Современные методы анализа кумаринов и кумаринсодержащего лекарственного растительного сырья

Размещено на http://www.allbest.ru/

ГБОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Фармацевтический факультет

Кафедра фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии

Курсовая работа на тему

«Современные методы анализа кумаринов и кумаринсодержащего лекарственного растительного сырья»

Уфа 2015

Введение

Актуальность: В последние годы широкое применение в различных областях биотехнологии, медицины, пищевой и косметической промышленности находят биологически активные соединения. Среди них - природные кумарины, обладающие широким спектром лекарственной активности: антиоксидантной, противовирусной, антиканцерогенной, антикоагулянтной. В связи с этим поиск простых и универсальных методов анализа кумаринов различного функционального окружения является актуальной проблемой. Цели: Изучение статей, научных работ, посвященных методам анализа кумаринов. Определение наиболее современных методов анализа и их преимуществ. Задачи: изучить и проанализировать современные методы анализа кумаринов.

Общая характеристика кумаринов

Кумарины - природные фенольные гетероциклические соединения производные цис-ортооксикоричной кислоты, в основе строения которых лежит 9,10-бензо-?-пирон (ненасыщенный ароматический лактон цис-ортооксикоричной кислоты).

Физико-химические свойства кумаринов

Кумарины - обычно кристаллические вещества, бесцветные или слабо окрашенные в желтый цвет. Простые кумарины, гидрокси- и метоксикумарины и их гликозиды хорошо растворяются в воде и разведенных спиртах. Остальные кумарины практически нерастворимы в воде, но хорошо растворяются в органических растворителях: хлороформе, диэтиловом эфире, этиловом спирте, кроме того, растворяются в жирных маслах.Все природные кумарины легко возгоняются при нагревании до 1000 С.Кумарины способны флюоресцировать в УФ-свете ярко-синим, ярко-голубым, фиолетовым, зеленоватым или желтым светом. В присутствии щелочей флюоресценция усиливается.Химические свойства кумаринов обусловлены наличием в структуре бензольного и лактонного ядра. Лактонное кольцо отличается большой устойчивостью, не расщепляется при нагревании в воде, не взаимодействует с аммиаком и кислотами и раскрывается лишь при нагревании с едкими щелочами. При этом образуются соли цис-орто-кумаровой кислоты (кумаринаты) и появляется желтое окрашивание. При подкислении раствора a-пироновое кольцо замыкается и кумарины регенерируются в неизменном виде (окраска исчезает).Кумарины способны к азосочетанию при взаимодействии с солью диазония в щелочной среде. Реакции со щелочами и азосочетания используют для обнаружения кумаринов в растительном сырье.

Распространение

Производные кумарина широко распространены в растительном мире. Они найдены у представителей 34 семейств. Наиболее часто встречаются в семействах Apiaceae, Rutaceae, Fabaceae, Hippocastanaceae, Solanaceae. В семействе астровых в основном преобладают оксикумарины. Фуранокумарины найдены в растениях 5 семейств. Пиранокумарины характерны для видов сем. Apiaceae.Обычно кумарины встречаются в свободном состоянии, но могут быть и в форме гликозидов. Локализуются они в различных органах растений, но чаще и в больших количествах накапливаются в подземных органах, в коре и плодах. Например, в плодах зонтичных кумарины локализуются в эфирномасличных канальцах вместе с эфирным маслом. Содержание их колеблется от 0,2 до 10%.

Применение

Многие природные кумарины являются биологически активными веществами и оказывают разнообразное действие на организм. Интерес к изучению кумаринов появился с обнаружением антикоагулирующего действия на кровь. В 40-х годах 20 столетия было отмечено, что наблюдается гибель скота от кровотечения при поедании прелого сена, содержащего в большом количестве донник белый. Оказалось, что причиной этого явилось присутствие в растении дикумарола, производного 40оксикумарина. Дикумарол был предложен как антикоагулянт для лечения и профилактики тромбозов и тромбофлебитов. На его основе получены препараты с высокими антикоагулянтными свойствами. Многие фурокумарины обладают фотосенсибилизирующей активностью, т.е. повышают чувствительность кожи к ультрафиолетовым лучам, при этом наблюдается интенсивная пигментация кожи и сильные ожоги. Это свойство фурокумаринов используют для лечения вити-лиго (лейкодермии). Наиболее выражены фотосенсибилизирующие свойства у псоралена и ксантотоксина. Предполагают, что фурокумарины ускоряют образование меланина, причем ответственным за это действие является фурановое кольцо.Некоторые фурано- и пиранокумарины обладают спазмолитическим и коронарорасширяющим действием, понижают тонус гладкой мускулатуры. Наиболее активны виснадин, дигидросамидин из вздутоплодника сибирского.У куместрола и родственных ему соединений отмечена значительная эстрогенная активность.Известны также фурокумарины с противоопухолевой активностью. Это действие связывают с их способностью тормозить рост опухолевых клеток и оказывать влияние на разные стадии митоза. Например, таким действием обладает пеуцеданин из корней горичников русского и Морисона.Некоторыые кумарины и фурокумарины обладают бактериостатическим и противогрибковым действием (например, остол из жгун-корня Монье).

