Протеолиз и профессиональные бронхо-лёгочные заболевания

Размещено на http://www.allbest.ru/

Протеолиз и профессиональные бронхо-лёгочные заболевания



К числу фундаментальных достижений молекулярной биологии последних лет относится осознание протеолиза как особой формы биологической регуляции. Анализ обширного материала показал, что ограниченный протеолиз служит пусковым механизмом многих процессов и обеспечивает быстрый физиологический ответ организма на изменяющиеся условия или поступающий извне сигнал [14,25,32]. Роль протеиназ многообразна и ещё до конца не изучена, но уже сейчас ясно, что эти ферменты вовлечены в регуляцию биологических процессов на разных уровнях: молекулярном, клеточном, органном.

Рис. 1. Компоненты протеиназно-ингибиторной системы

протеолиз ингибиторный фермент молекулярный

Регуляторный механизм действия протеолитических ферментов включает два типа реакций. Первый связан с полным расщеплением белковых молекул до аминокислот, которые впоследствии вовлекаются в общий метаболический обмен. Таким же путём происходит и удаление из организма аномальных белков, образующихся в результате мутаций и ошибок биосинтеза. Второй обусловлен реакциями ограниченного протеолиза и заключается в расщеплении одной или нескольких специфических пептидных связей в молекуле белков, что приводит к появлению активных продуктов из их биосинтетических предшественников [16,23,27,40]. Ограниченный протеолиз играет решающую роль в образовании активных форм ферментов и гормонов из неактивных, в синтезе биологически активных пептидов (ангиотензинов, кининов, нейропептидов), имеющих значение в регуляции сосудистого тонуса, артериального давления, деятельности мозга, воспалительных и аллергических реакциях. Защитные функции организма - свертывание крови, фибринолиз, иммунный ответ, осуществляются каскадными реакциями при участии протеиназ с ограниченной специфичностью [17,18,49].

Протеолитические ферменты обладают высокой биологической активностью и представляют потенциальную опасность для большинства белковых структур тканей. Протеиназы макрофагального, лейкоцитарного и бактериального происхождения выделяются клетками во время воспалительных явлений в бронхах и лёгких и могут привести к деструкции коллагеновых и эластиновых структур, способствуя развитию фиброза и эмфиземы [20,21,47].

При физиологических условиях активность этих ферментов подавляется специфическими белками - ингибиторами, которые быстро связывают протеиназы. Образующиеся комплексы протеиназы-ингибиторы выводятся из организма.

Сформулирована протеиназно-антипротеиназная теория, согласно которой деструктивные заболевания лёгких у человека развиваются в результате либо избыточного уровня протеолитических ферментов в очаге поражения, либо недостаточного содержания их ингибиторов, вследствие чего система протеолиза становится декомпенсированной [5,22,50,51,52]. Схема взаимодействия протеолитических ферментов и их ингибиторов представлена на рисунке 2.



Рис.2. Схема взаимодействия протеолитических ферментов и их ингибиторов

Основное значение в развитии тканевого повреждения имеют фагоцитирующие клетки - нейтрофильные гранулоциты и альвеолярные макрофаги. При воспалении они накапливаются в экссудатах и во время фагоцитоза высвобождают избыточные количества высокоактивных протеиназ, имеющих в основном лизосомальное происхождение. Главную роль в ферментативных процессах играют нейтрофильные гранулоциты, действие же макрофагов ограничивается выделением хемотактических факторов для нейтрофилов, а также стимулированием высвобождения ферментов из их азурофильных гранул [6,9]. Лизосомальные протеиназы большинства клеток представлены ферментами, относящимися к цистеиновым (катепсины В, С, Н, L и некоторые другие) и сериновым (эластаза, катепсин G) пептидгидролазам и матриксным металлопротеиназам [24,42].

