Проточно-цитометрические методы анализа в гематологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО здравоохранения РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ГОМЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Курсовая работа

Проточно-цитометрические методы анализа в гематологии

ГОМЕЛЬ, 2007



Введение

В сложившейся к настоящему времени системе клинического мышления гематологические данные имеют очень важное значение, так как являются одним из существенных элементов характеристики клинико-физиологического статуса больного и динамики развития болезни. Использование результатов исследования крови составляет неотъемлемое звено процесса диагностики и последующего наблюдения за результатами развития патологического процесса на фоне проводимых лечебных мероприятий. лейкоз иммунофенотипический маркер цитофлюориметрия

Для подсчета и анализа клеток крови используют как ручные микроскопические методы, так и гематологические счетчики разного уровня автоматизации [5,9,15].

Оценка качества всех процедур, предназначенных для количественных гематологических анализов, включая как мануальную, так и автоматизированную технику, может быть интерпретирована через надежность теста, которая включает в себя следующие термины: точность, правильность, сходимость и воспроизводимость измерений.

При мануальном дифференциальном подсчете имеются 3 главных источника ошибок: неравномерное распределение клеток в препарате, неправильное распознавание клеток и статистическая погрешность. В первом случае имеет значение соблюдение правил передвижения препарата при дифференциальном счете клеток. Плохо приготовленный или плохо покрашенный мазок - основная причина ошибок, связанных с неправильным распознаванием клеток.

Наибольшая погрешность, однако, связана с тем, что подсчитывается малое количество клеток в образце - 100 или, в лучшем случае, 200. Увеличить количество регистрируемых клеток не представляется возможным, так как это сразу снизит производительность лаборатории. В этом отношении чрезвычайно точны проточные гематологические счетчики.

Достижения в разработке проточно-цитометрического оборудования и компьютеризованных методов обработки данных позволили создать новое поколение проточных цитометров, широко применяемых в клинической лабораторной практике.

Проточная цитометрия имеет целый ряд преимуществ:

1. объективность;

2. высокая чувствительность (новые приборы могут определять более чем 1000 флюорохромных молекул на клетку);

3. высокая скорость, позволяющая анализировать гораздо большие клеточные объемы (100000 событий в минуту);

4. способность определять редкие клетки со специфическими характеристиками в гетерогенной популяции;

5. способность к изучению жизнеспособных нефиксированных клеток;

6. возможность выполнения сложных одновременных измерений нескольких параметров каждой индивидуальной клетки в суспензии.

К недостаткам проточной цитометрии наряду с очень высокой стоимостью аппаратуры можно отнести отсутствие возможности прямой визуализации изучаемых объектов, что на самых современных приборах (Gen-S, Coulter) компенсируется наличием специальной системы, обеспечивающей автоматическое приготовление мазка крови (slide-maker) включая его окраску и вывод изображения на экран монитора при помощи телевизионного микроскопа [5].

Сегодня проточно-цитометрический анализ дает возможность с высокой степенью эффективности диагностировать, прогнозировать и проводить мониторинг в ходе заболевания.



1. Методы проточной цитометрии

В настоящее время проточная цитометрия достаточно широко применяется в медицинских и биологических исследованиях. Развитие технического оснащения и методов метки клеток открыло уникальные и многочисленные возможности для измерения разных клеточных параметров и получения новых знаний о внутриклеточных механизмах. В гематологии проточные системы используют для быстрого автоматического счета форменных элементов крови, дифференциального анализа с подсчетом формулы крови и выделением атипичных клеток, фенотипирования клеток с применением моноклональных антител, изучения клеточного цикла и выявления анеуплоидных клеточных клонов[1]. Основной задачей проточной цитометрии является определение состава популяции по маркерам клеточной поверхности (фенотип клеточной поверхности). В клинической гематологии метод может быть использован для решения следующих задач:

иммунофенотипирования лимфоцитов, включая определение количества CD4, CD8 клеток и даже Тх1 и Тх2 (по продукции специфических цитокинов);

анализа процессов клеточной активации на основе определения маркеров ранней активации: CD25 (рецептор интерлейкина-2), CD38, CD69, CD71 (трансферриновый рецептор), CD95 (антиген апоптоза), CD122, анти-HLA-DR;

определения маркеров пролиферативной активности клеток иммунной системы (Ki-67, PCNA, Cyclin D3);

оценки внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями;

иммунофенотипирования острых лейкозов и лимфом;

анализа клеточного цикла с определением распределения клеточной популяции по фазам цикла (ДНК-цитометрия);

детекции и мониторирования минимальной резидуальной болезни (MRD);

анализа маркеров апоптоза (аннексина V, CD95 Fas/APO-1, CD95L, Bcl-2, P53).

2. Методы измерения клеток на гематологических проточных анализаторах

1.Кондуктометрия является наиболее распространенным способом проточного анализа клеток крови и широко используется для проведения рутинных исследований в гематологических лабораториях. Этот метод применяют на некоторых исследовательских моделях многопараметровых установок для анализа и сортировки клеток, а также на большинстве гематологических анализаторов, производящих дифференциальный подсчет формулы крови.

Кондуктометрический детектор представляет собой капилляр диаметром порядка 70 мкм и длиной, обычно составляющей 0,75 диаметра, через который с большой скоростью пропускается суспензия клеток, находящихся в растворе электролита. По обе стороны от капилляра (апертуры) находятся электроды, между которыми поддерживается постоянный ток.

Поскольку электрическое сопротивление клетки значительно выше сопротивления электролита, в момент прохождения клетки через апертуру ее электрическое сопротивление резко возрастает. Амплитуда регистрируемого при этом импульса прямо пропорционально зависит от объема вытесненного электролита и отражает объем клетки. Подсчет количества объектов в единице объема пробы позволяет проанализировать их концентрацию. Более детальный анализ заключается в изучении распределения клеток по объему. В литературе кондуктометрический метод обозначают DC (от англ. direct current -- измерение сопротивления).

