Изучение бактериофагов

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия

Кафедра промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии

Бактериофаги

Выполнила:

Осав И.Ф.

Проверила:

Пономарева Е.И.

Пермь 2016

Бактериофаги

Бактериофаги (от бактерии и греч. phagos -- пожиратель; буквально -- пожиратели бактерий), фаги, бактериальные вирусы, вызывающие разрушение (лизис) бактерий и других микроорганизмов. Бактериофаги размножаются в клетках, лизируют их и переходят в др., как правило, молодые, растущие клетки. Впервые перевиваемый лизис бактерий (сибиреязвенной палочки) наблюдал в 1898 русский микробиолог Н. Ф. Гамалея. В 1915 английский учёный Ф. Туорт описал это же явление у гнойного стафилококка, а в 1917 французский учёный Ф. Д'Эрелль назвал литический агент, проходящий через бактериальные фильтры.

В зависимости от формы и структурной организации фаги подразделяют на несколько морфологических типов:

1. нитевидные;

2. мелкие кубические (некоторые из них имеют аналоги отростков), без отростка, с коротким отростком, с длинным отростком;

3. фаги сперматозоидной формы, т. е. с кубической головкой и хвостовым отростком, имеющие сокращающийся или не сокращающийся чехол отростка.

Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм (нитевидный тип).

Наиболее изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида и сокращающийся чехол отростка, например, колифаги Т2, Т4, Т6. Они состоят из головки икосаэдрического типа размером 65--100 нм и хвостового отростка длиной более 100 нм.

Хвостовой отросток имеет внутри полый цилиндрический стержень, сообщающийся с головкой, а снаружи -- чехол, способный к сокращению, наподобие мышцы. Чехол присоединен к воротничку, окружающему стержень около головки. На дистальном конце отростка имеется шестиугольная базальная ,пластинка с шипами, от которых отходят нитевидные структуры --фибриллы.

Бактериофаги содержат или ДНК, или РНК. Нуклеиновые кислоты фагов могут быть двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми. Большинство фагов содержит двунитевую ДНК, замкнутую в кольцо.

У фагов, имеющих форму сперматозоида, одна молекула двунитевой суперспирализованной ДНК находится внутри головки и защищена капсидом. Капсид состоит из белковых молекул -- идентичных полипептидных субъединиц, уложенных по икосаэдрическому (кубическому) типу симметрии. В состав головки также входит полипептид, состоящий из аспарагиновой, глутаминовой кислот и лизина. У некоторых фагов внутри головки находится внутренний гистоноподобный белок, обеспечивающий суперспирализацию ДНК. Сокращающийся чехол хвостового отростка образован также белковыми субъединицами, уложенными по спиральному типу симметрии, содержащими АТФ и ионы Са2+. У некоторых фагов (например, Т2) в дистальной части отростка содержится фермент лизоцим.

Антигенные свойства.

Бактериофаги содержат группоспецифические и типоспецифические антигены, обладают иммуногенными свойствами, вызывая синтез специфических антител в организме. Антитела, взаимодействуя с бактериофагами, могут нейтрализовать их литическую активность против бактерий. По типоспецифическим антигенам фаги делят на серотипы.

Резистентность.

По сравнению с вирусами человека бактериофаги более устойчивы к факторам окружающей среды. Инактивируются под действием температуры 65-70°С, УФ-облучения в высоких дозах, ионизирующей радиации, формалина и кислот. Длительно сохраняются при низкой температуре и высушивании.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой.

Бактериофаги инфицируют строго определенные бактерии, взаимодействуя со специфическими рецепторами клетки.

По специфичности взаимодействия различают следующие бактериофаги:

1. поливалентные, взаимодействующие с родственными видами бактерий;

2. моновалентные, взаимодействующие с бактериями определенного вида;

3. типовые, взаимодействующие с отдельными типами (вариантами) бактерий данного вида.

Взаимодействие фагов с бактериями может протекать, как и у других вирусов, по:

1. продуктивному,

2. абортивному

3. интегративному типам.

При продуктивном типе взаимодействия образуется фаговое потомство, бактерии лизируются; при абортивном типе-- фаговое потомство не образуется и бактерии сохраняют свою жизнедеятельность; при интегративном типе -- геном фага встраивается в хромосому бактерии и сосуществует с ней.

В зависимости от типа взаимодействия различают вирулентные и умеренные бактериофаги.