Лизосомальные протеиназы участвуют в деструкции тканей двояким образом: непосредственно воздействуя на основные компоненты межклеточного матрикса и путём активации других протеолитических ферментов. Межклеточный матрикс, как известно, представляет собой структурированный комплекс макромолекул, продуцируемых разными клетками. Основными его компонентами всегда являются коллаген, эластин, протеогликаны и гликопротеиды различной природы [12,13,61]. Коллагены, обладающие уникальной первичной и пространственной структурой, являются основными компонентами соединительной ткани. В настоящее время различают 17 типов коллагена. Основную их массу составляют коллагены Й, ЙЙ, ЙЙЙ типов (так называемые фибриллярные коллагены). Они образуют коллагеновые фибриллы и волокна, формируют опорный скелет организма, входят в состав костной и хрящевой ткани, а также в состав мягкой соединительной ткани, создающей «обрамление» и «архитектуру» органа. Коллаген ЙV типа образует своеобразную коллагеновую сеть, которая составляет основу базальных мембран [29,34]. В формировании стенок сосудов и других опорных элементов участвует ещё один белок с уникальной пространственной структурой - эластин, который образует эластиновые волокна [29]. Создающие основной каркас организма и определяющие его механические свойства, коллагеновые белки и эластин характеризуются устойчивостью к действию протеолитических ферментов и метаболической инертностью.

Основное вещество межклеточного матрикса, которое заполняет пространство между волокнистыми структурами, формируют протеогликаны. Они характеризуются высокой метаболической активностью. Полагают, что деструкция соединительной ткани начинается с их деградации [55,56].

Кроме этого в состав основного вещества межклеточного матрикса входят различные гликопротеиды, среди которых белки с адгезивными свойствами - фибронектин и ламинин. Эти белки, обуславливающие межклеточные взаимодействия и контакты клеток с компонентами матрикса, играют важную роль в процессах дифференцировки и трансформации тканей, перемещениях клеток и их внутренней организации [38].

В настоящее время считают, что деструкция соединительнотканного матрикса осуществляется двумя путями: внеклеточным и внутриклеточным. В обоих случаях принимают участие лизосомальные протеиназы [3,4,60]. Процессы внеклеточной и внутриклеточной деградации тесно связаны между собой. Только при их сочетании может произойти полная деструкция соединительнотканного матрикса. Оценить вклад внеклеточной и внутриклеточной деградации в процессе деструкции рассмотренных компонентов соединительной ткани в настоящее время довольно трудно. Это зависит от конкретных условий: тканевого окружения, типов клеток, физиологического состояния, а также от присутствия различных медиаторов. Роль лизосомальных протеиназ в деструкции тканей может быть связана не только с их непосредственным действием на компоненты матрикса, но и с активацией ряда других протеолитических ферментов и вовлечением их в процессы деградации. В этих случаях лизосомные протеиназы, освобождаясь из клеток, катализируют специфические реакции ограниченного протеолиза и выполняют важные регуляторные функции.

Другой путь участия лизосомальных протеиназ в контроле активности протеолитических ферментов демонстрируют данные о том, что катепсины L и H путем ограниченного протеолиза инактивируют б1-ИП [4,15]. Нарушая его баланс с соответствующими протеиназами, в частности, с эластазой гранулоцитов, цистеиновые протеиназы могут быть включены в регуляцию активности ряда сериновых протеиназ.

Основным ферментом, повреждающим эластические структуры бронхолёгочного дерева, является нейтрофильная эластаза [30]. Это доказывается тем, что в эксперименте можно вызвать эмфизему лёгких внутритрахеальным введением животным эластазы нейтрофилов, которая прочно фиксируется тканью лёгких в виде комплекса фермент-субстрат. Длительное существование этих комплексов может приводить к прогрессированию эмфиземы даже после однократного введения фермента. Возможность длительного сохранения эластолитической активности в бронхиальном дереве, также связывают с образованием комплекса б2- макроглобулин-эластаза, который сохраняет некоторую эластолитическую активность и может длительно находится в лёгком [10,34].