Радиочастотный анализ (RF -- radio frequency) является разновидностью кондуктометрического метода и используется на некоторых гематологических анализаторах. При прохождении апертурного отверстия объектом в токе высокой частоты также возникают сигналы, амплитуда которых зависит от размеров ядра, плотности ядерного матрикса и цитоплазматических включений (см. рис. 1). Эти сигналы в большей степени отражают характер внутренней структуры клетки.

2. Регистрация свето-рассеяния и поглощения. Физический анализ свето-рассеяния частиц и клеток достаточно сложен и нуж-дается в детальном рас-смотрении. Светорассеяние обусловлено клеточным размером, формой, плотно-стью, окрашиванием и гра-нулярностью внутрикле-точных структур. Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и отражающих компонентов. Светорассеяние для характеристики клеток измеряется разными путями.При малых углах относительно оси падающего света преобладает дифракция. Рассеяние вблизи первого минимума переднего светового дифракционного изображения используют для измерения размера объектов. С возрастанием угла рассеивания увеличивается значение рефракционных эффектов. Поскольку рефракционные лучи пересекают внутренность клетки, регистрируемые при этом сигналы в большей степени отражают внутриклеточную микроструктуру.

Преломление зависит от поглощения и может применяться для измерения способности клеток окрашиваться поглощающими красителями. Ослабление осевого света (поглощение) также используется для проточного анализа.

В частности, этот метод применяется в гематологических анализаторах "Техникон Н-3? ("Тесhnicon", США) и в приборах фирмы "Rochе" (Швейцария) для дифференциального подсчета лейкоцитов периферической крови.

3. Флюориметрия -- измерение флюоресценции красителей, связанных с избирательными клеточными структурами -- главное в применении проточной цитометрии. Флюоресценция имеет 3 основных преимущества в проточных исследованиях: 1) флюоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам; 2) концентрация красителя для исследования клетки очень низкая; 3) нефлюоресцирующие соединения могут становиться флюоресцирующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами. Наибольшее применение в цитофлюориметрии нашли методики анализа распределения клеток по содержанию ДНК и флюоресцентная метка клеток антителами (иммунофенотипирование), которые можно применять одновременно (на одном образце). Основные линии поглощения и излучения флюорохромов, наиболее часто используемых в проточной цитофлюориметрии, приведены в табл. 1. Более подробную информацию о флюоресцентных зондах можно получить в обзорах. Интенсивность флюоресцентного сигнала, а, следовательно, и качество измерений зависят от различных инструментальных характеристик. Сюда входят интенсивность возбуждающего света, скорость движения объектов в потоке, спектр возбуждения красителя, квантовая эффективность красителя, собирающая и передающая эффективность световой оптики и чувствительность фотоэлектронных умножителей.

4. Изучение поляризации флюоресценции позволяет охарактеризовать такое важное биологическое свойство, как вязкость или текучесть мембран, которое отражает функциональное состояние клетки. При поляризации лазерного излучения флюоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет. В том случае, если молекулы заметно вращаются, их ориентация меняется до начала флюоресцентного излучения и интенсивность поляризованного света уменьшается. Поляризация светорассеяния используется в специальной технологии МАРSS (поляризация многоуглового светорассеяния), примененной в гематологических анализаторах фирмы "Abbott" для дифференцировки эозинофилов и базофилов.

5. Анализ сигнала волновой формы можно использовать для измерения ядерного и цитоплазматического диаметра. При этом применяется "щелевой" анализ -- лазерный луч фокусируют до диаметра 1 мкм, а измеряемые клетки пересекают его с постоянной скоростью. Регистрируемые флюоресцентные сигналы имеют волновую форму, которая отражает структуру и размеры объекта вдоль оси, перпендикулярной к щели. Такой подход использовался для анализа структуры хромосом млекопитающих.

3. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов

Диагностика острых лейкозов включает исследование периферической крови, костного мозга и в отдельных случаях проведение трепанобиопсии. Определение варианта острых лейкозов базируется на данных морфоцитохимического, иммунологического и цитогенетического исследования бластных клеток костного мозга и крови [7,9,12,13,14,15]. Такой комплексный подход способствует значительному повышению эффективности современных схем терапии больных острым лейкозом.

На основании морфологической характеристики лейкемические миелобласты и монобласты были разделены на клетки с наличием или отсутствием признаков созревания. Направленность дифференцировки лейкемических элементов определяли с помощью цитохимических реакций. С помощью цитогенетических исследований были выявлены закономерные изменения кариотипа бластов при разных вариантах острых лейкозов.

В период 80-х годов в диагностике острых лейкозов важное значение приобрело иммунофенотипирование (ИФТ) бластов. С помощью гибридомной техники была получена широкая панель моноклональных антител (МКА), которые позволили выявить признаки дифференцировки клеток, не обнаруживаемые при исследовании морфоцитохимическими методами. Использование иммунологических подходов сыграло ведущую роль в диагностике отдельных вариантов острых нелимфобластных лейкозов (миелобластного с минимальной дифференцировкой, эритроидного, мегакариоцитарного) и характеристике всех типов бластов при В- и Т-линейных острых лимфобластных лейкозах [7,9,12,13].

Иммунодиагностика гемобластов основана на сопоставлении морфофункциональных характеристик лейкозных бластов и нормальных/нетрансформированных клеток гемопоэза. Известно, что нормальный процесс дифференцировки клеток в костном мозге и/или тимусе происходит с определенной, достаточно постоянной скоростью, определяемой потребностью организма в кроветворных и иммунокомпетентных клетках. По мере функционального созревания лимфоидных и миелоидных клеток происходит перестройка генов, кодирующих специфические рецепторы клеток, а значит, происходит изменение набора рецепторов для различных факторов роста, дифференцировки и межклеточного взаимодействия. По набору мембранных и цитоплазматических антигенов можно установить линейную принадлежность, стадию зрелости и функциональное состояние клетки.

К настоящему времени ИФТ превратилось в быстрый и полезный способ получения подробной характеристики опухолевых клеток, необходимой для диагностики острых лейкозов (ОЛ). Сходство между лейкозными и нормальными клетками позволяет установить линейность и стадию созревания патологических клеток, что необходимо для диагноза, классификации и прогностической оценки различных типов онкогематологических заболеваний [8].