кумарин кислотный природный лекарственный

Краткая характеристика методов выделения и анализа

Экстракция - метод разделения, основанный на использовании экстрагента, не смешивающегося с исходной фазой и легко отделяющегося от неё и от экстрагируемых компонентов. В зависимости от исходной фазы различают эстракцию из твёрдого твёрдого вещества и экстракцию из раствора (жидкостную). По количеству операций экстракция может быть однократной и многократной.

Хроматографические методы разделения веществ основаны на их распределении между двумя фазами: подвижной и неподвижной. Подвижная фаза - жидкость или газ; неподвижная - твёрдое вещество или жидкость, адсорбированная на твёрдом носителе. Относительная скорость перемещения частиц вдоль пути разделения зависит от их взаимодействия с неподвижной фазой. Поэтому каждое вещество проходит на носителе определенный путь. Отношение пути перемещения вещества к пути перемещения растворителя есть величина постоянная, обозначаемая Rf. Она является константой для данных условий разделения и используется для идентификации ЛФ.

Хроматография на бумаге. Носителем неподвижной фазы (например, воды) служит специальная хроматографическая бумага. Распределение происходит между водой, находящейся на поверхности бумаги, и подвижной фазой, которая представляет собой систему из нескольких растворителей. Проводят испытания. Для подтверждения подлинности одновременно хроматографируют испытуемое вещество и стандартный образец. Если они идентичны, то пятна на хроматограммах будут иметь одинаковый вид и равные значения Rf.Хроматографию используют при испытании на чистоту.

Хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ) отличается от хроматографии на бумаге тем, что процесс хроматографирования происходит на носителе (сорбенте), нанесенном тонким слоем на инертную поверхность. Твердый сорбент может быть закрепленным или незакрепленным на этой поверхности. Сорбентом служит силикагель или оксид алюминия. Для закрепления добавляют небольшие количества крахмала или сульфата кальция, Используют также пластинки промышленного изготовления типа «Силуфол УФ-254», «Сорбфил» и др.

Преимуществами ТСХ является простота приемов и оборудования, более высокая чувствительность, чем у бумажной хроматографии, устойчивость пластинок к температурным и химическим воздействиям, значительно большие возможности процессов разделения, детектирования, элюировання, меньшая продолжительность выполнения испытания. Все это создает широкие возможности в использовании ТСХ для выполнения испытаний на подлинность, на чистоту, для количественного определения ЛВ в ЛФ.

Двумерное хроматографирование отличается повторным (после высушивания) пропусканием той же или иной подвижной фазы, но в перпендикулярном по отношению к первоначальному направлению. При этом используют квадратные пластины или листы бумаги.

В фармацевтическом анализе широко применяют сочетание ТСХ с физико-химическими методами анализа. Такие комбинированные методы, как хромато-спектрофотометрия, хромато-флуориметрия, хромато-масс-спектроскопия, особенно эффективны в анализе ЛРС и препаратов, содержащих большое число сопутствующих компонентов.

Гравиметрический метод - основан на измерении массы вещества. Сущность определения состоит в последовательном выполнении реакций осаждения, отделения, высушивании и взвешивании осадка.

Перманганатометрия основана на использовании окислительных свойств титранта - перманганата калия в кислой среде.(2)

Колориметрический метод основан на способности веществ вступать во взаимодействие с солями диазония. В качестве реагентов применяют диазотированный п-нитроанилин, сульфаниловую кислоту,сульфаниламид.

Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях--один из наиболее широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе.Анализируемые ЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обуславливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.

Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называется спектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой. Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в ультрафиолетовой (190-380 нм) и видимой (380-780 мм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.

Слектрофотометрической константой является удельный показатель поглощении (Е1см1%) , который рассчитывают по формуле:

Е1см1% = А/С * l

Удельный показатель поглощения E1см1% представляет собой величину оптической плотности раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора, измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандартному образцу величину Е1см1% и преобразовав эту формулу, можно рассчитать концентрацию анализируемого вещества с относительной погрешностью до ±2%.

Идентификацию ЛВ можно провести по Е1см1%, характеру спектральных кривых в различных растворителях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.(2)

Фотоколориметрия отличается от спектрофотометрического анализа тем, что анализируемое вещество с помощью какого-либо реагента переводят (количественно) в окрашенное соединение. Вначале получают окрашенные растворы, используя растворы стандартных образцов (ГСО или РСО). Измерение оптической плотности производят на фотоколориметрах. Затем строят калибровочный график зависимости интенсивности поглощения окрашенных растворов от концентрации, по которому рассчитывают содержание ЛВ в испытуемых образцах ЛВ или ЛФ.

