Микробиологическое производство лекарственных средств

Размещено на http://www.allbest.ru/

Микробиологическое производство лекарственных средств

На сегодняшний день клонировано более 400 генов различных белков человека, которые в прицепи могут стать лекарственными средствами. Большенство этих генов экспрессированы в клетках-хозяинах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека. Около 30 таких биологических препаратов получило одобрение в США. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12-14% в год.

Разработка новых методов профилактики лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX веке.

Интерфероны человека, полученные методом генной иннжерии

Первый ген интерферона был выделен в начале 80-х гг.С тех пор было обнаружено несколько разных интерферонов. Исходя из химических и биологических свойств они были разделены на три группы: ИФН, ИНФ и ИНФ. ИФН и ИНФ синтезируются клетками обработанными препаратами вирусов или вирусной РНК, а ИНФ вырабатываются в ответ на действие веществ, стимулирующих рост клеток. ИФН кодируется семейством генов, включающим как минимум 15 не аллельных генов, в то время как ИНФ и ИНФ кодируется одним геном каждый. Было предпринято несколько попыток создать ИФ с комбинированными свойствами, используя тот факт, что члены семейства ИФН различаются по степени и специфичности своей противовирусной активности. Теоретически это можно достичь, соединив части последовательностей генов различных ИФН. Это приводит к образованию гибридного белка с другими свойствами, чем у каждого из исходных белков. Такая генная конструкция была создана и введена в E.coli. Затем синтезированные белки очистили и исследовали их функции. Проверка защитных свойств гибридных свойств ИФН на культуре клеток млекопитающих показала, что некоторые из них проявляют большую противовирусную (за счет активации латентной эндорибонуклеазы, разрушающей вирусную мРНК), другие большую антипролиферативную активность в культурах различных раковых клеток, чем родительские молекулы.

Гормрн роста человека, полученный методом генной инженерии

Стратегию конструирования новых белков путем замены функциональных доменов или с помощью направленного мутагенеза можно использовать для усиления или ослабления биологического действия белка. Например нативный гормон роста человека (ГРЧ) связывается в различных типах клеток как с рецептором гормона роста человека, так и пролактиновым рецептором. Чтобы избежать нежелательных побочных эффектов в процессе лечения, нужно исключить присоединения ГРЧ к пролактиновому рецептору. Поскольку участок молекулы гормона роста лишь частично совпадает, по своей аминокислотной последовательности, с подобным участком пролактинового гормона. При помощи направленного мутагенеза, удалось изменить аминокислотную похожую последовательность ГРЧ, что снизело его сродство к пролактиновому рецептору. Полученные результаты представляют несомненный интерес, но смогут ли модифицированные ГРЧ найти применение в клинике, пока не ясно.

Ферменты

Наиболее частым летальным наследственным заболеванием среди европейцев является муковисцедоз. В США выявлено 30 000 случаев этого заболевания, в Канаде и странах Европы - 23 000. пациенты с муковисцедозом часто страдают инфекционными заболеваниями, поражающими легкие. Лечение антибиотиками приводик к образованию резистентных штаммов патогенных бактерий. Бактерии и продукты их лизиса вызывают накопления в легких вязкой слизи, затрудняющий дыхание. Одним из компонентов слизи является высокомолекулярная ДНК, которая высвобождается из бактериальных клеток. Ученым из Genetech (США) удалось выделить и экспрессировать ДНК фермента ДНКазы, способной расшиплять высокомолекулярную ДНК. Очищенный фермент предложено было вводить в виде аэрозоля, что облегчает дыхании. Хотя это не излечивает муковисцедоз, зато облегчает его состояние. Применение этого препарата было недавно разрешено к применению в США, и объем его продаж составил в 2000 г. примерно 100 млн. дол.

Альгинат-лиаза.

Это еще один препарат рекомендованный при лечении муковисцедоза.

Альгинат - это полисахарид, синтезируемый рядом морских водорослей, а также почвенными и морскими бактериями. Альгинат, содержащий сшивки (полемерезованный) образует эластичный гель, вязкость которого прямо пропорциональна размеру полисахаридных молекул. Выделение альгината слизистыми штаммами Pseudomonas aeruginosa существенно повышает вязкость слизи у больных муковисцедозом. Что бы очистить дыхательные пути и облегчить состояния больных, в дополнение к обработке ДНКазой следует провести деполимеризацию альгината с помощью альгинат-лиаза.