1. Вирулентные бактериофаги взаимодействуют с бактерией по продуктивному типу. Проникнув в бактерию, они репродуцируются с образованием 200--300 новых фаговых частиц и вызывают лизис бактерий.

Фаги, имеющие хвостовой отросток, прикрепляются к бактериальной клетке свободным концом отростка (фибриллами, базальной пластинкой). Проникновение фаговой нуклеиновой кислоты в бактерию наиболее изучено у бактериофагов, имеющих отросток с сокращающимся чехлом. В результате активации АТФ чехол хвостового отростка сокращается, и стержень с помощью лизоцима, растворяющего прилегающий фрагмент клеточной стенки, как бы просверливает оболочку клетки. При этом ДНК фага, содержащаяся в его головке, проходит в форме нити через канал хвостового стержня и инъецируется в клетку, а капсид фага остается снаружи бактерии.

Некоторые мелкие кубические фаги, способные адсорбироваться на половых пилях, вводят свою нуклеиновую кислоту через канал этих пилей. ДНК нитевидных фагов проходит в бактерию вместе с одним из капсидных белков.

2. Умеренные бактериофаги в отличие от вирулентных взаимодействуют с чувствительными бактериями либо по продуктивному, либо по интегративному типу. Продуктивный цикл умеренного фага идет в той же последовательности, что и у вирулентных фагов, и заканчивается лизисом клетки. При интегративном типе взаимодействия ДНК умеренного фага встраивается в хромосому бактерии, реплицируется синхронно с геномом размножающейся бактерии, не вызывая ее лизиса. ДНК бактериофага, встроенная в хромосому бактерии, называется профагом, а культура бактерий - лизогенной. Такое сосуществование бактерии и умеренного бактериофага называется лизогенией (от греч.lysis -- разложение, genea -- происхождение). Про фаг, ставший частью хромосомы бактерии, при ее размножении передается по наследству потомкам.\

Итак, при лизогении образование фагового потомства не происходит. В основе «сдерживающего» механизма репродукции фагов лежит образование в бактерии специфического репрессора -- низкомолекулярного белка, подавляющего транскрипцию фаговых генов. Биосинтез репрессора детерминируется генами профага. Наличием репрессора можно объяснить способность лизогенных бактерий приобретать иммунитет (невосприимчивость) к последующему заражению гомологичным или близкородственными фагами. Под иммунитетом в данном случае понимается такое состояние бактерии, при котором исключается процесс вегетативного размножения вышеуказанных фагов и лизис клетки. Однако термин «лизогения» отражает потенциальную возможность лизиса бактерии, содержащей профаг. Действительно, профаги некоторой части лизогенной культуры бактерий могут спонтанно (самопроизвольно) или направленно под действием ряда физических или химических факторов дерепрессироваться, исключаться из хромосомы, переходить в вегетативное состояние. Этот процесс заканчивается продукцией фагов и лизисом бактерий. Частота спонтанного лизиса бактерий в лизогенных культурах невелика (102, 106), т. е. не захватывает все клетки, обладающие иммунитетом. Частоту лизиса бактерий можно значительно увеличить, воздействуя на лизогенную культуру индуцирующими агентами (УФ-лучи, ионизирующее излучение, перекисные соединения, митомицин С и др.).

Жизненный цикл

Умеренные и вирулентные бактериофаги на начальных этапах взаимодействия с бактериальной клеткой имеют одинаковый цикл.

Ш Адсорбция бактериофага на фагоспецифических рецепторах клетки.

Ш Инъекция фаговой нуклеиновой кислоты в клетку хозяина.

Ш Совместная репликация фаговой и бактериальной нуклеиновой кислоты.

Ш Деление клетки.

Ш Далее бактериофаг может развиваться по двум моделям: лизогенный либо литический путь.

Ш Умеренные бактериофаги после деления клетки находятся в состоянии профага (Лизогенный путь).

Вирулентные бактериофаги развиваются по литической модели:

Нуклеиновая кислота фага направляет синтез ферментов фага, используя для этого белоксинтезирующий аппарат бактерии. Фаг тем или иным способом инактивирует ДНК и РНК хозяина, а ферменты фага совсем расщепляют её; РНК фага «подчиняет» себе клеточный аппарат синтеза белка.