Менее изучен вопрос об участии в деструктивном поражении лёгких эластазы альвеолярных макрофагов. Макрофаги содержат две эластазы: одну - со свойствами сериновой протеиназы, другую - со свойствами металлопротеиназы (СаІ+ - зависимой) [24]. Однако остаётся не ясным - является ли первая из них собственным ферментом макрофагов или это эластаза нейтрофилов, фиксированная на специфических рецепторах поверхности макрофагов. Макрофаги синтезируют за 48 часов столько эластазы, сколько нейтрофилы за 1 час. Но макрофагальная эластаза не ингибируется б1-ИП [1,59].

Эластазу способны синтезировать также фибробласты, гладкомышечные клетки, моноциты, тромбоциты, б-клетки поджелудочной железы.

Эластолитическая активность панкреатической эластазы выше, чем нейтрофильной. Доказано, что панкреатическая эластаза связана в железе со своим ингибитором и может быть обнаружена не только в панкреатическом соке, но и в крови, и в подчелюстных слюнных железах. В лёгкие она может попасть не только гематогенно, но и через лимфатические пути брюшины и диафрагмы и вносить свой вклад в деструкцию тканей.

Эластаза способна вызывать деградацию не только эластина, но и нативного коллагена и протеогликанов дыхательных путей, что делает её участником процессов склерозирования [59].

В настоящее время большой интерес представляет изучение семейства матриксных металлопротеиназ. В литературе освещены вопросы участия системы матриксных металлопротеиназ в развитии доброкачественных, злокачественных и хронических заболеваниях легких, таких как ХОБЛ, астма, туберкулез, рак легкого. Однако, роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе профессиональной бронхолегочной патологии остается менее изученной.

Свое название матриксные металлопротеиназы получили за способность специфически гидролизовать основные белки экстраклеточного матрикса. ММП относятся к семейству цинковых металлопротеиназ, так как содержат в активном центре Zn2+. Известно около 20 представителей этого семейства (таблица1, рис. 4). Большинство ММП секретируется клетками в виде неактивных ферментов, в обычных условиях в тканях обнаруживаются незначительные количества ММП, при этом их активация приводит к протеолитическому разложению окружающих клетку белков [32]. Активацию большинства ММП осуществляют протеазы типа плазмина и активатора плазминогена урокиназного типа [8,33]. Некоторые ММП могут активизировать друг друга. В норме существует биологический механизм ограничения протеолиза тканей, вызванного активными ММП, в виде секреции клетками стромы тканевых ингибиторов металлопротеаз. Это белки небольшого размера, способные формировать нековалентные комплексы со многими членами семейства матриксных металлопротеаз [35,39,45]. В таблице приведена классификация ММП на основе субстратной специфичности в пять подгрупп, которая является несколько произвольной, так как истинные физиологические субстраты для некоторых ММП в настоящее время до конца не определены. Тем не менее можно выделить группу коллагеназ, гидролизирующих интерстициальные коллагены I, II и III типов и группу желатиназ, гидролизующих коллаген IV типа [46,57]. Представители этих подсемейств инициируют инвазивные процессы, так как базальные мембраны состоят из коллагена IV типа, а экстраклеточный матрикс представлен в основном фибриллярными коллагенами I?III типов. Стромелизины гидролизуют протеогликаны и целый ряд адгезивных белков, мембраносвязанные ММП принимают участие в активации проММП-2 и могут разлагать коллагены [36,65,66]. Группа неклассифицированных ММП наименее изучена, некоторые ее представители могут расщеплять эластин [44,35,53]. Таким образом, ММП способны специфически гидролизовать основные компоненты матрикса: коллагены, желатин, ламинин, протеогликаны и эластин, а также адгезивные и другие белки соединительной ткани [65].