Для количественного определения популяционного состава лейкоцитов используется способность их рецепторов взаимодействовать со специфическими антителами с образованием стабильных комплексов на поверхностной мембране клетки. На основании классической реакции антиген--антитело разработано довольно много способов количественного учета клеток, часть из которых имеет сугубо историческое значение, другие применяются в основном для научных исследований. Для практических целей максимально адаптированы и дают наиболее воспроизводимые результаты иммуноцитохимия (световая и люминесцентная микроскопия) и проточная цитометрия. Однако не только в клинически сложных случаях, но и в повседневной практике микроскопия все чаще уступает место проточной цитометрии, ставшей основным методом ИФТ в диагностике гемобластозов.

4. Принципы проточной цитофлюориметрии

В основе проточной цитофлюориметрии лежит проведение фотометрических флюоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света. Фотометрические каналы используются для оценки размеров клеток и внеклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размерам, по-разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. Если размер частиц меньше длины облучающего монохроматического света лазера (например, внутриклеточные структуры), то существенное количество света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние). В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с размерами рассеивающихся частиц, характер рассеивания меняется. Световая волна как бы огибает частицу, взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на небольшой угол - малоугловое или прямое светорассеяние. Такой тип рассеивания возникает взаимодействии света с поверхностью клеток разного размера. При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния возможно выделить все клеточные популяции лейкоцитов. В этом случае удается определить физические свойства любой неокрашенной клетки (размер, гранулярность) и, таким образом, разделить анализируемую клеточную популяцию отдельные субпопуляции (например, лейкоциты периферической крови лимфоциты, моноциты и гранулоциты).

Флюоресцентный канал применяется для изучения клеточных маркеров, для чего используются МАТ, меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток (белкам, ДНК, РНК). После окрашивания клеток МАТ происходит специфическое связывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Техника регистрации флюоресценции состоит в следующем. При облучении клеток длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того, флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету. Как правило, регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускаемый флюоресцентный свет всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения [4].

Материалом для иммунофенотипирования могут служить стабилизированные периферическая кровь (кровь необходимо брать натощак с 8 до 10 часов утра) и костный мозг, ликвор, выпотные жидкости и клеточные суспензии различных тканей (лимфатические узлы, селезенка и др.). В качестве антикоагулянта используются гепарин (50 U/ml) или калиевые соли ЭДТА (К₂ или К₃ЭДТА в концентрации 1,6-2,2 мг/мл). Выбор антикоагулянта определяется тактикой исследования. Стабилизированные гепарином кровь или костный мозг могут храниться более длительный срок (в течение 3 дней) и использоваться для дополнительного цитогенетического исследования.

Следует помнить, что кровь, стабилизированная гепарином, не пригодна для подсчета клеток в гематологических анализаторах и морфологического исследования.

Преимущества использования в качестве антикоагулянта ЭДТА:

меньшая потеря миелоидных клеток вследствие снижения адгезии их к стенкам пробирки;

снижение агрегации тромбоцитов, агрегаты которых затрудняют вы деление гейта бластных клеток небольшого размера;

материал может быть использован для подсчета клеток в гематологическом анализаторе и морфологического исследования.

При применении в качестве антикоагулянта К-ЭДТА образцы крови или костного мозга пригодны для цитометрического исследования в течение 24 часов от момента взятия материала. При более длительном хранении образца необходимо оценить жизнеспособность клеток. В случае определения менее 80% жизнеспособных клеток материал не подлежит исследованию, так как возможна потеря антигенов, особенно слабо экспрессированных на клеточной поверхности.

Взятие плевральной, асцитической, перикардиальной, спинномозговой и других жидкостей осуществляется в контейнер с забуференным физиологическим раствором или средой RPMI без добавления антикоагулянта [4].

Принцип метода

Суспензия предварительно окра-шенных флюоресцирующими краси-телями клеток помещается в контейнер для проб проточного цитометра. Через наконечник специальной конструкции под давлением клеточная суспензия впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом, образуя «цепочку» - принцип гидродинамического фокусирования, благодаря которому создаются условия ламинарного потока без перемешивания суспензии клеток с обтекающей жидкостью.

Измерения происходят в проточной кювете прибора при пересечении клеткой луча аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 25 мВт, длина волны 488 нм), где молекулы флюоресцентных красителей, связанные с клетками, переходят в возбужденное состояние. Возвращаясь через короткое время в исходное состояние, молекулы испускают кванты света с иными длинами волн. Это вторичное излучение, имеющее строго определенную для каждого флюорохрома длину волны, проходя через оптическую систему прибора (линзы, фильтры, двухцветные зеркала), регистрируется высокочувствительными детекторами (фотоэлектронными умножителями), преобразующими его в электрические сигналы, поддающиеся компьютерной обработке. Проточные цитофлюориметры могут быть оборудованы одним, двумя или более лазерами. В случае использования двух или более лазеров в исследования могут быть включены флюорохромы, возбуждаемые на разных длинах волн (488 нм, 635 нм, 407 нм и др.).

Иммуноцитофлюориметрический анализ клеток производится по пяти основным параметрам:

две характеристики светорассеяния клеток: FSC (forward side scatter) - показатель прямого светорассеяния и ортогональный SSC (90°) (side scatter) - показатель бокового светорассеяния;

три канала детекции специфического флюоресцентного сигнала красителя на разной длине волны.

Как уже было сказано выше, канал прямого светорассеяния (FSC-канал) используется для регистрации рассеивания света от поверхности клеток под малыми углами (1-10°), что позволяет определять их размеры. Канал бокового светорассеяния (SSC-канал) позволяет регистрировать рассеиваемые клеточными структурами лучи под углами до 90°. Отражение лазерных лучей происходит как от поверхности ядер клеток, так и от различных внутриклеточных структур. Этот параметр отражает оптическую плотность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки.

Термин «гранулярность» имеет специфическую цитофлюориметрическую нагрузку и не является отражением морфологического понятия «гранулярности или зернистости». Под понятием «гранулярность», которую отражает параметр SSC, следует понимать всю совокупность образований, формирующих клетку, включая любые клеточные органеллы и ядро. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности гранулярности цитоплазмы.