Флуоресцентные методы основаны на способности веществ флуоресцировать в УФ-свете, обусловленной либо химической структурой самих органических веществ, либо продуктов их диссоциации, сольволиза, других превращений. Способностью флуоресцировать обладают обычно органические соединения с симметричной структурой молекул, в которых имеются сопряженные связи (нитро-, нитрозо-, азо-, амидные, карбонильные или карбоксильные группы).

Полярография -- метод, основанный на измерении силы тока, возникающего на микроэлектроде, при электровосстановлении анализируемого вещества в растворе. Растворителем служит вода, или органические и смешанные растворители. Электролиз проводят в полярографической ячейке, состоящей из электролизера и двух микроэлектродов: ртутного капающего и внешнего насыщенного каломельного. При соблюдении идентичных условий измерений для идентификации используют величину потенциала полуволны, а для количественного определения -- высоту волны (измерение предельного диффузного тока). Количественный анализ выполняют методами калибровочных кривых с использованием стандартных растворов и методом добавок.(1,2)

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) основана на распределении компонентов смеси между газовой и жидкой или твердой фазами. Распределение происходит в результате многократных актов сорбции и десорбции анализируемых веществ, которые вводятся в поток газа-носителя, испаряются и в парообразном состоянии проходят через колонку с сорбентом. Поэтому метод ГЖХ применим для анализа летучих веществ или веществ, которые могут быть переведены в газообразное состояние. Разделенные вещества элюируются из колонки потоком газа-носителя, регистрируются детектором и фиксируются на хроматограмме в виде пиков, по которым можно идентифицировать или определять содержание каждого компонента смеси.

Газовый хроматограф включает в себя систему измерения и регулирования скорости потока газа-носителя, систему ввода пробы испытуемого образца, газохроматографическую колонку, систему термостатирования и контроля температуры в различных узлах прибора и систему детектирования, регистрации и обработки информации, полученной на приборе.

Подлинность ЛВ методом ГЖХ можно подтвердить либо с помошью свидетелей, либо методом относительных удерживаний, В первом случае доказательством идентичности служит совпадение времени удерживания вешества-свидетеля и одного из компонентов смеси ЛВ при хроматографировании каждого в отдельности в одинаковых условиях. Во втором случае вещество-свидетель добавляют к пробе, затем анализируют по рекомендуемой методике. Рассчитывают по формуле величину относительного удерживания, которая является постоянной для ЛВ в конкретных условиях. Количественный анализ выполняют в тех же условиях, используя для расчетов такие параметры, как площадь или высота пиков ЛВ. Площадь пиков устанавливают на хроматограмме с помощью планиметра, интегратора или умножением высоты пика на его полуширину.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) отличается от ГЖХ тем, что подвижной фазой служит не газ, а жидкость, причем она проходит через колонку, наполненную сорбентом, с большой скоростью за счет значительного давления. Поэтому ВЭЖХ позволяет разделять многокомпонентные смеси на индивидуальные вещества высокой степени чистоты. ВЭЖХ отличается высокой чувствительностью {до 10 6 г). На разделение 10-15 компонентов затрачивается 20-30 мин.

Жидкостный хроматограф включает такие узлы, как дозатор, насос высокого давления, высокоэффективная колонка, детектор с регистрирующим устройством. Колонки изготавливают из нержавеющей стали, они имеют длину 10-25 см, внутренний диаметр 0,3-0,8 см и плотно набиваются адсорбентом с размером частиц 5-10 мкм. В качестве элюента используют различные углеводороды в сочетании с этанолом. Детектором обычно служит спектрофотометр с переменной длиной волны (190-900 нм), но существуют также флуориметрические. электрохимические и другие детекторы.

Подлинность испытуемых ЛВ подтверждают по времени выхода каждого компонента смеси из колонки, которое будет стабильно при одинаковых условиях проведения эксперимента. Количественное содержание рассчитывается по площади пика, которая пропорциональна количеству ЛВ в пробе

Методы анализа кумаринов

Титриметрический метод количественного определения производных кумарина основан на способности а-пиронового кольца раскрываться под действием щелочи, но в настоящее время он практически не используется. Избыток щелочи затем оттитровывают хлороводородной или серной кислотой. В связи с получением заниженных результатов была разработана модифицированная методика с использованием оксида ртути, которая исключает преждевременное замыкание лактонного кольца. Существенным достоинством титриметрического метода является отсутствие потребности в стандартных образцах кумаринов, недостатком -- низкая специфичность и токсичность соединений ртути. Тем не менее, эта методика использовалась в нормативной документации на псорален и его лекарственные формы.

Одним из вариантов применения лактонной пробы является гравиметрический метод. Несмотря на несомненное достоинство -- высокую точность, сравнимую со спектрофотометрическим определением, -- он не получил широкого применения из-за трудоемкости и длительности.

Имеются литературные данные о применении перманганатометрии при количественном определении кумарина, однако этот метод дает недостаточно точные результаты.