Источниками образования MMPs являются многие клетки, включая: фибробласты, макрофаги, гладкомышечные клетки сосудистой стенки, нейтрофилы [41,43]. Активность ферментов в тканях зависит от уровня экспрессии их генов и от наличия активаторов и ингибиторов. ММП относятся к "индуцируемым" ферментам, транскрипция которых зависит от целого ряда факторов (цитокинов, факторов роста и некроза опухолей, химических агентов и др.). Исключение составляет желатиназа А (ММП-2), экспрессия которой происходит по конститутивному пути.

Таблица 1 - Семейство матриксных металлопротеаз

Группа	№ ММП	Полное название	Субстрат
Коллагеназы	1	Интерстициальная коллагеназа	Коллагены (I, II, III, VII, VIII и X); желатин; аггрекан; протеогликан-связанный белок; б1 -антитрипсин/б1 -протеиназный ингибитор(б1 -АТ); б1 -антихимотрип син, ассоциированный с беременностью б2 макроглобулин (б2 М); MBP; L-селектин; IL-1в; сывороточный амилоид А; IGF-BP5; IGF-BP3; MMP-2; -9
	8	Нейтрофильная коллагеназа	Коллаген I, II, III, VII, X типов
	13	Коллагеназа 3	Коллаген I, II, III, VII, X типов
Желатиназы	2	Желатиназа А	Коллагеназа IV типа Коллаген I, IV, V, X типов, желатин, ламинин V
	9	Желатиназа В	Коллаген I, IV, V, X типов, желатин
	3	Стромелизин 1	Желатин, ламинин, проММП-1, протеогликаны, коллаген III,IV, V, IX, X типов? десмоплакин? Е-кадхерин?
	10	Стромелизин 2	Желатин, проММП-1, ламинин, протеогликаны, коллаген III,IV, V, IX, X типов?
Стромелизины	11	Стромелизин 3	Ь1-антипротеаза?
	14	МТ1-ММП	ПроММП-2, желатин, коллагены
	15	МТ2-ММП	ПроММП-2
	16	МТ3-ММП	ПроММП-2
Мембраносвязанные матриксные металлопротеазы	17	МТ4-ММП	?
	7	Матрилизин	Желатин, проММП-1, фибронектин, эластин
	12	Металлоэластаза	Коллаген IV; желатин; эластин; и k-эластин; казеин; б1 -АТ; фибронектин; витронектин; ламинин; протеогликан мономер; GST-TNF; MBP; фибриноген; фибрин; плазминоген
	18/19	RASI-1	?
Неклассифицированные матриксные металлопротеазы	20	Енамелизин	Амелогенин

Фибриллярный интерстициальный коллаген типа I и III составляет более 90% коллагена в паренхиме легкого. MMP-1, -8 и -13 могут катализировать начальный этап их деградации [48]. Таким образом, изменение уровней или активности MMPs может играть существенную роль в изменении метаболизма коллагена.

Рис.3 Строение белков семейства матриксных металлопротеиназ

Активность протеиназ регулируется несколькими путями: пространственной разобщенностью фермента и субстрата, синтезом большинства протеолитических ферментов в форме неактивных предшествеников. К важнейшим физиологическим регуляторам протеолиза относятся также специфические белки - ингибиторы, содержащиеся в крови и тканях, которые связывают протеолитические ферменты, лишая их полностью или частично каталитической активности. После альбуминов и иммуноглобулинов они представляют по количеству (10% от общего уровня) третью группу функционально активных белков. Сейчас известно 6 хорошо охарактеризованных белков, полностью или частично угнетающих активность различных протеиназ: б1-ингибитор протеиназ, б2-макроглобулин (б2-МГ), антитромбин III, ингибитор I компонента комплемента, интер-б-ингибитор химотрипсина, ингибитор активации плазминогена.

Механизм регуляции протеолиза ингибиторами позволяет организму в нужное время быстро купировать протеолитические реакции и, таким образом, приостанавливать или замедлять развитие того или иного биологического процесса.

Наиболее универсальными ингибиторами, обладающими широким спектром действия, являются б1-ИП и б2-МГ.