Анализ информации, получаемой прибором по каналам светорассеяния, дает возможность разделить лейкоциты периферической крови на три популяции - лимфоциты, моноциты и гранулоциты. Лимфоциты характеризуются наименьшими размерами, наиболее крупные - гранулоциты, моноциты занимают промежуточное положение по параметрам FSC. Наиболее низкие характеристики SSC имеют лимфоциты, промежуточные - моноциты и высокие показатели SSC - у гранулоцитов.

Параметры светорассеяния позволяют произвести анализ в определенном гейте - клеточной популяции с заданными характеристиками («регион интересoв»). При добавлении к клеточной суспензии МАТ, конъюгированных с флюорохромами, происходит связывание клеток, возбуждение флюоресценции и последующая ее регистрация при длине волны 488 нм (рис. 6).

Использование нескольких флюоресцентных меток позволяет проводить одновременный двух-, трехцветный и более анализ, так как каждый флюорохром при прохождении через луч лазера испускает свет различной длины волны. Наиболее часто в качестве красящей метки применяется флюоресцеинизотиоционат (FITC), который улавливается FL-1-детектором (зеленый спектр), фикоэритрин (РЕ) - FL-2-детектором (красный спектр), менее часто - тандем цианин-5/фикоэритрин и пиридин хлорофилл (PerCp, Су5/РЕ) - FL-3-детектором и аллофикоцианин (АРС) - FL-4-детектором. Номер канала зависит от конструкции используемого прибора. При воздействии лазерным лучом флюоресцентные красители, входящие в состав реагентов, генерируют различные цвета, что позволяет определять два и более антигена одновременно. С этой целью современные модели приборов могут быть оснащены двумя или более лазерами и четырьмя или более фотоумно- жителями, что позволяет регистрировать различные флюорохромы на разных длинах волн. При выборе сочетаний флюорохромов для одно- временного определения нескольких клеточных маркеров следует учитывать длину волны источника света и способность оптической системы прибора разделять и одновременно регистрировать сигналы от используемых флю- орохромов.

В проточном цитофлюориметре свет преобразуется в электрические сигналы, которые обрабатываются, и в конечном итоге определяется количес- твенная величина каждого измеряемого параметра. Эти величины дискре- тизируются и передаются в компьютер для вывода на дисплей и анализа. Использование многоцветного проточноцитометрического исследования позволяет одновременно получить информацию о нескольких антигенах на поверхности клеток [4].

5. Иммунологические маркеры, наиболее часто используемые в дифференциальной диагностике лейкозов

Разработка в 1975 г. гибридомной технологии получения моноклональных антител (МАТ) предоставила возможность изучить линейно-cпецифические, дифференцировочные, активационные антигены клеток. В 1982г. в Париже было проведено I Рабочее совещание по созданию единой номенклатуры МАТ, на котором МАТ со сходной специфичностью были объединены в группы (кластеры). Первоначальное значение понятия «кластер дифференцировки» (CD - Cluster of Differentiation) подразумевало набор МАТ, распознающих одну и ту же антигенную структуру на поверхности клеток. Со временем термин «кластер дифференцировки» стал означать саму структуру на клеточной мембране, отражающей фенотип клетки. К настоящему времени известно более 247 антигенных структур - CD, локализованных на мембране клеток различных ростков гемопоэза [4,6,10,11].

Линейно неограниченные (нерестриктироваииые) антигены - антигены, экспрессия которых не ограничена одной клеточной линией. К ним относят CD34, CD38, HLA-DR, TdT (терминальная дезоксинуклеотидилтранс-фераза).

Линейно ассоциированные (линейно-специфические) антигены -- антигены, которые специфически экспрессируются на некоторых линиях миелоидной (CD13, CD33, CD117, CD65, МПО, CD14, CD15, CD41, CD42, CD61 и др.) или лимфоидной дифференцировки (CD 19, CD22, cIg, sIg, CD5, CD3 и др.).

Дифференцировочные антигены - антигены, отражающие стадии дифференцировки клеток (цитоплазматический IgM, к-, л-легкие цепи Ig, CD34, CD10, СD1а и др.).

Активационные антигены отражают активацию клеток (CD25, CD38, HLA-DR и др.).

Линейно неограниченные (нерестриктированные) антигены TdT - терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, внутриклеточная ДНК-полимераза. В норме определяется в ядре незрелых В- и Т-лимфоидных клеток и исчезает по мере их созревания. TdT-позитивные клетки присутствуют только в костном мозге и тимусе. Наличие фермента более характерно для клеток лимфоидного ряда, однако многочисленные исследования выявили его также в миелобластах, поэтому присутствие TdT является, скорее, признаком клеточной незрелости, чем маркером лимфобластов. Он чаще встречается при вариантах ОМЛ М_о и М₁, высока его корреляция с другими ранними маркерами при ОМЛ, такими, как CD34 и HLA-DR, с отсутствием более зрелых миелоидных маркеров (CD65, CD14). Наличие TdT+-клеток помогает дифференцировать лимфобластную лимфому от крупноклеточной и лимфомы Беркитта. Прогностическая значимость этого маркера спорна.

CD34 - трансмембранный протеин, который экспрессирован на 1-3% мононуклеарных клеток костного мозга человека, в периферической крови он присутствует на 0,01-0,05% клеток. Это антиген гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников, который, являясь молекулой клеточной адгезии способствует независимому соединению гемопоэтических стволовых клеток с клеточными элементами стромы костного мозга. Высока корреляция его экспрессии с HLA-DR и TdT. CD34 обнаруживается в 70% случаев детского ОЛЛ и 58% - взрослого ОЛЛ. Прогностическое значение экспрессии CD34 различное - благоприятное при В- и неблагоприятное при Т-клеточном ОЛЛ у детей. При ОМЛ у детей экспрессия CD34 выявлена в 50% случаев, чаще при М₄- и М₅-вариантах, у взрослых в 40%, преимущественно при варианте М₀. Экспрессия этого антигена расценивается как неблагоприятный прогностический фактор.