Кислотные свойства природных гидроксикумаринов были изучены при помощи метода потенциометрического титрования в воде и некоторых неводных растворителях. Влияние строения кумаринов на характер кривых потенциометрического титрования позволяет использовать последние для установления структуры соединений наряду со спектрами их поглощения.

Колориметрические методы количественного определения кумаринов.

К спиртовому извлечению прибавляют 10% спиртовой раствор КОН, нагревают - раствор желтеет, прибавляют свежеприготовленный диазореактив (смесь равных объёмов пара-нитроанилина и раствора нитрита натрияв концентрированной НСl) при наличии кумаринов раствор приобретает окраску от коричневой до вишнёвой. Данный метод был применен для анализа кумаринов Heracleum sp., бергаптена в плодах Pastinaca sativa L., псоралена в субстанции и лекарственных препаратах, атамантина в корнях Peucedanum oreoselinum L. (Moench.), ксантотоксина и бергаптена в плодах Ammi majus L. и в препарате "Аммифурин".

Имеются данные о применении фотоколориметрического метода для количественного определения синтетического антикоагулянта синкумара. Однако необходимо отметить, что реакция азосочетания не является специфичной для кумаринов и их производных (сходные эффекты способны давать фенолы, ароматические амины и флавоноиды). Перед проведением фотоколориметрии необходима тщательная очистка от сопутствующих веществ. Кроме того, диазопроизводные кумаринов имеют различия в спектрах поглощения, обусловленные спецификой строения исходного вещества. Спектрофотометрический метод основан на способности кумаринов к поглощению в УФ-области спектра. Показано, что основные полосы поглощения в спектрах кумаринов и фурокумаринов обусловлены переходами 7г-электронов со связанных молекулярных орбиталей на разрыхляющие. Наличие нескольких характерных полос высокой интенсивности в диапазоне 220 - 350 нм позволяет использовать УФ-спектрофотометрию для количественного определения содержания кумаринов. Характерные максимумы поглощения приведены, в частности, в работах отечественных исследователей.Из групповых методов анализа кумаринов УФ-спектрофотометрический метод является наиболее перспективным, т.к. позволяет проводить компонентный анализ на основе различий спектров поглощения, не требует предварительного разделения и относительно прост в аппаратурном оформлении. Однако при его применении желательно наличие стандартных образцов, позволяющих более точно, чем в случае использования калибровочных графиков и удельных показателей поглощения, устанавливать содержание целевых компонентов.

Методом УФ-спектрофотометрии установлено, что в спектрах поглощения синтетических антикоагулянтов -- дикумарина, фепромарона и синкумара -- наблюдаются две характерные полосы в области 280 и 306 нм, первая из которых имеет колебательную природу, а вторая соответствует р-п-сопряжению бензольного и пиронового циклов.

Прямая спектрофотометрия при длине волны 352 нм с использованием рабочего стандартного образца ксантотоксина была предложена для оценки качества препарата "Аммифурин". Совместное применение ТСХ и спектрофотометрии делает методику более точной. Возможно использование ТСХ на силикагеле КСК254 5/40 в системе петролейный эфир -- этилацетат (1:1), после элюирования пятен этиловым спиртом определяется оптическая плотность. Применим аналогичный метод с использованием бумажной хроматографии на бумаге, импрегнированной метанольным раствором формамида в системе растворителей гептан - бензол (4:1). В работе рассмотрена возможность проведения количественного определения пеуцеданина в растительном сырье и препарате с использованием ТСХ на пластинке с незакрепленным силикагелем в системе петролейный эфир -- диэтиловый эфир (1:2). Элюирование пятен осуществляют этанолом. При длине волны 298 нм проводят определение удельного показателя поглощения вещества, который используют для расчета его содержания. Существенным преимуществом применения спектрофотометрии в данном случае стала возможность определения примеси ореозелона, поглощающего при 345 нм. Количественное содержание птериксина в корнях Libanotis densiflora и в препарате "Либоверин" предложено определять по следующей методике: ТСХ на силикагеле КСК в системе н-гексан -- бензол -- метанол (5:4:1), элюирование пятен этиловым спиртом и измерение оптической плотности элюата при длине волны 322 нм. Расчет проводят по удельному показателю поглощения птериксина. Хроматоспектрофотометрические методики разработаны также для определения количественного содержания псоралена и суммы фурокумаринов в плодах Psoralea drupacea Bge. с использованием стандартных образцов псоралена и ангелицина. С использованием удельного показателя поглощения ксантотоксина возможен и спектрофотометрический метод оценки качества плодов Pastinaca sativa L..

Псорален и бергаптен в препарате "Фурален" можно определить количественно, без разделения суммы кумаринов, при длине волны 297,5 нм, либо при двух длинах волн. Последний принцип положен в основу анализа листьев Ficus carica L., субстанции псоберана и его препаратов.

Предложенный метод основан на модификации хроматоспектрофотометрического метода: при 298 нм определяется сумма фурокумаринов, а при 246 и 268 нм, где наблюдается наибольшая разность в интенсивности поглощения -- содержание псоралена. Количество бергаптена определяется по разности. В качестве стандартного образца используется псорален.