б1-ИП является доминирующим антипротеолитическим ферментом в организме. Интерес медиков к этому белку резко возрос после обнаружения тесной связи наследственного дефицита б1-ИП с некоторыми формами патологии человека, в первую очередь, с эмфиземой лёгких и ювенильным циррозом печени [27,62].

По химическому составу это гликопротеид, выделенный из б1-глобулиновой фракции сыворотки крови. б1-ИП составляет 75% этой фракции и содержит 12,5% углеводов (галактозу, маннозу, Н-ацетилглюкозамин, сиаловую кислоту). В него входит 1 полипептидная цепь из 394 аминокислотных остатков, к которой присоединены 3 боковые углеводные цепи. Молекулярная масса белка варьирует в пределах 54 000 - 58 000 Д. Считается, что ингибирующий эффект б1-ИП связан с его сравнительно низкой молекулярной массой и способностью образовывать комплексы с протеиназами во внеклеточном пространстве. Эти комплексы выходятся в кровь и там взаимодействуют с б2-МГ, образуя новые соединения, которые затем катаболизируются в [26].

Кроме этого б1-ИП является белком острой фазы воспаления, концентрация которого повышается в сыворотке крови в ответ на активацию протеолитических ферментов.

б1-ИП обладает широким спектром действия, так как ингибирует многие протеазы, однако наибольшую активность он проявляет в отношении эластазы - фермента полиморфно-ядерных лейкоцитов [31]. Функциональная роль б1-ИП заключается в ингибировании коллагеназы и эластазы, освобождающихся при разрушении гранулоцитов, и, следовательно, в торможении тканевого протеолиза. Кроме того, б1-ИП инактивирует тромбин, калликреин и тормозит эстеразную и протеолитическую активность по крайне мере двух компонентов фибринолитической системы - плазмина и кофактора Хагемана и, таким образом, принимает участие в регуляции процессов свертывания крови, калликреин-кининовых реакций и фибринолиза. Показана роль б1-ИП в ингибировании биосинтеза ДНК в лимфоцитах человека; предполагается, что б1-ИП оказывает регуляторное воздействие на синтез ДНК in vitro.

Синтез б1-ИП контролируется единичным локусом PI (protease inhibitor), картированным на 14 хромосоме. Экспрессия (степень выраженности) гена проявляется в виде аллелей и фенотипических вариантов белка, выявляемых современными методами изоэлектрического фокусирования.

Аллели локуса PI кодоминантны, т.е. у людей, гетерозиготных по PI-локусу, синтезируется одновременно 2 различных варианта б1-ИП. Хотя в настоящее время известно более 75 аллелей PI-локуса, основную долю генофонда составляют подтипы аллеля М (М1,М2,М3) [28]. Среди них особый интерес представляют аллели Z и S, относящиеся к группе так называемых дефицитных аллелей. Содержание б1-ИП и соответственно антипротеазной активности сыворотки людей с генотипами ZZ, ZS, SS существенно снижены и составляют 15, 35 и 60 % от активности при основном варианте ММ. Всё выше сказанное указывает на актуальность систематического обследования новорожденных на предмет выявления дефицита б1-ИП. При врождённом дефиците описаны случаи ювенильного цирроза печени, гломерулонефрита, гепатоклеточной карциномы, постнекротического цирроза. У 60% лиц с генотипом PI ZZ (резкий дефицит б1-ИП) развивается эмфизема лёгких. Развитие эмфиземы обусловлено тем, что при недостатке ингибитора, способного блокировать лейкоцитарные протеиназы, возникает интенсивный протеолиз лёгочной ткани, ведущий к разрушению стенок альвеол. При нерезком дефиците б1-ИП (генотипы PI MZ и PI MS), выявлена предрасположенность к атопической астме [7].