CD38 - интегральный трансмембранный гликопротеин II типа. Антиген CD38 экспрессирован на 99% СD34+ -клеток костного мозга. Популяция СD34+ -, CD38+ -клеток может не содержать других дифференцировочных антигенов. Предполагается, что CD34+-, СD38-клетки являются примитивными стволовыми клетками, по мере снижения интенсивности экспрессии антигена CD34 возрастает экспрессия антигена CD38. Этот антиген экспрессируется также на активированных Т- и В-лимфоцитах, НК-клетках, моноцитах, плазматических клетках и медуллярных тимоцитах. Появление антигена CD38 зависит от дифференцировки и активации клеток. Так, CD38 присутствует на ранних стадиях В-клеточного онтогенеза, исчезает в процессе созревания В-лимфоцитов и снова появляется на последней стадии дифференцировки плазматических клеток. Подобно этому экспрессируется на лимфоидных клетках Т-линии. Большинство покоящихся зрелых лимфоцитов обеих линий этот антиген не содержат.

HLA-DR - один из антигенов гистосовместимости II класса, экспрессирован на всех стадиях дифференцировки В-клеток, кроме плазматических, а также на моноцитах, макрофагах и активированных Т-лимфоцитах. Он представлен также на определенной стадии незрелых миелоидных клеток. Примитивные гемопоэтические предшественники экспрессируют CD34, но не содержат антиген HLA-DR, тогда как более дифференцированные предшественники экспрессируют как CD34, так и HLA-DR. В нормальной дифференцировке миелоидных клеток HLA-DR отсутствует на более зрелых клетках гранулоцитарного ростка, начиная с промиелоцитов. По-видимому, отсутствие HLA-DR может учитываться наряду с морфоцитохимическими характеристиками для установления группы наиболее дифференцированных острых миелоидныx лейкозов.

Линейно-ассоциированные и дифференцировочные антигены

CD45 - общелейкоцитарный антиген, т. е. антиген, представленный на мембране всех лейкоцитов человека. Уровень экспрессии CD45 нарастает по мере дифференцировки гемопоэтических клеток от незрелых предшественников до форм. Молекула CD45 слабо экспрессируется на всех клетках пула стволовых гемопоэтических клеток, максимальные уровни характерны для зрелых лимфоцитов, промежуточные уровни экспрессии демонстрируют миелоидные клеточные элементы. Различия в уровнях экспрессии антигена CD45 на гемопоэтических клетках широко используются при цитофлюориметрическом анализе клеток при острых лейкозах, позволяя точно разграничить гейт бластных клеток. Существуют три изоформы CD45 (RO, RA, RB). CD45RA - выявляется на наивных Т-клетках, CD45RO - на Т-клетках памяти.

CD71 - антиген, известный как рецептор трансферрина, представлен на клетках с высокой пролиферативной активностью, экспрессируется активированными Т- и В-лимфоцитами, макрофагами и эритробластами. Он коэкспрессирован с антигеном CD34 на некоторой части клеток костного мозга, что доказывает наличие его экспрессии на стволовой клетке. Высокий уро-вень экспрессии CD71 характерен для эритроидных клеток-предшественников. Он имеет значение в обмене железа и клеточном росте.

CD10 - нейтральная эндопептидаза, традиционно обозначается как «общий острой лимфобластной лейкемии антиген» (Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen - CALLA). Он экспрессирован на клетках, включая ранние Т- и В-клетки-предшественники, активированные и пролиферирующие В-клетки, а также на зрелых нейтрофилах, эндотелиальных клетках и стромальных клетках костного мозга. Предполагается его роль в процессе В-клеточного развития. Ранее экспрессия CD10 рассматривалась как признак «лимфоидности». Впоследствии было установлено, что CD10 является дифференцировочным антигеном миелоидных клеток и присутствует также на зрелых гранулоцитах.

CD19 - интегральный мембранный гликопротеин II типа из суперсемейства иммуноглобулинов. Присутствует на всех В-клетках, включая предшественники, утрачивается на плазматических клетках. Он также присутствует на фолликулярных дендритных клетках, незрелых клетках миеломоноцитарного ряда. Экспрессия CD 19 отсутствует на нормальных Т-лимфоцитах, НК-клетках, моноцитах и гранулоцитах. Функция CD 19 - участие в В-клеточном развитии, активации и дифференцировке.

CD20 - антиген В-лимфоцитов, фолликулярных дендритических клеток.

CD22 - трансмембранный гликопротеин из суперсемейства иммуноглобулинов. Он экспрессирован в цитоплазме предшественников В-клеток и на мембране зрелых В-лимфоцитов. Его экспрессия исчезает после активации В-клеток, предшествующей стадии плазматической клетки, он отсутствует на Т-лимфоцитах крови, гранулоцитах, моноцитах. Этот антиген является посредником адгезии к эритроцитам, Т- и В-клеткам, моноцитам и нейтрофилам.

CD23 - низкоаффинный рецептор IgE. В слабой степени экспрессирован на зрелых В-лимфоцитах. Высокий уровень характерен для фолликулярных дендритных клеток и особенно для трансформированных вирусом Эпштейна-Барра В-лимфобластов. Для В-клеток CD23 является маркером дифференцировки, который утрачивается иммуноглобулинсекретирующими клетками. CD23 также экспрессируется на моноцитах, гранулоцитах, тромбоцитах, Т-лимфоцитах, клетках Лангерганса.

СD1а - мембранный гликопротеин, экспрессирован главным образом на кортикальных тимоцитах, клетках Лангерганса, интердигитирующих клетках и на части В-клеток. Существуют его различные изотипы: CDla, -b, -с, -d, -e. Его функция состоит в пептидной презентации (CD1d), липидной презентации (CDlb), взаимодействии с CD4- и СD8-клетками.

CD2 - мономерный гликопротеин, ранее описанный как рецептор для эритроцитов барана розеткообразующих Т-клеток. Он присутствует на тимоцитах, большинстве зрелых Т-лимфоцитов, большом числе НК-клеток.

CD3 - это комплекс из 5 различных полипептидных цепей. CD3 - часть большего комплекса, который включает Т-клеточный рецептор (TCR). Он присутствует на зрелых Т-клетках и тимоцитах. Его функция состоит в активации и функционировании Т-клеток.