Ген этого фермента был выделен из грамотрицательной почвенной бактерии(Flavobacterium sp.) и клонирован в E.coli. Для того чтобы определить, целесообразно ли проводить клиническое тестирование, нужны дополнительные исследования.

Весьма привлекательным выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» - чужеродный антиген, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку - мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко употреблялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологий рекомбинантых ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению спецефических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.

Во-первых, это связано с возможностями диагностики различных заболеваний.

Например всем хорошо известный ИФА, основанный на известной иммунологической реакции Аг-Ат, где определенный вид антител с высоким сродством распознает определенный участок (эпитоп, антигенную детерминанту) молекулы антигена. Поскольку в молекуле антигена обычно присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками иммунной системы. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называется поликлональными.

Для практического применения антител в качестве диагностического инструмента или компонентов терапевтических средств необходимо было создать такую линию клеток, которая росла бы в культуре и продуцировала антитела одного типа, обладающих высоким сродством к специфическому антигену-мишени, моноклинальные антитела. К сожалению, В-лимфоциты, синтезирующие антитела, не могут воспроизводиться в культуре. Решение данной проблемы виделось в создание гибридной клетки. Получив генетическую составляющую от В-клетки, она могла бы вырабатывать антитела, а приобретая способность к делению от клетки совместимого типа - расти в культуре. Было известно, что В-лимфоциты иногда перерождаются и становятся раковыми (миеломными) клетками, приобретая способность расти в культуре и сохраняя в тоже время многие свойства В-клеток. Так клетки миелромы, в первую очередь те которые не вырабатывают антитела, стали кандидатами на слияние с антителопродуцирующими В-клетками. В середине 70-х г.г. эти идеи стали реальностью.

Схема получения гибридных клеток выглядит просто: иммунизируют животное (чаще мышь) Если развился иммунный ответ, то животное умерщвляется извлекают селезенку промывают ее и измельчают для получения В-клеток взвесь клеток селезенки смешивают с клетками миеломы, дефектных по определенному ферменту (гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе) Кобенированную взвесь инкубируют в 35% полиэтпленгликоле несколько минут (это облегчает слияние клеток, хотя оно проходит случайным образом) переносят взвесь на селективную среду, содержащую субстрат для дефектного фермента (гипоксантин, амидоптерин и тимидин ГАТ, дефектные миелома-миеломные клетки не способны использовать гипоксантин в качестве в качестве предшественника в процессе биосинтеза пуриновых оснований гуанина и аденина, без которых не возможен синтез нуклеиновых кислот, В-клетки, сами по себе не жизнеспособны в культуре) наращивание массы гибридных клеток иммунологический скрининг отбирают необходимые клоны. Каждый клон, продуцирующий моноклональное антитело, можно поддерживать в культуре практически бесконечно. Кроме того, образцы можно заморозить в жидком азоте и использовать их в дальнейшем как источник клеток. Альтернативой такому способу получению может быть отбор и производство моноклональных антител и их частей (Fv-фрагментов), направленных против антигена-мишени, с помощью E.coli.

Примерно 100 лет назад была предпринета попытка лечения детей, больных дифтерией, с помощью не очищенной антисыворотки, полученных от лошадей, которых инфицировали Corynebacterium diphtheriae, вызывающей дифтерию у человека. Возбудитель дифтерии, инфецируя горло и миндалины выделяет эгзотоксин, поражающий органы,удаленные от места инфицирования. Однако, если больному в первые несколько дней после начала инфекции ввести лошадиную антисыворотку к этому эгзотоксину, то у него возникает пассивный иммунитет, позволяющий избежать летального исхода. К сожелению, риск, связанный с использованием чужеродных антител, не позволил широко применять этот метод терапии. С развитием гибридомной технологии вновь возникла надежда на то, что антитела можно будет использовать в качестве терапевтических средств для поддержания постоянного уровня чистых моноспецифичных антителв организме, однако остается ряд не решенных проблем на сегодняшний день: появления перекрестных реакций на вводимые мышиные антитела с развитием аутоиммунных реакций и анафилаксии.