Нуклеиновая кислота фага реплицируется, и направляет синтез новых белков оболочки. Образуются новые частицы фага в результате спонтанной самосборки белковой оболочки (капсид) вокруг фаговой нуклеиновой кислоты; под контролем РНК фага синтезируется лизоцим.

Лизис клетки: клетка лопается под воздействием лизоцима; высвобождается около 200--1000 новых фагов; фаги инфицируют другие бактерии. морфологический антигенный бактериофаг клетка

Технология приготовления бактериофагов

Технология приготовления бактериофагов, в основном, аналогична технологии приготовления вирусных препаратов, только вместо эукариотов используются бактериальные клетки, в которых бактериофаги размножаются.

Технологический процесс производства жидких бактериофагов состоит из следующих этапов: подбор штаммов для производства данного вида фага, получение маточных бактериофагов, приготовление серий жидкого бактериофага, контроль готового препарата на стерильность, безвредность и литическую активность, упаковка препарата.

Высокая специфичность некоторых штаммов бактериофагов позволяет использовать их для диагностики инфекционных заболеваний и индикации патогенных микроорганизмов. Фагоиндикация позволяет установить природу возбудителя инфекции даже в том случае, когда другие методы, в т.ч. и серологические, оказываются неэффективными.

В последние годы получение бактериофага широко используется как экспериментальная модель в молекулярной биологии, генной инженерии, биохимии и биофизике.

Контроль фаговых препаратов проводят на чистоту, активность и специфичность.

Стерильность бактериофагов проверяют высевом на питательные и культивируют в термостатах при 370С (для выявления бактериальной микрофлоры) и при 24 °С (для выявления грибковой флоры). Препарат считают годным, если через 8сут во всех средах не обнаруживают рост микроорганизмов. При выявлении роста бактерий или грибов хотя бы в одной пробирке проводят повторный контроль из удвоенного количества образцов. При повторном проросте сред препарат бракуют.

Активность и специфичность бактериофагов устанавливают на жидких и твердых питательных средах титрованием с соответствующим видом бактерий.

Если результаты проверки не соответствуют требованиям инструкций по изготовлению и контролю, то такой препарат не подлежит выпуску.

Бактериофаги выпускаются как в виде монопрепаратов (лизирующие стафилококки, сальмонеллы, стрептококки, эшерихии, клебсиеллы, протеи, псевдомонады и шигеллы), так и в виде комбинированных препаратов (пиобактериофаг, интести-бактериофаг, колипротейный бактериофаг).

Практическое применение фагов.

1. В медицине:

Одной из областей использования бактериофагов является антибактериальная терапия, альтернативная приёму антибиотиков. Например, применяются бактериофаги: стрептококковый,стафилококковый, клебсиеллёзный, дизентерийный поливалентный, пиобактериофаг, коли, протейный и колипротейный и другие.

Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция).

2. В биологии

Бактериофаги M13, фаг Т4, T7 и фаг л используют для изучения белок-белковых, белок-пептидных и ДНК-белковых взаимодействий методом фагового дисплея.

Поскольку размножение бактериофага возможно только в живых клетках, бактериофаги могут быть использованы для определения жизнеспособности бактерий. Данное направление имеет большие перспективы, поскольку, одним из основных вопросов при разных биотехнологических процессах является определение жизнеспособности используемых культур.

ПРЕИМУЩЕСТВА БАКТЕРИОФАГОВ ПЕРЕД АНТИБИОТИКАМИ:

· высокоэффективные биологические препараты антибактериального действия для профилактики и лечения острых кишечных инфекций и гнойно-воспалительных заболеваний, лечения дисбактериозов;

· при применении не нарушают нормального биоценоза человека (в отличии от антибиотиков, после которых всегда надо лечить дисбактериоз - Прим. автора);

· незаменимы при устойчивости возбудителей к антибиотикам;

· могут применяться в комплексной терапии с другими лекарственными средствами;

· необходимы при лечении дисбактериозов в комплексе с препаратами, нормализующими микрофлору кишечника;

· рекомендованы взрослым и детям;

· изготавливаются с применением природного сырья.

К преимуществам бактериофаговых препаратов относятся узкая специфичность действия, не вызывающая, в отличие от антибиотиков, угнетения нормальной микрофлоры. Доказано стимулирующее действие стафилококкового бактериофага на бифидобактерии -- важнейший компонент микробиоценоза кишечника. Использование бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний стимулирует факторы специфического и неспецифического иммунитета, что особенно эффективно для лечения хронических воспалительных заболеваний на фоне иммунодепрессивных состояний, бактерионосительства.