При помощи УФ-спектрофотометрии возможно также определение молекулярной массы кумаринов и фурокумаринов. УФ-спектры могут быть использованы как один из методов идентификации выделенных из растения кумаринов, а также при исследовании их физиологической роли. Описано использование данного метода для оценки биодоступности дикумарола.

Полярографический метод применяется для анализа готовых лекарственных форм фурокумаринов и обусловлен их восстановлением на ртутно-капельном электроде в а-пироновом кольце по двойной связи в положении 3,4. На основании изучения физико-химических свойств природных кумаринов предложены методики качественного, количественного и функционального анализа, которые вошли в фармакопейные статьи на келлин, псорален, виснадин, пастинацин, некоторые виды лекарственного растительного сырья и лекарственные формы. В частности, для контроля качества плодов Pastinaca sativa L. были использованы полярографический и хроматополярографический методы с использованием стандартного образца ксантотоксина. При сочетании полярографии и хроматографии изучался химический состав кумаринов ряда растений и природных продуктов. Имеются литературные данные о методике количественного определения кумарина и коричной кислоты, применяемых в качестве стабилизаторов в инъекционном растворе ФиБС. Несомненным достоинством метода является возможность быстро и точно анализировать сумму кумаринов без предварительного выделения отдельных компонентов, однако следует учитывать, что из-за высокой чувствительности к электрохимически активным примесям требуется тщательная предварительная подготовка.

В настоящее время для анализа кумаринов метод полярографии практически не используется.

Флуоресцентный анализ.Многие кумарины и фурокумарины проявляют характерную (желтую, зеленую, голубую или фиолетовую) флуоресценцию при УФ-возбуждении в нейтральных спиртовых растворах, в растворах щелочей и концентрированной серной кислоте в видимой и ультрафиолетовой областях спектра. Флуоресценция усиливается в щелочной среде за счет образования хиноидной структуры, в кислой среде флуоресценция менее выражена. По величине стоксового сдвига и максимуму флуоресценции предлагается проводить идентификацию фитохимических препаратов.

Для кумаринов и фурокумаринов получены спектры флуоресценции и установлена линейная зависимость ее интенсивности от концентрации, что позволило применить метод флуороденситометрии для количественного определения фурокумаринов псоралена и ангелицина в препарате псорален. Образование флуоресцирующих соединений компонентов препаратов "Аммифурин", "Бероксан" и "Пастинацин" с насыщенным раствором брома в щелочной среде позволило идентифицировать их на основании одинаковых максимумов возбуждения (380 нм) и флуоресценции (480 нм).

Предложен флуориметрический метод определения количественного содержания фурокумаринов в плодах Pastinaca sativa L. при длине волны возбуждения 350 нм и флуоресценции 470 нм. Аналогичная методика приведена и для близкого структурного аналога кумаринов, келлина, в плодах Ammi visnaga L. (Lam.).

Также предложен селективный способ количественного определения неодикумарина путем последовательной обработки анализируемой пробы в диметилформамиде раствором аммиака и насыщенным раствором магния хлорида в этом же растворителе.

Флуоресценция производных кумарина зависит от концентрации водородных ионов, поэтому данные об изменении окраски и интенсивности флуоресценции в различных пределах рН, а также в зависимости от строения кумаринов могут оказаться необходимыми при использовании флуориметрических методов. Количественный анализ с использованием данного метода не получил широкого распространения из-за не всегда проявляющейся линейной зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации.

В литературе имеются данные об использовании 7-(2-бромэтокси) кумарина в качестве флуоресцентной метки для количественного флуориметрического анализа лекарственных препаратов, содержащих третичный атом азота.

Возможно применение флуоресцентной микроскопии для локализации и определения количества гидроксилированных производных кумарина, выполняющих роль фотопротекторов, в зеленых водорослях Da-sycladis vermicularis (Scopoli) Krasser.

Интерес представляет флуоресцентный экспресс-метод обнаружения кумарина в топливе, основанный на реакции его щелочного гидролиза с образованием о-кумаринат-ионов и последующим их превращением в о-кумарат-ионы, обладающие интенсивной флуоресценцией.

Бумажная хроматография чаще всего сочетается с другими физико-химическими методами. Например, после разделения суммы кумаринов на бумаге (петролейный эфир; ДМФА в ацетоне) возможно полярографическое определение суммы фурокумаринов в плодах Pastinaca sativa L. и в препарате "Бероксан". Сочетание бумажной хроматографии с фотоколориметрическим определением на основе реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой используют для анализа фурокумаринов Psoralea drupacea Bge., псоралена и бергаптена в листьях Ficus carica L.. Этот же метод использован для определения фурокумаринов в некоторых видах зонтичных. К существенным недостаткам БХ относятся длительность проведения анализа и необходимость концентрирования вытяжки из-за малой сорбционной емкости бумаги.