Антитела как лекарственные средства

Профилактика отторжения трансплантированных органов

В 1970-х гг. первыми веществами, рекомендованными Департаментом по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств (США) для использования в качестве иммуносупрессоров при пересадке органов у человека, были моноклональные антитела мыши ОКТ3. ОКТ3 связываются с рецептором на поверхности любой Т-клетки, которая имеет фенотип CD3. Это предупреждает развитие полного иммунного ответа и отторжение трансплантированного органа. Подобная иммуносупрессия весьма эффективна, хотя и имеет множество побочных явлений. Далее такой подход к терапии получил широчайшее распространение.

Лекарственные вещества, связанные с моноклональными антителами

Лекарственные вещества, проявляющие высокую активность при тестировании in vitro (обычно в культуре клеток), за частую оказываются значительно менее эффеткивными in vivo. Кажущееся снижение их активности объясняется тем, что они не достигают органа или клетки мишени в нужной концентрации. Увеличение дозы принимаемого препарата не решает проблемы, поскольку при этом возникают побочные эффекты. Более того, чтобы избежать таких эффектов иногда такие вещества вводят в заведомо низких концентрациях. Для решения этой задачи разработано несколько подходов (часть из них обсуждена выше : липосомы, тропные оболочки, терапия in vitro и in vivo). Не вольно возникает идея, а не использовать ли в качестве доставщика лекарственного препарата, а лучше его неактивной формы (пролекарства), высоко специфическое моноклональное антитело?

Для эффективной работы последней системы разработана следующая схема: моноклональное антитело, связывается с переводящим лекарственное вещество в активную форму (необходимо, чтобы оно было очищено и имелось в нужном количестве), а антитело должно доставлять эту систему точно по «адресу».В этом случае мишенью становятся строго определенные клетки, а лекарственные вещество используется в гораздо низких дозах. Однако применение мышиных антител способно вызывать иммунный ответ, поэтому очень важно использовать фрагменты антител человека или антитела, максимально схожие с ними по структуре.

Наиболее частой причиной смертности в странах Северной Америки и Европы является тромбоэмболия мозговых и сердечных артерий. Тромб состоит из молекул фибрина (фактора свертывающей системы крови, образузующего сеть в ответ на повреждение сосудистой стенки). В норме молекулы фибрина в образовавшемся тромбе расщепляются с помощью плазмина (сериновой протеиназы), которая образуется из плазминогена под действием активатора. Однако нередко эта биологическая система работает недостаточно эффективно, что приводит к закупорке артерий. В этих случаях обычно назначают активатор плазмина, однако плазмин способен разрушать и предшественник фибрина фибриноген, что в свою очередь может приводить к обширным внутренним кровотечениям. Для этого был разработан терапевтический препарат, на основе моноклонального атитела и активатора плазминогена. Испытание на модельных системах показали, что комплекс присоединялся к сгусткам крови и лизировал их, не вызывая значительного разрушения фибриногена. Были созданы и другие подобные системы.

Моноклональные антитела человека

Несмотря на кажущуюся перспективность иммунотерапии, этот метод имеет и ряд ограничений, связанных с применением моноклональных антител животных и процедурой присоединением к ним нужных химических молекул. Сам процесс химического переноса весьма не эффективный, присоединение происходит случайным образом, а кроме того, может снижаться ферментативная активность некоторых веществ. При многократном введении препарата необходимо использовать антитела человека, а не животных, что бы прекратить развитие перекрестных реакций и сенсибилизации организма.

Создание специфических человека антител, представляет собой трудную задачу:

Хромосомы человека в клетках, полученных слиянием лимфоцитов человека с клетками мыши, нестабильны, поэтому трудно получить клетки, способные вырабатывать моноклональные антитела человека.

Пока не удалось получить эффективные клеточные линии миеломы человека, которые могли бы заменить мышиные.

Иммунизация человека различными антигенами не проводиться по соображениям этического характера.

