и других заболеваний

Основные требования к производству и контролю, а также общие принципы проведения доклинических испытаний генно-инженерных лекарственных препаратов на основе МкАТ отражены в нашей ранее опубликованной работе.

В настоящее время лекарственные препараты МкАТ по объему производства занимают на мировом фармацевтическом рынке второе место после вакцин. 80% препаратов МкАТ используется в онкологии. Механизмы действия МкАТ на клетки-мишени очень многообразны, среди них -- включение каскада иммунных реакций, приводящих к гибели клеток злокачественных опухолей через иммуноопосредованную (антитело- и комплементзависимую) цитотоксичность, стимуляция фагоцитоза опухолевых клеток, индукция программы апоптоза клеток, блокада каскада сигнальной системы при взаимодействии с рецепторами фактора роста на опухолевых клетках и подавление процессов сигнальной трансдукции, подавление формирования новых сосудов в опухолевых образованиях и за счет этого ингибиция их роста, блокада рецепторов, а также подавление развития патологического процесса за счет связывания МкАТ с определенными детерминантами иммунокомпетентных клеток, провоспалительных цитокинов или их рецепторов.

Для лечения онкологических заболеваний используют два типа МкАТ - простые, неконъюгированные АТ т.е. не связанные с цитотоксическими веществами и конъюгированные - АТ, связанные с радиоактивными частицами, цитостатиками или токсинами (иммунотоксинами). АТ обеспечивают адресную доставку токсичного препарата к опухолевым клеткам, чем и обусловлен терапевтический эффект указанных АТ.

В Российской Федерации зарегистрировано более 15 зарубежных лекарственных препаратов на основе МкАТ, отечественных лекарственных препаратов МкАТ в настоящее время нет. Препараты МкАТ используются для лечения онкологических заболеваний, в трансплантологии для профилактики и подавления реакции отторжения, лечения аутоиммунных, аллергических, инфекционных, сердечно-сосудистых заболеваний.

В табл. 1 приведены сведения о препаратах, используемых в онкологической практике. Препараты «Мабтера (ритуксимаб)», «Кэмпас (алемтузумаб)» специфически взаимодействуют с рецепторами, экспрессированными на опухолевых клетках (CD20, CD52, соответственно), что обусловливает гибель клеток злокачественных опухолей, в основном, за счет иммуноопосредованной цитотоксичности, а также индукции апоптоза. Препараты «Герцептин (трастузумаб)», «Эрбитукс (цетуксимаб)», «Вектибикс (панитумумаб)» взаимодействуют с рецептором эпидермального фактора роста, что приводит к подавлению процессов пролиферации опухолевых клеток, их метастазирования, индукции механизма апоптоза клеток-мишеней. Препарат «Авастин (бевацизумаб)», взаимодействуя с фактором роста эндотелия сосудов, ингибирует рост опухолей за счет подавления формирования новых сосудов в опухолевых образованиях.

В табл. 2 приведены сведения о препаратах МкАТ, используемых для лечения больных с аутоиммунными заболеваниями. При данной патологии наблюдается активация иммунных механизмов при ответе на аутоантиген, обусловливая выработку антител или образование клеток-эффекторов с цитотоксической активностью, а также гиперпродукция провоспалительных цитокинов.

Препараты «Ремикейд (инфликсимаб)», «Хумира (адалимумаб)» и «Энбрел (этанерцепт)» подавляют развитие патологического процесса за счет ограничения проявлений биологического действия провоспалительного цитокина - ФНОб, путем связывания МкАТ с цитокином или его рецептором.

Препарат «Оренсия (абатасепт)» блокирует процесс костимуляции, препятствуя активации Т-лимфоцитов при их взаимодействии с антигенпрезентирующими клетками, что приводит к частичному ослаблению иммунного ответа на аутоантиген. В табл. 3 приведены сведения о препаратах МкАТ, используемых в трансплантологии для профилактики реакции отторжения.

Препараты «Симулект (базиликсимаб)» и «Зенапакс (дакликсимаб)» взаимодействуют с рецептором активированных клеток иммунной системы, в частности Т-лимфоцитов, что приводит к их элиминации и подавлению трансплантационной реакции.