Метод тонкослойной хроматографии в значительной степени лишен указанных недостатков, т.к. позволяет относительно быстро производить разделение компонентов смеси. Как и БХ, его можно использовать для идентификации кумаринов в исследуемых препаратах.

Имеются данные о колориметрических методах количественного определения пеуцеданина в корнях Ре-ucedanum morrissonii Bess., основанных на реакции азосочетания, с разделением на тонком слое оксида алюминия в системе гексан -- бензол -- метанол (5:4:1), и для анализа бероксана, пастинацина и псоралена. Также описано колориметрическое определение ксантотоксина, императорина и бергаптена в Ammi majus L. после хроматографирования на си-ликагеле, импрегнированном формамидом, в системе дибутилового эфира. Предложена методика определения псоралена и суммы псоралена и бергаптена, по отдельности, в листьях Ficus carica L.. При этом очищенный от балластных веществ экстракт хроматографируют в тонком слое оксида алюминия в диэти-ловом эфире, а затем при помощи УФ-спектрофотометрии устанавливают содержание кумаринов. Имеются литературные данные о возможности использования двумерной хроматографии в слое силикагеля для определения бергаптена в системах гексан -- четыреххлористый углерод -- трет-бутиламин (180:12:9) и гексан -- толуол -- этилацетат - уксусная кислота (100:10:10:0,5) в сочетании со спектрофлуориметрией.

Последнее десятилетие характеризуется широким использованием ГЖХ и ВЭЖХ для решения задач, связанных с разделением и оценкой качества различных соединений класса кумаринов.

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) применяется в основном для идентификации и количественного анализа фурокумаринов в препаратах и растительном сырье. Установлено различие во временах удерживания для замещенных фурокумаринов. Из общих закономерностей следует упомянуть следующие: при переходе от гидрокси- к метоксикумаринам время удерживания уменьшается (снижается возможность сорбции за счет водородных связей), а фурокумарины с О-алкильным заместителем при С5 регистрируются позже, чем 8-гидроксиизомеры. Кроме того, отмечено, что величина десятичного логарифма относительного времени удерживания линейно зависит от молекулярной массы вещества. Полученные данные могут быть использованы при определении структуры или времени удерживания сходных кумаринов.

Описано также определение псоберана в субстанции методом ГЖХ.

Для анализа корней Phlojodicarpus sibiricus и фловерина предлагается ГЖХ методом абсолютной калибровки после экстракции кумаринов хлороформом в сравнении со стандартным образцом фловерина. При этом дигидросамидин и виснадин выходят одним симметричным пиком.

Сравнение проводят со стандартным образцом фловерина. Раздельное определение виснадина и дигидросамидина возможно после предварительного переведения солей, образовавшихся при щелочном гидролизе, в свободные кислоты. Кислоты экстрагируют эфиром и хроматографируют. Аналогичный метод применяют для анализа аммифурина и плодов Ammi majus L. после экстракции их этиловым спиртом. В качестве внутреннего стандарта используют стандартный образец ксантотоксина.

Метод газовой хроматографии также применяется для обнаружения кумарина и его метаболитов в печени животных и человека.

Широкое распространение в анализе производных кумарина и фурокумарина в настоящее время получила высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Описано одновременное количественное определение методом ВЭЖХ действующих веществ семян Coronilla varia L. (кумаринов -- скополетина, дафноретина и умбеллиферона и кардио-тонических гликозидов). Влияние метоксалена (ксантотоксина) на метаболизм никотина также проводилось при помощи этого метода.

Имеются данные об исследовании содержания кумарина в зависимости от времени заготовки южноамериканского растения Mikania laevigata, применяемого метода экстракции и экстрагента. Предложено использовать ВЭЖХ в изократическом режиме для разделения, одновременного качественного и количественного анализа кумаринов коры Aesculus hyppocasta-пит L. без предварительной очистки, для количественной оценки кумарина в листьях Mikania glomera-ta Spreng . Известна методика определения кумаринов с помощью ВЭЖХ в градиентном режиме (флуоресцентный детектор) при изучении биохимических функций кумаринов в корнях подсолнечника (Heliant-hus annum L.).

Весьма перспективным методом является сочетание ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Предложены соответствующие методики определения антикоагулянтов непрямого действия и родентицидов кумаринового ряда (производные 4-гидроксикумарина) в плазме крови в практике токсикологического анализа.

Определенный интерес представляет использование хроматомасс-спетрометрии для определения наличия кумарина в табачной продукции.