CD4 - трансмембранный гликопротеин. Экспрессирован на Т-лимфоцитах-хелперах, моноцитах, хотя плотность распределения ниже, чем на CD4+-лимфоцитах. СD4+-лимфоциты активируют индукцию и «помогают» в синтезе иммуноглобулинов В-клетками.

CD5 - простая цепь трансмембранного гликопротеина, обнаруживается на.зрелых Т-лимфоцитах, тимоцитах, его нет на гранулоцитах и моноцитах. Основная функция - Т-клеточная костимуляция, активация тимоцитов, пролиферация, секреция ИЛ-2 и увеличение концентрации Са²⁺. CD5 обнаружен также на субпопуляции зрелых В-клеток.

CD7 - трансмембранный гликопротеин, обнаружен на зрелых Т-лимфоцитах и их предшественниках, а также на большинстве НК-, пре-В-лимфоцитаx. Зрелые В-лимфоциты и гранулоциты его не содержат. Функциональная роль CD7 - сигнальная трансдукция. Приводятся доказательства коэкспрессии антигена CD7 и CD34 на стволовой клетке. Выявлена экспрессия CD7 на бластных клетках при ОМЛ, что является неблагоприятным прогностическим фактором. Его экспрессия на лейкемических клетках ОМЛ в сочетании с CD34, вероятно, свидетельствует о ранних стадиях дифференцировки.

CD8 - дисульфидно-связанный димер. Экспрессируется на субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов, субпопуляции НК-клеток (экспрессия слабая), на большинстве тимоцитов, которые часто коэкспрессируют CD4, на некоторых дендритических клетках.

СD16 - низкоаффинный IgG-рецептор, состоящий из двух изоформ, одна из которых экспрессируется на НК-клетках, моноцитах, макрофагах, а другая - в основном на нейтрофилах. Он является активатором рецептора для НК-клеток и медиатором антителозависимой цитотоксичности.

CD11b - один из рецепторов адгезии, экспрессирован на гранулоцитах, моноцитах, макрофагах, НК-клетках и СD8+-субпопуляции Т-лимфоцитов.

CD13 - трансмембранный гликопротеин. Он присутствует в крови на большинстве клеток миелоидного ряда, включая нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и моноциты, а также на их предшественниках, его нет на Т- и В-лимфоцитах, тромбоцитах и эритроидных клетках.

CD14 - мембранный гликопротеин, функционирует как высокоаффинный рецептор для липополисахаридного и липополисахарид-связывающего протеин-комплекса на гранулоцитах и моноцитах/макрофагах. Обнаружена сильная экспрессия на моноцитах/макрофагах и слабая - на нейтрофилах. Он также слабо экспрессирован на В-лимфоцитах, но его нет на Т-лимфоцитах, НК-клетках, тромбоцитах и эритроцитах. CD14 выявлен на клетках Лангерганса, фолликулярных дендритических клетках и гистиоцитах.

CD15 - антиген, экспрессирующийся на моноцитах, гранулоцитах и их предшественниках, на клетках Лангерганса. Березовского-Штернберга, множестве опухолевых клеток.

CD33 - панмиелоидный маркер, а также маркер большинства моноцитов/макрофагов. Он экспрессирован на нормальных коммитированных клетках-предшественниках миелоидной линии, но его нет на полипотентной стволовой клетке, его экспрессия усиливается по мере дифференцировки клеток. Функция этого антигена в миелоидных клетках неизвестна.

CD42a - антиген, который формирует комплекс с антигеном CD42b. Этот комплекс является рецептором для фактора Виллебранда и тромбина, способствует адгезии тромбоцитов и агрегации на участках сосудистых повреждений. Он обнаруживается на тромбоцитах и мегакариоцитах.

CD61 - тромбоцитарный гликопротеин GPIIIa, экспрессируется на тромбоцитах и мегакариоцитах, способствует агрегации тромбоцитов, является рецептором для фактора Виллебранда.

CD79a - б-цепь В-клеточного рецептора. Экспрессирован на всех стадиях дифференцировки В-лимфоцитов, включая плазматические клетки, когда антиген локализуется внутри клетки. CD79b - в-цепь В-клеточного рецептора. Экспрессируется на В-клеточной линии позже, чем CD79a, поэтому бластные клетки про-В-ОЛЛ и common-ОЛЛ CD79b - негативны. Отмечается низкая его экспрессия при ХЛЛ и волосатоклеточном лейкозе.

CD117 - трансмембранный гликопротеин (c-kit), рецептор для фактора роста стволовых клеток, экспрессирован на миелоидных клетках-предшественниках. Обладает большей специфичностью для клеток миелоидной линии по сравнению с CD13, CD33. CD138 (синдекан 1) - экспрессия специфична для плазматических клеток.



6. Последовательность анализа

1. Построение графика светорассеяния (FSC/SSC) и выделение региона исследуемых клеток. В большинстве случаев анализ ведется в регионе, по светорассеянию соответствующему лимфоцитам, но при острых лейкозах часто необходимо дополнительное исследование других регионов. Так, при подозрении на острый миелолейкоз с созреванием необходимо исследование региона, соответствующего моноцитам и даже части гранулоцитов. При некоторых острых миелобластных лейкозах (ОМЛ) регион бластных клеток выделяется обособленно от лимфоидных.

При исследовании костного мозга необходимо учитывать, что к региону лимфоидных клеток вплотную примыкают клетки эритроидного ряда дифференцировки.

2. Определение иммунофенотипа клеток, находящихся в данном регионе. Если популяция клеток по экспрессии интересующих исследователя антигенов гетерогенна, то необходимо провести раздельные подсчеты для клеток из лимфоцитарного региона, обладающих большим и малым прямым светорассеянием.

В ряде случаев выделение клеток на основании только их светорассеяния оказывается недостаточно и для более точной характеристики региона используются сочетания, например, бокового светорассеяния и уровня экспрессии панлейкоцитарного антигена (SSC/CD45). Этот подход позволяет выделить в периферической крови больше групп клеток и нередко дает возможность оценить общее содержание опухолевых (бластных) клеток. Однако наличие в костном мозге заметного количества клеток со сниженным уровнем экспрессии CD45 может указывать не на патологию, а на нормальный или гиперплазированный красный росток кроветворения.