В табл. 4 указаны препараты МкАТ, которые используются при лечении инфекционных, аллергических и других заболеваний. Так, препарат «Синагис (паливизумаб)» блокирует лигандопосредованное взаимодействие респираторного синтициального вируса с клеткой мишенью, тем самым подавляет возможность развития вирусной инфекции в организме.

Противопоказанием для применения всех лекарственных препаратов МкАТ является повышенная чувствительность к компонентам препарата, беременность, период грудного вскармливания. Для препаратов МкАТ, используемых для лечения аутоиммунных заболеваний, противопоказанием являются также тяжелые инфекционные процессы (сепсис, абсцесс, туберкулез, оппортунистическая инфекция). Для препарата «Кэмпас», используемого для лечения онкологических больных, - острый или обострение хронического системного инфекционного процесса, ВИЧ-инфекция. Для препарата «Луцентис», используемого при лечении неоваскулярной формы возрастной макулярной дегенерации, - подтвержденная или предполагаемая инфекция глаза или инфекционные процессы периокулярной локализации. Кроме того, в инструкциях по применению есть указание на возрастные ограничения использования отдельных препаратов МкАТ.

Таким образом, использование биотехнологических достижений в области создания лекарственных средств позволило разработать современные терапевтические препараты, воздействующие более направленно и эффективно, чем традиционные лекарственные препараты. Успешное применение в клинической практике в настоящее время находят препараты, созданные на основе генно-инженерных МкАТ. Терапия с помощью лекарственных препаратов на основе МкАТ высокоспецифична и эффективна, поскольку направлена на определенные патогенетически значимые механизмы развития заболеваний. Указанные препараты используются для лечения больных, страдающих заболеваниями с длительным прогрессирующим течением, таких как онкологические, аутоиммунные, инфекционные и аллергические заболевания, а также в трансплантологии для профилактики и лечения реакции отторжения после трансплантации органов и тканей.

Заключение

Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний внесла огромный вклад в рост благосостояние людей. Однако этот процесс нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания -- например, туберкулёз -- могут дать о себе знать, как только ослабнут профилактические меры или появятся лекарственно-устойчивые штаммы бактерий.

Традиционные антибиотики постепенно сходят с авансцены борьбы с некоторыми тяжёлыми недугами именно из-за возникновения резистентности к некогда считавшимся эффективными лекарствам. В настоящее время для терапии туберкулёза используются препараты второго поколения, но кто знает, когда и они потеряют свою силу?

Подобная проблема ещё острее стоит в онкологии. К сожалению, одна из главных причин неудач в терапии рака -- быстрое возникновение устойчивости опухолевых клеток к химиотерапии. Преодолеть эту смертельную для пациента защитную систему опухоли можно, создав лекарства, специфически воздействующие на определённые механизмы, работающие именно в раковых клетках.

Список литературы

1. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Волкова Р.А. и др. Требования к производству и контролю препаратов на основе моноклональных антител, применяемых для лечения // Биопрепараты. - 2010. -- № 4. - С. 11--14.

2. Белозеров А.П. Лекарственные препараты гуманизированных антител // «Провизор». - 2007. - вып. 20.

3. Глазко, В. И. Кризис аграрной цивилизации и генетически модифицированные организмы / В. И. Глазко. // PA NOVA. - 2006.

4. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб: ООО «Изд-во Фолиант». - 2008. - 552 с.

5. Лекарственные препараты на основе генно-инженерных моноклональных антител / Ж. И. Авдеева, Н. А. Алпатова, Р. А. Волкова, Л. К. Лаптева // Биопрепараты. - 2011. - № 2 (42).

6. Молекулярная биология клетки / Б. Албертс, Д. Брей, Дж. Льюс и др. - М., 1994.

7. Ярилин А.А. Иммунология. М.: Из-во «ГЭОТАР-Медиа». - 2010. -- 752 с.

8. Микробиология - в помощь микробиологу // Режим доступа: http://microbiologu.ru/

9. Микробиология // Режим доступа: http://microbiology.com.ua/

Размещено на Allbest.ru