Обзор литературы

В химико-фармацевтическом журнале, Том 40, №6, 2006 г. Стр.54 описаны методы анализа кумаринов травы донника лекарственного. Для выделения суммы кумаринов из травы Melilotus officinalis было предложено использовать экстракцию этиловым спиртом различных концентраций с последующей очисткой хлороформом. Изучение качественного состава кумаринов проводили с использованием различных методов хроматографии бумажной, тонкослойной и ВЭЖХ, которые позволили установить, что в траве донника лекарственного содержится не менее 6 производных класса кумаринов, среди которых следует отметить наличие 2Н-1-бензопиран-2-она, умбеллиферона, скополетина и других соединений. Анализ качественного состава кумаринов присутствующих в сухом экстракте, показал, что они представлены четырьмя производными. При этом кумарин является преобладающим как в ЛРС, так и в сухом экстракте. Качественный анализ производных кумарина, содержащихся как в экстракте, так и в лекарственных формах на его основе: в таблетках «Милелотин», мази, препарате «Флокрамел» проводили с использованием химических и физико-химических методов.В качестве химических методов идентификации используют реакцию азосочетания с диазокомпонентом, лактонную пробу, а также другие цветные реакции.Качественное определение суммы кумаринов предложено проводить методом ТСХ на пластинках Сорбфил в системе бензол - этилацетат (1:2). Используют УФ-спектрофотометрию по наличию полос поглощения при определенных длинах волн. ВЭЖХ применяют по нахождению параметров удерживания.Для количественного определения суммы кумаринов были предложены такие методы, как титриметрия, гравиметрия, фотоколориметрия, УФ-спектрофотометрия.

В химико-фармацевтическом журнале, Том 41, №3, 2007 г. Стр.30 дана статья по изучению химического состава травы кориандра посевного.

Присутствие кумаринов устанавливали на основе их свойства взаимодействовать со щелочами с последующим образованием азокрасителя с диазосоединением, а также по лактонной пробе. Разделение и идентификацию кумаринов в эфирной фракции проводили методом ТСХ на стеклянных пластинках с силикагелем ЛС-5/40 в системах растворителей: I - хлороформ - этанол - муравьиная кислота (31:2:0,15), II - бензол - этанол (8:2), III - бензол - этилацетат (1:2), IV - бензол - этилацетат - уксусная кислота - формамид (74:24:2:1).Количественное определение идентифицированных веществ в исследуемом образце проводили по площади пиков, используя метод внктренней нормализации. Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что трава кориандра посевного содержит большой комплекс БАВ, относящихся к разным классам. Полученные данные свидетельствуют о значимости данного объекта не только с химической точки зрения, но и с фармакологической, так как указывают на эффективность применения данного растения в качестве профилактического средства при различных заболеваниях со стороны сердечно-сосудистой и других систем организма.

В автореферате на тему: «Фармакогностическое изучение Коровяка Скипетровидного» стр.11 Ахмед М.С. Алкилани описал свои исследования по изучению БАВ травы коровяка скипетровидного. Среди этих БАВ он обнаружил и кумарины. Медом препаративной хроматографии на бумаге, а также методом ТСХ выделил умбеллиферон и скополетин. Количественное определение кумаринов проводил методом прямой спектрофотометрии, основанной на поглощении кумаринов в УФ-области. В своем автореферате Ахмед М.С. Алкилани показал возможность использования травы коровяка скипетровидного в медицинской практике наряду с цветками для получения ЛС, обладающих отхаркивающим, противовоспалительным и гастропротекторным действием. Установил что содержание кумаринов в траве коровяка составляет 0,33 ± 0,008 %.

В автореферате Пупыкиной Киры Александровны на тему: «Исследования по разработке и стандартизации ЛРС для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения» 2008 г. описаны фармакогностические исследования четырех растительных сборов, в которых были обнаружены кумарины. Их обнаружение проводили в хлороформной фракции методом ТСХ в системах «этилацетат - бензол (1:2)» и «хлороформ петролейный эфир (1:2)». Кумарины обнаруживали по ярко-голубой флюоресценции в УФ-свете до обработки хромогенными реактивами, а после обработки пятна приобретали флюоресценцию от кирпично-красного до сине-фиолетового цвета. В результате исследования были получены данные о содержании БАВ в сборах, элементный состав сборов и содержание свободных аминокислот в сборах.

В журнале «Растительные ресурсы» том 38, выпуск 3, 2002 г. Описана статья Ю.А. Драницыной на тему: «Изучение жирного масла и соединений кумаринового ряда из плодов Archangeljca decurrens и жирного масла из плодов Pleurospermum ura zense hobbm. Из плодов дягиля, собранных в Красноярском крае, было выделено 8 индивидуальных соединений кумаринового ряда, 6 из них были идентифицированы с императорином, изоимператорином, оксипейцеданином, феллоптерином, умбеллипренином и бергаптеном, два соединения не изучены. Выделение этих веществ производилось из экстракта методом колоночной хроматографии на нейтральной окиси алюминия. Индивидуальность веществ определяли бумажной хроматографией и по стабильности точек плавления при повторных перекристаллизациях. В этой статье по полученным данным показали, что содержание в плодах дягиля веществ кумаринового ряда дает возможность использовать это растение для получения ЛП.