Существуют попытки введения иммунных клеток человека мутантным мышам, которые практически лишены собственной иммунной системы. После трансплантации иммунных стволовых клеток человека таким мышам, страдающих тяжелым сочетанным иммунодефецитом (scid-мыши), они приобретают клетки иммунной системы человека и в ответ на введения антигена могут вырабатывать антитела.

Предпринимаются попытки вести зародышам мышей гены иммуноглобулинов человека. Недавно появилось сообщение о том, что уже появилась трансгенная мышь, экспрессирующая нативные формы Н- и L- цепей иммуноглобулинов человека.

Трансплантация стволовых клеток иммунной системы человека scid-мышам и получение трансгенных мышей весьма трудоемкие способы производства моноклональных атител человека. Поэтомы ученые пытаются создать генноинженерные методы получения антител человека, которые можно использовать в качестве терапевтических средств, и эффективных бифункциональных белков, способных связываться с мишенью и разрушать ее.

Структура антител

Н- и L- цепи состоят из вариабельных (V_H и V_L) и константных (C_L, C_H1, C_H2 и C_H3) доменов. Вареабельные домены содержат CDR-участки (от англ.complementartly-determining regions): CDR1, CDR2, CDR3.

Антигенсвязывающие сайты состоят из трех участков, определяющих комплементарность антител к антигену CDR и образующих вариабельные (V_H и V_L) области на N конце H- и L-цепей. Для CDR характерна очень высокая изменчивость последовательности аминокислот, по этому их еще называют гипервариабельными.

Тот факт, что разные участки молекулы иммуноглобулина выполняют разные функции, позволяет модифицировать моноклональное антителомыши таким образом, что оно приобретает некоторые сегменты антитела человека, сохраняя в то же время свою исходную антигенсвязывающую специфичность.

Первым участком, который был изменен был Fc-фрагмент. Выбор объясняется тем, что Fc-фрагмент мыши не недостаточно хорошо выполнял роль эффектора иммунного ответа. Далее провели замену Fv-облости H- и L-цепей иммуноглобулина человека, на анологичные фрагменты специфического моноклонального антитела мыши. Продуктом рекомбинантных генов является химерный иммуноглобулин, обладающий антигенсвязывающей спецефичностью моноклонального антитела мыши, эффекторными свойствами Fc-фрагмента человека и пониженной иммуногенностью для человека.

Химерные антитела, несущие Fv-облости фрагменты мыши к поверхностному антигену клеток рака толстой кишки человека, тестировали на больных с раком толстой кишки и прямой кишки. Антитела оставались в крови пациентов в шесть раз дольше обычных антител мыши, тем самым самым оказывая свое действие в течение большего времени. При этом лишь одного из 10 пациента наблюдался слабый иммунный ответ.

Другой подход состоит в замещении только CDR-участка человеческих антител фрагментами моноклональных антител грызунов. Продуктом этого рекомбинантного гена являетсяиммуноглобулин с антигенсвязывающей специфичностью моноклонального антитела мыши и остальными свойствами антитела человека. интерферон антитело иммунодефицит вирус

Созданные генноинженерным путем иммуноглобулины как правило, клонируются в E.coli или клетки млекопитающих, в которых и вырабатываются антитела.

К настоящему времени этим методом получено более 50 различных моноклональныхантител, обладающих сходством с антителами человека. К сожалению, данная технология являясь весьма эффективной и универсальной довольно дорогостоящая и требует больших затрат времени.

Другим оригинальным подходам является создание одноцепочечных антител. Одноцепочечные антитела могут найти широкое применение в клинике в тех случаях, когда проявление Fc-эффекторных функций не является необходимым, а малый размер молекулы (мол. масса 27 кДа, а иммуноглобулина G- 150 кДа) дает определенные преимущества. Кроме того, к одноцепочечному антителу можно присоединить тот или иной белок, получив бифункциональную молекулу, которая может связываться с определенной мишенью, проявляя при этом спецефическуб активность. Был прговеден также еще один эксперимент: вместо то, чтобы соединять V_H и V_L - цепи коротким пептидом, аминокислотный каркас изменили таким образом , что бы между ними образовывался дисульфидный мостик. Обнаружилось, что стабилизированные дисульфидной связью и одноцепочечного Fv-иммунотоксины (токсин разрушает раковые клетки) обладают одинаковой активностью и специфичностью, но первый на много стабильнее.