Подсчет доли клеток, экспрессирующих одновременно несколько антигенов. Этот этап особенно важен для определения доли клеток при малопроцентных лейкозах, гемолитических анемиях, а также бластном кризе хронического миелолейкоза (ХМЛ).

В наиболее сложных случаях, когда определение иммунофенотипа клеток, находящихся в лимфоцитарном регионе, недостаточно, применяется метод обратного проецирования. Суть данного метода состоит в следующем: по определенному сочетанию двух или трех параметров флюоресценции выделяется регион и затем анализируются другие параметры клеток, попавших в него. Метод обратного проецирования нередко применяется для идентификации бластных клеток при анализе ОМЛ [2,3].

7. Иммунофенотипическая характеристика лейкозных клеток при остром лейкозе

При выявлении в образце неопластических клеток и определении их количества должны быть решены две основные задачи ИФТ гемобластозов:

1) идентификация патологических клеток,

2) иммунофенотипическая характеристика бластов, в том числе

* определение линейной принадлежности бластов и уровня их дифференцировки,

* определение степени гетерогенности клеток патологической популяции за счет выявления различных патологических клонов или наличия клеток на разных стадиях дифференцировки,

* получение подробной фенотипической характеристики каждой выявленной субпопуляции патологических клеток.

Определение линейной принадлежности лейкозных бластов является обязательной частью обследования пациентов с подозрением на гемобластоз. Для этого может быть достаточной оценка экспрессии маркеров скрининговой панели:

Ї линейную принадлежность клеток определяют:

(а) миелоидные маркеры: МПО, СD13, СDЗЗ;

(б) лимфоидные маркеры:

маркеры Т-лимфоцитов СD2, СD7, суСDЗ и sСDЗ;

маркеры В-лимфоцитов СD10, СD19, суСD22 и sСD22;

-- незрелость клетки характеризуют ТdТ, СD34, НLА-DR.

Определение линейной коммитированности опухолевых клеток тем проще, чем больше дифференцировочных маркеров выявляется на их мембране. Трудности в определении линейной принадлежности бластов чаще всего связаны с отсутствием экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток и с существованием перекрестной экспрессии линейных антигенов. Поверхностные линейно-ассоциированные маркеры не выявляются при опухолевой трансформации самых ранних клеток -- предшественников гемопоэза или (в отдельных случаях) утрачиваются при опухолевой прогрессии и/или после химиотерапии. При отсутствии экспрессии линейных маркеров на поверхностной мембране клеток необходимо выявлять маркеры линейной принадлежности (миелопероксидаза -- МПО, СDЗ, СD79б, СD22) в цитоплазме, что требует введения дополнительных шагов в протокол пробоподготовки. Чтобы избежать необходимости последовательного проведения дополнительных окрашиваний, логичнее с самого начала включить в диагностическую панель несколько сочетаний маркеров для выявления внутриклеточных антигенов. Это требует минимального увеличения времени пробоподготовки за счет фиксации и пермеабилизации, но компенсируется получением абсолютно достоверной информации о линейной принадлежности бластов.

В некоторых случаях острого миелобластного лейкоза (ОМЛ) на бластах могут быть выявлены антигены, в норме (на зрелых клетках) ассоциирован-ные с лимфоцитами (СD2, СD7, СD19), а при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) -- ассоциированные миелоидными клетками (СD13, СD14, СD15, СDЗЗ, wСD65) или реже с натуральными киллерами (СD56, СD57). Поэтому для безошибочного определения линейной принадлежности бластов необходимо использовать не один, а несколько линейно-ассоциированных маркеров. Наиболее специфичными маркерами В-линейности являются суСD79б и поверхностные или цитоплазматические иммуноглобулины. Для ОЛЛ заинтересованность В-линии подтверждается экспрессией по крайней мере двух из трех линейных маркеров (суСD22, СD19, суСD79б). Для установления варианта В-клеточного ОЛЛ необходимо оценить экспрессию ТdТ, СD34, СD19, СD79б, суСD22, cyIgм, sIg, k- и л-цепей иммуноглобулина.

Наиболее специфичными маркерами Т-ряда являются поверхностный и/или цитоплазматический СDЗ и Т-клеточный рецептор (ТСR). Предшественники Т-клеток ОЛЛ обычно положительны по СD7 и отрицательны по СD19. Для установления варианта Т-ОЛЛ необходимо оценить экспрессию СD1а, СD2, сyСDЗ, СD4, СD5, СD8, СD16, СD56, варианта ТСR.

Одновременное отсутствие или аномальная реактивность с маркерами СD7 и СD19 при наличии позитивной реакции с миелоидными маркерами является доказательством нелимфоидного происхождения лейкоза даже при отсутствии МПО. Для миелоидных клеток наиболее высокоспецифичными маркерами являются МПО и лизоцим. До настоящего времени иммунологическая классификация миелолейкозов разработана недостаточно, но требует оценки экспрессии значительного числа маркеров.

Исключением являются мегакариоцитарные маркеры СD61, СD41, СD42 и эритроидный антиген гликофорин А, с помощью которых можно верифицировать мегакариобластный лейкоз (ОМЛ, вариант М7) и острый эритромиелоз (ОМЛ, вариант М6), но именно эти формы максимально узнаваемы клинически и морфологически и редко требуют проведения ИФТ с диагностической целью.

При обнаружении на бластных клетках одновременной яркой экспрессии антигенов различных гемопоэтических линий, т. е. при подозрении на бифенотипический лейкоз (БФЛ) дополнительным шагом интерпретации данных ИФТ является балльная оценка экспрессии маркеров. Она проводится, согласно рекомендациям Европейской группы по изучению лейкозов, если в популяции лейкозных бластов не менее 10-- 20% клеток одновременно несут миелоидные и лимфоидные маркеры. Каждый маркер оценивается определенным баллом. Диагноз БФЛ ставится при оценке больше двух баллов для миелоидной и одного -- для лимфоидной линии. Предполагая БФЛ, надо обращать внимание на внутриклеточную экспрессию не одного, а как минимум двух маркеров миелоряда, чтобы избежать ошибочной гипердиагностики.