В этом же журнале дана статья на тему: «Кумарины надземной части Seseli strictum ledeb.» в которой А.Л. Шаварда, Т.Ю. Данчул, Л.И. Шагова, Т.В. Букреева, Н.А. Медведева описывали свои исследования по изучению состава жабрицы торчащей. По температуре плавления и данным ИК-спектров были получены и идентифицированы следующие соединения: императорин, остол, ксантотоксин, изоимператорин, оксипейцеданин. Кумурраин и сесибирицин были идентифицированы сравнением температур плавления и ЯМР-спектров.

В диссертации Овчинниковой Светланы Яковлевны на тему: «Фармакогностическое изучение Любистка Лекарственного».2013г. описаны исследования фенольных соединений стр.91. Сначала получили несколько фракций. Хлороформную фракцию исследовали методом ТСХ на пластинках «Силуфол». Результаты хроматографического разделения кумаринов любистка лекарственного занесли в таблицу 21.Затем провели изучение фенольных соединений методом ВЭЖХ стр.97. Входе исследования обнаружено 17 соединений (Таблица 23, рисунок 26) из которых 10 идентифицированы. В результате исследований качественный состав любистка лекарственного, выявлено наличие кумаринов и других фенольных соединений.

В автореферате Семенистой Екатерины Николаевны на тему: «ВЭЖХ в исследовании физико-химических свойств кумаринов, фурокумаринов и их комплексами с переходными металлами». 2007 г. описано изучение хроматографического поведения кумаринов; создание базы данных природных и синтетических кумаринов и фурокумаринов стр.8; хроматографическое исследование продуктов фотолиза кумаринов методом ОФ ВЭЖХ стр.12; спектрофотометрическое и хроматографическое исследование комплексов кумаринов с переходными металлами и продуктов их радиолиза и фотолиза стр.16; изучение состава и антиоксидантной активности растительных экстрактов методом ВЭЖХ с диодноматричным и амперометрическим детектированием стр.21.

Заключение

В процессе курсовой работы были изучены статьи и научные работы о методах анализа кумаринов. Для выделения суммы кумаринов из ЛРС было предложено использовать экстракцию этиловым спиртом различных концентраций с последующей очисткой хлороформом. Изучение качественного состава кумаринов проводили с использованием различных методов хроматографии -- бумажной, тонкослойной и ВЭЖХ.

Качественный анализ производных кумарина, содержащихся как в экстракте, так и в лекарственных формах можно проводить, используя для этих целей как химические, так и физико-химические методы.

В качестве химических методов идентификации кумаринов используется общепринятая реакция азосочетания, лактонная проба, а также другие цветные реакции. Эти способы могут быть использованы в методах ТСХ и БХ, а также непосредственно путем проведения химических реакций с извлечением.

Качественное определение суммы кумаринов предложено проводить методом ТСХ на пластинках Сорбфил в системе бензол - этилацетат (1:2) с последующей обработкой раствора спиртовым раствором щелочи. Пятна идентифицируют по величине Rf и желтой окраске. Однако как уже было отмечено, реакция с диазореактивами неспецифична для кумаринов, к тому же значения Rf не всегда воспроизводимы, поэтому целесообразно применение ТСХ со стандартным образцом преобладающих соединений данного класса.

При использовании УФ-спектрофотометрии идентификацию кумаринов проводят по наличию полос поглощения при определенных длинах волн. ВЭЖХ предполагает нахождение параметров удерживания.

Для количественного определения суммы кумаринов в ЛРС были предложены такие методы, как титриметрия, гравиметрия, фотоколориметрия, УФ-спектрофотометрия и ВЭЖХ.

Список литературы

1. А. В. Ложкин, Е. И. Саканян «Природные кумарины: методы выделения и анализа (обзор). Химико-фармацевтический журнал Том 40, №6, 2006 г.

2. Э.Т. Оганесян, З. М. Нерсесян, А. Ю. Пархоменко «Изучение химического состава травы кориандра посевного». Стр.30. Химико-фармацевтический журнал Том 41, №3, 2007г.

3. К.А. Пупыкина «Исследование по разработке и стандартизации лекарственных растительных средств для профилактики и комплексного лечения заболеваний органов пищеварения». Автореферат, Москва-2008

4. Ахмед М. С. Алкилани «Фармакогностическое изучение Коровяка Скипетровидного (Verbascum densiflorum bertol.). Автореферат, Пятигорск 2006.

5. Ю.А. Драницына «Изучение жирного масла и соединений кумаринового ряда из плодов Archangeljca decurrens и жирного масла из Pleurospermum ura zense hobbm.», Растительные ресурсы, том 38, выпуск 3, 2002

6. А.Л. Шаварда, Т. Ю. Данчул, Л. И. Шагова, Т. В. Букреева, Н. А. Медведева «Кумарины надземной части Seseli strictum ledeb.», Растительные ресурсы, том 38, выпуск 3, 2002

7. С.Я. Овчинникова «Фармакогностическое изучение Любистка Лекарственного» 2013г. Стр.91.

Размещено на Allbest.ur