Лекарственные средства против ВИЧ

Ученым пока не удалось получить вакцину, достаточно эффективную против вируса иммунодифецита (ВИЧ), который вызывает развитие синдрома приобретенного иммунодифецита (СПИД). Параллельно с созданием такой вакцины идет поиск других средств, позволяющих замедлить патологический процесс.

ВИЧ поражает один из видов лимфоцитов, а именно Т-Хелперы. Внорме эти клетки являются ключевыми регуляторами всего иммунного ответа. При ВИЧ-инфекции они перестают функционировать. Основным следствием ВИЧ-инфекции является неспособность иммунной системы организма обеспечивать его защиту от обычных бактериальных и вирусных инфекций, которые в конце концов приводят к гибели больного, несмотря на лечение антибиотиками и другими средствами. На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между гликопротеином с мол. массой 120 кДа (gp120) и рецептором на поверхности Т-Хелпера CD4. Далее вирус проживает обычный цикл, характерный для любого вируса. Особенностью является лишь то, что пораженные клетки способны экспрессировать gp120 белок и образовывать на своей поверхности, образуя синцитий из клеток имеющих на своей поверхности CD4. Одним из вариантов лечения предлагалось использовать антитела к CD4, и даже такой подход показал неплохие результаты в системе in vitro, но он не приводит к уничтожению вируса. Другой вариант решения этой проблемы обеспечивает как защиту Т_н-клеток, так и инактивацию вируса, заключается в создании химерного белка, состоящего из фрагмента молекулы CD4 и Fc-фрагмента иммуноглобулина (такой белок был назван CD4-иммунноадгезином). CD4 компонент обеспечивает связывание с gp 120, а иммуноглобулиновый компонент разрушение молекулы вируса или пораженной клетки, запуская реакцию опосредованной антителами цитотоксичности.

Еще одним оригинальным подходом к решению поставленной задачи является создание другого химерного белка несущего CD4 и экзотоксин Pseoudomonos. На поверхности всех ВИЧ пораженных клеток находиться гликопротеид gp 120, поэтому химерный белок присоединяется именно к ним, а не кдругим клеткам. Химерный белок проникает внутрь клетки при участие одного из доменов экзотоксина, а затем экзотокстн сам инактевирует фактор элонгации EF-2, участвующий в синтезе белка. Это препятствует дальнейшему синтезу белка и приводит к гибели клетуи. Т.О. CD4-домен «помечает» пораженную клетку, а экзотоксин выступает в роли «наемного убийцы». Эта химерная система уже прошла проверку в контрольной клеточной культуре, правда существует опасность возникновения иммунного ответа против экзотоксина Pseoudomonos.

Подобные иммунпрепараты обладают достаточно высокой эффективностью, что позволяет применять их в низких дозах и свести к минимуму побочное действие на иммунную систему. Кроме того, они могут оказаться полезными для лечения различных новообразований, а иногда и заменять химеотерапию. На пораженные клетки можно нацелить и другие цитотоксические белки, например дефтерийный токсин или растительный токсин рицин. Впрочем, терапевтическое применение рекомбинантных экзотоксинов дело будущего.

Вакцины

Вакцинация способствует формированию у реципиента иммунитета к патогенным микроорганизмам и тем самым защищает его от инфекции. В ответ на пероральное или парентеральное введение вакцины в организм вакцины в организме хозяина вырабатываются антитела к патогенному микроорганизму, которые при последующей инфекции приводят к его инактивации (нейтрализации или гибели), блокируют его пролифирацию и не позволяют развиться заболеванию.