Недостаточность 1-ИП является одним из наиболее распространённых моногенных аутосомно-рецессивных наследственных заболеваний. Чаще всего количественная недостаточность белка ассоциирована с гипосекреторными мутациями гена 1-ИП (Z и S аллелями), которые представляют собой точковые замены с изменениями результирующего заряда белка, нарушениями его транспорта из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и формированием в ходе транспорта специфической трёхмерной структуры. Реже встречаются нулевые аллели гена 1-ИП с нонсенс-мутациями и сдвигами рамки считывания.

В органах дыхания присутствуют две группы ингибиторов. Первая группа - лабильные ингибиторы, быстро инактивирующиеся при повышенной температуре и низких значениях pH. Эти ингибиторы (б1-ИП, б2-МГ, б1-антихимотрипсин) поступают в бронхиальный секрет вследствие транссудации из плазмы крови, а также местного биосинтеза или секреции лимфоцитами и макрофагами.

Роль лабильных ингибиторов гранулоцитов в верхних дыхательных путях, а также в бронхах крупного и среднего калибра ограничена. Они ответственны за 15-20% антипротеолитической активности бронхиального секрета. Однако в нижних отделах, на уровне альвеол б1-ИП приобретает значение главной антилейкопротеиназы, предотвращающей развитие эмфиземы. Но большая часть б1-ИП присутствует в бронхиальном секрете (особенно в гнойных образцах) человека в неактивной (частично протеолизированной или окисленной) форме, что может явиться следствием комплексообразования с протеиназами гранулоцитов или макрофагов [11].

Инактивация б1-ИП может наступить также вследствие окисления двух остатков метионина под действием миелопероксидазы гранулоцитов. Окислительная инактивация б1-ИП, по мнению некоторых авторов, может возрастать под влиянием сигаретного дыма, который усиливает хемотаксис гранулоцитов и макрофагов - потенциальных носителей окислителей. Ингибитор в окисленной форме не может тормозить эластолитическую активность, но сохраняет трипсинингибирующее действие.

Вторая группа ингибиторов - кислотостабильные ингибиторы (КСИ), которые синтезируются как местно серозными клетками подслизистых желез трахеи, крупных и средних бронхов, так и поступают из плазмы крови.

В норме в дыхательных путях существует динамическое равновесие между активностью протеиназ и их ингибиторов. У больных деструктивными заболеваниями лёгких и бронхов в процессе воспаления резко нарастает потенциал протеолитических ферментов вследствие усиления инфильтрации тканей нейтрофильными гранулоцитами, а также повышается их секреции под влиянием чужеродных веществ. Предполагают, что первой защитной реакцией организма на появление в просвете бронхов активных протеолитических ферментов является транссудация плазменных ингибиторов. Этого механизма защиты при умеренной выраженности процесса оказывается достаточно. На второй стадии, когда плазменные ингибиторы не справляются с подавлением протеиназной активности, слизистая начинает в повышенных количествах секретировать КСИ. Однако этот механизм лабилен и быстро истощается.

Основными ингибиторами матриксных металлопротеиназ являются их тканевые ингибиторы (TIMP-1,2,3,4), которые, блокируя активность этих ферментов, участвуют в регуляции тканевых перестроек [2,63].

Таким образом, при бронхолёгочной патологии происходит не только активация протеолиза, но и снижение ингибиторного потенциала, что приводит к декомпенсации протеиназно-ингибиторной системы. Уменьшение ингибиторного потенциала может быть связано и с генетически обусловленным дефицитом б1-ИП. У лиц с наследственной недостаточностью этого ингибитора выявлена предрасположенность к развитию тяжёлой эмфиземы лёгких в молодом возрасте. Наличие генетически обусловленного дефицита б1-ИП и работа на пылеопасных производствах повышают риск развития бронхолёгочной патологии.

Нами были проанализированы все имеющиеся методы генотипирования альфа-1-ингибитора протеиназ, изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле, определение мутаций гена альфа-1ингибитора протеиназ методом полимеразной цепной реакции с последующим рестриктазным расщеплением.