И антибиотики, и бактериофаги действуют непосредственно на микробы, только антибиотики губят не только патогенную, но и нормальную микрофлору, нарушая естественный баланс, в то время как бактериофаги действуют только на патогенные микроорганизмы. Встречая чувствительную микробную клетку , фаг проникает внутрь нее, переключает механизм ее действия на воспроизводство себе подобных, которые, разрывая оболочку клетки, в десятикратном количестве атакуют другие микробы. Лизис приобретает спонтанный характер, и освобождение от нежелательных микробов происходит в считанные часы. Следует упомянуть также комплексные препараты, представляющие собой набор фагов сразу к нескольким возбудителям: это пиобактериофаг для лечения гнойно-септических заболеваний и интестибактериофаг против кишечных инфекций.

Основными производителями бактериофагов у нас в стране являются НПО "Иммунопрепарат" (Уфа), предприятие по производству бактерийных препаратов (Нижний Новгород), МП "Биофон" (Саратов), НПО "Биомед" (Пермь).

Клиническая практика показала эффективность использования бактериофагов при инфекционных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, а также при воспалительных заболеваниях пазух носа, ротовой полости, верхних дыхательных путей, мочеполовой системы, холециститах и др., вызванных бактериями, чувствительными к фагу. Однако фаги, эти "природные санитары", могут быть использованы не только для лечения, но и для профилактики инфекционных заболеваний. Они не токсичны, не имеют противопоказаний к применению, могут быть использованы в сочетании с любыми другими лекарственными препаратами. Их можно назначать беременным, кормящим матерям и детям любого возраста, включая недоношенных.

Основным условием их успешного применения является проверка выделенной культуры на чувствительность к соответствующему фагу. Отмечена удивительная закономерность: в отличие от антибиотиков, чувствительность клинических штаммов микроорганизмов к бактериофагам стабильна и имеет тенденцию к росту, что можно объяснить обогащением лечебных препаратов новыми расами фагов.

Препараты бактериофага назначают внутрь при заболеваниях внутренних органов либо местно, непосредственно на очаг поражения. Действие фага проявляется уже через 2-4 часа после его введения (что особенно важно в условиях реанимации). Бактериофаги проникают в кровь, лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути. В 20-е годы фаги активно использовались при лечении различных заболеваний.

Перспективы применения

Для того чтобы успешно применять биопрепараты, необходимо определять чувствительность к ним бактерий. Однако ученые заметили интересную закономерность: чувствительность микроорганизмов к фагам не снижается, а наоборот, возрастает, что объясняют обогащением препаратов новыми культурами. На сегодняшний день бактериофаг стафилококковый успешно лизирует до 90% всех штаммов этих бактерий, выделяемых при гнойно-септических поражениях.

Многие инфекционисты полагают, что фаготерапия вскоре совершит революцию в борьбе с заболеваниями. Иммунологи видят перспективу использования этих средств там, где бессильны иммунопрепараты. Согласно данным аналитических исследований, в ближайшие несколько лет одним из самых перспективных направлений фармакологии станет производство фагов.

Препараты на основе бактериофагов выпускаются в виде:

§ аэрозолей,

§ свечей,

§ таблеток,

§ Растворов

§ Суппозитории,

§ Линименты

§ Мази,

§ Гель

Хранение фагов

Бактериофаги желательно хранить в условиях холодильника при +4є- 8єС. При длительном хранении препарата концентрация фага (титр фага) может существенно снижаться. Фаги хорошо сохраняются в запаянных ампулах и в лиофилизированном состоянии, но они легко разрушаются при кипячении, действии кислот, химических дезинфектантов, при УФ-облучении.

Литература

1. Fйlix d'Hйrelles (1917). «Sur un microbe invisible antagoniste des bacilles dysentйriques» (PDF). Comptes rendus Acad Sci Paris. 165: 373-5. Проверено 5 September 2010.

2. Ackermann H.-W. // Res. Microbiol., 2003. -- V. 154. -- P. 245--251

3. Hendrix R.W. // Theor. Popul. Biol., 2002. -- V. 61. -- P. 471--480

4. Suttle C.A. (September 2005), Vuiruses in the sea. Nature 437:356-361.

5. Шестаков С. В. Как происходит и чем лимитируется горизонтальный перенос генов у бактерий. Экологическая генетика 2007. -- Т. 5. -- № 2. -- C. 12-24.