Эффект вакцинации открыл более 200 лет назад - в 1796 г. - врач Эдвард Дженнер, в известном эксперименте с заражением 8-летнего мальчика (Джеймс Филипс) коровьей оспой. Сегодня во всем мире более 2 млрд. людей страдают заболеваниями, которые можно было бы предотвратить с помощью вакцинации. Вакцины могут оказаться полезными и для профилактики постоянно появляющихся новых болезней (например СПИДа). Традиционные вакцины содержат инактивированные или аттенуированные патогенные микроорганизмы. Эти вакцины имеют ряд недостатков: не все патогенные микроорганизмы можно вырастить в необходимых для производства вакцин количествах; работа с большим количеством патогенных микроорганизмов требует соблюдения строжайших мер предосторожности; аттенуированные штаммы нередко ревертируют и становятся вирулентными; инактивация часто бывает неполная; срок годности вакцины во многом зависит от условий ее хранения.

Технология рекомбинантных ДНК позволяет создавать надежные вакцины, используя при этом различные подходы. Делетируя гены, ответственные за вирулентность, получают живые вакцины, содержащие непатогенные, иммунологически активные штаммы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными. Клонированные гены, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных организмов, встраивают в геном непатогенного носителя (обычно вируса) и получают безопасную, не содержащую болезнетворных микроорганизмов вакцину. Наконец гены или их сегменты, кодирующие основные антигенные детерминанты патогенных микроорганизмов, встраивают в эспрессирующие векторы, получают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Последний подход позволяет производить субьединичные и пептидные вакцины (если используются полноразмерные гены в первом случае и фрагменты генов, кодирующих домены основных антигенных детерминант - во втором). Пептидные вакцины получают и с помощью химического синтеза.

Субъединичные вакцины

Субъединичные вакцины имеют свои достоинства и недостатки. Достоинства состоят в том, что препарат, содержащий очищенный иммуногенный белок, стабилен и безопасен, его химические свойства известны, в нем отсутствуют дополнительные белки и нуклеиновые кислоты, которые могли бы вызвать нежелательные побочные эффекты в организме-хозяина. Недостатки заключаются в дорогой стоимости производства, а комформация выделенного белка может отличаться от той, которую он имеет in situ, что может приводить к изменению его антигенных свойств.

Противогерпетическая вакцина

Вирус простого герписа вызывает (HSV, herpes simplex virus) вызывает инфекционные заболевания генерализованного или местного характера (тяжелые поражения глаз, энцефалит, урогенетальные инфекции и т.д.). Кроме того, он является онкогенным, поэтому вакцинация убитыми или аттенуированным вирусом сопряжена с определенным риском развития рака.

Известно, что выработку антител против HSV индуцирует компонент оболочки мембраны вируса гликопротеин D (gD). Полноразмерный гликопротенин трудно очистить, т.к. он трудно растворим. Поэтому ген gD модифицировали, удалив ту часть, которая кодирует С-концевой трансмембранный домен. Белок стал более растворим в воде и не мог уже встраиваться в клеточную мембрану. Лабораторные испытания показали, что антитела, вырабатываемые в ответ на введение модифицированного белка gD, эффективны в отношении HSV-1, HSV-2.

Противоящурные вакцины

Вирус ящура вызывает массовую гибель КРС, для защиты от этого заболевания используются вакцины, содержащие вирус, инактивированный формалином. В мире ежегодно производиться примерно 1 млрд. доз этой вакцины. Но уже создана субъединичная вакцина на подобие противогерпетической, что предполагает боле широкую ее доступность и удешевление.

Противотуберкулезная вакцина

Разговор об актуальности лечения туберкулеза я опускаю. В настоящее время в ряде стран в качестве противотуберкулезной вакцины используется один из штаммов Mycobacterium bovis, бациллу Кальмена-Герена (BCG). Однако эффективность такого подхода вызывает сомнение по двум причинам: 1) живые BCG клетки вызывают серьезное заболевания у лиц со сниженным иммунитетом.2) лица, которым ввели BCG-вакцину зачастую дают ложноположительный результат, что не позволяет отличить их от больных. По этим причинам в США BCG запрещено к применению и развернута масштабная программа по созданию субъединичной вакцины (уже исследованы порядко100 белков M. tuberculosis и их комбинаций)

Пептидные вакцины

Здесь главная идея: заключается в том, чтобы использовать небольшой участок белковой молекулы (домен), имитирующие эпитопы (антигенные детерминанты).