Практически у всех пациентов с ОЛ фенотип патологических клеток является аберрантным, т. е. не полностью соответствующим какому-то определенному уровню дифференцировки нормальной клетки крови. Эта аномальная экспрессия отражает генетические изменения, лежащие в основе опухолевого перерождения лейкозной клетки. Таким образом, именно аберрации антигенной экспрессии позволяют отделять/дискриминировать здоровые клетки от патологических при анализе биологического материала пациентов с подозрением на онкогематологическое заболевание.

Достаточно большое количество диагностических маркеров и соответственно большой объем получаемой при ИФТ информации обусловливают необходимость применения алгоритма ее интерпретации. В основе его лежит привычный двухшаговый подход: последовательно оценивается антигенная экспрессия маркеров, необходимых для первичной диагностики заболевания и полноценного описания патологической популяции при мониторинге заболевания, в том числе при резидуальной болезни.

ИФТ-характеристика опухолевых клеток во многом определяется тем, какие МКА и в каких комбинациях выбраны лабораторией. Различные сочетания антител могут давать сходную информацию, но ни один не является оптимальным для всех диагностических ситуаций. Некоторые комбинации могут показаться повторяющимися или лишними, однако надо помнить, что опухолевые клетки часто демонстрируют патологическую экспрессию антигенов, т. е. такую характеристику, которая может быть пропущена при использовании неадекватного числа маркеров. Необходимо, чтобы лаборатория была хорошо знакома с особенностями каждой комбинации антител и с особенностями ее связывания с нормальными и патологическими клетками. Рестрицированная, сокращенная панель может ограничивать возможность выявления минимальной остаточной болезни и даже приводить к ошибочной диагностике первичного заболевания. Данные ИФТ являются обязательной составной частью исследований, так же как и демографическое описание пациента, характеристика течения заболевания, морфология и цитохимия клеток крови и костного мозга, цитогенетика. Полноценный развернутый диагноз ОЛ может и должен быть получен с помощью всего арсенала клинико-лабораторной информации [8]. Заключение

Иммунофенотипирование является современным и одним из важнейших методов лабораторной диагностики заболеваний крови. Благодаря внедрению в медицинскую практику МАТ, стало возможным исследовать фенотипы как нормальных клеток крови (лейкоцитов) и костного мозга, так и генетически измененных, лейкозных клеток, и, как следствие, осуществлять с их помощью дифференциальную диагностику гемобластозов.

Для проведения иммунофенотипической диагностики специально подбираются панели антител, включающих минимум маркеров (CD), позволяющих идентифицировать определенный тип лейкоза. Однако в некоторых ситуациях - БФЛ, лейкозы с коэкспрессией миелоидных/лимфоидных антигенов - для безошибочного определения линейной принадлежности бластов необходимо дополнять панель соответствующими маркерами.

Особенно незаменимым метод иммунофенотипирования признан в диагностике острых лейкозов. Он активно применяется для выявления таких вариантов ОМЛ как острый миелобластный лейкоз с минимальной дифференцировкой (М₀), острый эритромиелоз (М₆) и острый мегакариобластный лейкоз (М₇), а также абсолютно необходим в дифференциации всех трех вариантов ОЛЛ.

Важно отметить роль ИФТ в установлении нозологической формы заболевания для назначения оптимального лечения конкретного пациента, определении изменения иммунофенотипа опухоли на фоне лечения, а также выявлении прогностических рисков, хотя с учетом растущих возможностей современной полихимиотерапии последняя задача представляется весьма неоднозначной [3].



Литература

1. Шмаров, Д.А. Проточная цитометрия в гематологии. Методы и техника проточно - цитометрического анализа/ Д.А. Шмаров, Е.С. Князева [и др.]// Клиническая лабораторная диагностика. - 1997. - №8. - С.3 - 11.

2. Воробьев, И.А. Иммунофенотипирование опухолей системы крови и лимфатических опухолей. Часть ЙЙ. Острые лейкозы/ И.А. Воробьев, О.А. Худолеева [и др.]// Гематология и трансфузиология. - 2005. - №3. - С.8-14.

3. Воробьев, И.А. Иммунофенотипирование опухолей системы крови и лимфатических опухолей. Часть Й. Зрелоклеточные лимфомы и лимфосаркомы/ И.А. Воробьев, О.А. Худолеева [и др.]// Гематология и трансфузиология. - 2005. - №1. - С.7-12.

4.Луговская, С.А. Иммунофенотипирование в диагностике гемобластозов/ С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, Н.Н. Тупицын; под ред. С.А. Луговской. - М.: Кафедра КЛД, 2005. - 166 с.

5. Козинец, Г.И. Исследование системы крови в клинической практике/ Г.И. Козинец [и др.]; под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова. - М.: Триада-Х, 1997. - 480 с.

6. Чередеев, А.Н. CD-маркеры в практике клинико-диагностических лабораторий (Лекция)/ А.Н. Чередеев [и др.]// Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - №6. - С.25-32.

7.Френкель, М.А. Современная диагностика острых лейкозов (Лекция)/ М.А. Френкель // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - №1. - С.25-32.

8. Зуева, Е.Е. Иммунофенотипирование в диагностике острых лейкозов (Лекция)/ Е.Е. Зуева [и др.]// Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №7. - С.25-32.

9.Моисеев, С.И. Острые лейкозы/ С.И. Моисеев// Гематология: Новейший справочник/ К.М. Абдулкадыров [и др.]; под ред. К.М. Абдулкадырова. - М., 2004. - Гл.16. - С. 402-467.

10.Флейшер, Т. Иммунодиагностика/ Т. Флейшер, Д. Грейси// Клиническая иммунология и аллергология: практическое руководство/ Г. Лолора-младший [и др.]; под ред. Г. Лолора-младшего, Т. Фишера. Пер.с англ. - М.: Практика,2000. - Гл.20. - С.607-623.

...