6. Tettelin H., Masignani V., Cieslewicz M. J., Donati C., Medini D., Ward N. L., Angiuoli S. V., Crabtree J., Jones A. L., Durkin A. S., Deboy R. T., Davidsen T. M., Mora M., Scarselli M., Margarit y Ros I., Peterson J. D., Hauser C. R., Sundaram J. P., Nelson W. C., Madupu R., Brinkac L. M., Dodson R. J., Rosovitz M. J., Sullivan S. A., Daugherty S. C., Haft D. H., Selengut J., Gwinn M. L., Zhou L., Zafar N., Khouri H., Radune D., Dimitrov G., Watkins K., O'Connor K. J., Smith S., Utterback T. R., White O., Rubens C. E., Grandi G., Madoff L. C., Kasper D. L., Telford J. L.,. Wessels M. R, Rappuoli R., Fraser C. M. Genome analysis of multiple pathogenic isolates of Streptococcus agalactiae: implications for the microbial «pan-genome.» Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005. 102: 13950-13955

7. Guttman B., Raya R., Kutter E. Basic Phage Biology, in Bacteriophages: Biology and Applications, (Kutter E. and Sulakvelidze A., ed.), CRP Press, 2005 FL. -- P. 29-66.

8. Ковалёва Е. Н. Создание биопрепарата на основе выделенных и изученных бактериофагов Enterococcus faecalis: Дис. … канд. биол. наук. -- Саратов, 2009. -- 151 с.

9. Ackermann H.-W. // Res. Microbiol., 2003. -- V. 154. -- P. 245--251.

10. Ожерельева Н. Г. Краткая Медицинская Энциклопедия, М.: изд-во «Советская Энциклопедия», 1989. -- издание второе.

11. Бактериофаги // Большая советская энциклопедия : [в 30 т.] / гл. ред. А. М. Прохоров. -- 3-е изд. -- М. : Советская энциклопедия, 1969--1978.

12. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Edited by M.H.V. van Regenmontel et al. -- San Diego: Academic Press, 2000. -- P. 43-53, 64-129.

13. Mc Grath S and van Sinderen D (editors). Bacteriophage: Genetics and Molecular Biology. -- 1st. -- Caister Academic Press, 2007. -- ISBN [1]978-1-904455-14-1.

14. Raya R.R., Hйbert E.M. Isolation of phage via induction of lysogens. Bacteriophages: Methods and Protocols, Volume 1: Isolation, Characterization, and Interaction (Martha R.J. Clokie, Andrew M. Kropinski (eds.), 2009. -- V. 501. -- P. 23-32.

15. Микробиология: учеб. пособие / В. В. Лысак. -- Минск: БГУ, 2007. -- 430 с.

16. Адамс М. Бактериофаги / М. Адамс. -- М.: Медгиз, 1961. -- 521 с.

17. Гольдфарб Д. М., Бактериофагия / Д. М. Гольдфарб. -- М.: Медгиз, 1961. -- 299 с.

18. BBC Horizon: Phage - The Virus that Cures 1997-10-09

19. Parfitt T (2005). «Georgia: an unlikely stronghold for bacteriophage therapy». Lancet 365 (9478): 2166-7. DOI:10.1016/S0140-6736(05)66759-1. PMID 15986542.

20. Thiel, Karl (January 2004). «Old dogma, new tricks--21st Century phage therapy». Nature Biotechnology (Nature Publishing Group) 22 (1): 31-36. DOI:10.1038/nbt0104-31. PMID 14704699. Проверено 2007-12-15.

21. Aguita, Maria. Combatting Bacterial Infection, LabNews.co.uk. Проверено 5 мая 2009.

22. Pirisi A (2000). «Phage therapy--advantages over antibiotics?». Lancet 356 (9239): 1418. DOI:10.1016/S0140-6736(05)74059-9. PMID 11052592.

23. Все юные жители Крымска привиты от гепатита A | РИА ФедералПресс

24. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия / С. Н. Щелкунов. -- Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. -- 496 с.

25. Guliy O.I., Bunin V.D., O'Neil D., Ivnitski D., Ignatov O.V. A new electro-optical approach to rapid assay of cell viability // Biosensors and Bioelectronics. 2007. V. 23. P. 583--587.

Размещено на Allbest.ru