По этому принципу уже создана противоящурная вакцина, где носителем эпитопов является белок оболочки вируса гепатита В. В будущем синтетические пептидные вакцины могут стать высокоэффективной, относительно не дорогой, безопасной и эффективной альтернативой традиционным вакцинам (хотя для этого необходимо провести еще не мало исследований).

Генная иммунизация

Новый подход, позволяющим индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животного-мишени гена, кодирующего белок-антиген. Генную иммунизацию пока используют для выработки иммунитета к некоторым патогенным микроорганизмам (вирусу А, вирусу иммунодефецита человека типа1, вирусу бычьего герпеса, вируса бешенства, Plasmodium sp. , вызывающего малярию, вирусу гепатита В) у животных, но не человека. Хотя полученные результаты сильно обнадеживают ученых. Способы доставки генетического материала обсуждены нами в предыдущей лекции. (Существует оригинальный способ с использованием патогенного микроорганизма Shigella flexneri, используется не патогенный штамм. Эта бактерия попадает в клетки эпителия путем фагоцитоза, и присутствующая в ней плазмидная ДНК попадает в цитоплазму клетки-хозяина - это бактериальный способ доставки гена. Для вирусной доставки применяется широко используется, хорошо изученный вирус корьевой оспы.)

Аттенуированные вакцины

Живые вакцины, как правило, гораздо более эффективны, чем не живые или субъединичные. Основное требование к ним - отсутствие вирулентных форм микроорганизмов в вводимом материале (инокуляционном). Это требование учитывалось при создание живой противохолерной вакцины.

Бактерия (Vibrio cholerae) размножается в тонком кишечнике и выделяет в большом количестве энтеротоксин, который и ответствен за патогенный эффект. Энтероксин - это гексомерный белок: он состоит из одной субъединицы А, стимулирующей аденилатциклазу, и пяти субъединиц В, которые спецефически связываются с клеточным рецептором слизистой кишечника. Субъединица А имеет два функциональных домена: А1-обладает токсической активностью, и А2 - связывает субъединицы В. Современные противохолерные вакцины, содержащие убитые фенолом холерные вибрионы, обеспечивают частичную защиту от инфекции в течении 3 - 6 месяцев. Субъеденичные вакцины, содержащие инактивированный холерный энтеротоксин, не дали хороших результатов.

Была предпринята успешная попытка создания штамма холеры с деллецией в гене, кодирующим А1-пептид, при этом вибрион не синтезировал активный энтеротоксин, но сохранял все остальные биохимические свойства патогенной формы V. cholerae. Проводимые в настоящие время клинические испытания эффективности этой формы как противохолерной вакцины пока не дали однозначного результата. Вакцина обеспечивает почти 90%-ную защиту от холер, но у некоторых испытуемых наблюдаются побочные эффекты.

Другой способ получения непатогенных штаммов удаление хромосомных областей, отвечающих за независимые жизненоважные функции. При этом лучше делетировать две таких области, что бы не происходило их спонтанного восстановления. Так, например, была создана противосальмонеллезная вакцина, где были делетированы гена ответственные за биосинтез ароматических соединений и метаболизм пуринов. Такие штаммы вызывают легкую форму инфекции и обладают в 10⁶ раз меньшей вируленностью. На их основе уже созданы эффективные пероральные вакцины для мышей, овец, КРС, цыплят, а совсем недавно и для человека.

По такому же принципу создана противолейшманиозная вакцина человека, проходящая испытания на животных.

Технология рекомбинантных ДНК открывает широкие возможности по созданию вакцин. Преимущество отдается тем вакцинам, введение которых не будет связано с введением через вену или под кожу. Создаются так называемые «слизистые» вакцины (вакцины, компоненты которых связываются с рецепторами, расположенными в легких или желудочно-кишечном тракте) пригодные для профилактике самых различных заболеваний: холеры, брюшного тифа, гриппа, пневмонии, мононуклеоза, бешенства, СПИДа, болезни Лайма. По всей видимости, у вакцинации большое будущее в плане профилактики заболеваний, т.к. лечение многих инфекционных заболеваний уже затруднено появлением различных антибиотико-устойчивых штаммов бактерий.

Размещено на Allbest.ru