Был проведен литературный поиск данных о нуклеотидной последовательности гена, кодирующего альфа-1ингибитор протеиназ и об аминокислотной последовательности белка - продукта данного гена, затем подобраны праймеры, отработаны условия амплификации и разработана тест-система на выявление наиболее распространенных мутаций в Z и S аллелях с точковыми аминокислотными заменами методом полимеразной цепной реакции (Патент на изобретение № 2218094 от 02.04.2002 Способ определения риска развития фиброзных изменений в легких и в печени). Данная тест-система внедрена в клинике НИИ медицины труда РАМН.

Электрофореграмма продуктов ПЦР представлена на рисунке 4. Схема расположения в гене альфа-1 ингибитора протеиназ нуклеотидных замен, приводящих к S и Z мутациям представлена на рисунке 5.



Рис.4. Электрофореграмма продуктов ПЦР при определении S и Z мутаций у четырех пациентов А, В, С и D. Во всех случаях дорожка М соответствует анализу мутации , дорожка N - анализу нормы . Цифры справа указывают длину продуктов в н.п. Сигнал маркерного гена виден как фрагмент длиной 429 н.п., сигналы по точке Z - 245 н.п., сигналы по точке S - 146 н.п.

Рис.5. Схема расположения в гене 1-ИП нуклеотидных замен, приводящих к S и Z мутациям, и праймеров (обозначены стрелками) для их выявления методом аллель-специфичной ПЦР.



Предполагается, что варианты РI*S и РI*Z содержат меньшее количество сиаловой кислоты, чем варианты РI*М (нормальный аллель, при котором активность ингибитора принята за 100%). С другой стороны, показано, что недостаток сиаловой кислоты в молекуле тормозит его секрецию гепатоцитами и ускоряет выведение из плазмы. Эти структурные особенности обусловливают разный уровень альфа-1-ингибитора протеиназ в сыворотке крови лиц с различными фенотипами.

Тест-система для обнаружения мутаций гена a1-ИП имеет ряд преимуществ. Применение метода ДНК-диагностики (аллель-специфичной ПЦР) позволяет проводить доклиническую диагностику. Он обладает высокой чувствительностью и специфичностью, автоматизацией исполнения. Однократность проведения теста у обследуемых, возможность проведения скрининга позволяют рекомендовать его для широкого практического применения в медицине труда при проведении предварительных и периодических медицинских осмотров.

Для определения полиморфизма гена матриксной металлопротеиназы-1(ММП-1) был применен метод пиросеквенирования, разработанный совместно с лабораторией постгеномных технологий НИИ МТ РАМН (зав лаборатории постгеномных технологий, академик РАМН В.В. Покровский). Ген ММП-1 расположен в 11-й паре хромосом. Был определен характер полиморфизма инсерций/делеций гуанина (1607delG) в промоторном участке гена ММР-1. Наличие инсерции/делеции влияет на уровень транскрипции гена, обуславливая повышенный синтез профермента и как следствие - повышение активности матриксной металлопротеиназы-1(ММП-1), избыток которой способствует деструкции компонентов соединительной ткани. При этом гомозиготный вариант с делецией гуанина (-/-) 2G имеет более высокую транскрипционную активность, чем промотор с гетерозиготным аллельным вариантом гена, имеющий инсерцию гуанина(G/-) 1G в промоторной области. При этом отсутствие инсерций/делеций гуанина определяет нормальный уровень синтеза и активности фермента (рис. 6,7,8).

Рис.6. Программа с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту не имеющему инсерций/делеций гуанина в нуклеотидной последовательности - соответствует норме

Рис.7. Программа с вариантом гетерозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему инсерцию гуанина 1G



Рис.8. Программа с вариантом гомозиготного генотипа по определяемому аллельному варианту, имеющему делецию гуанина в исследуемой области гена 2G

Используемый в основе метода принцип пиросеквенирующего синтеза обеспечивает надежность и точность полученных результатов, высокую пропускную способность, максимальную автоматизированность процесса, быстроту проведения анализа [37]. Пиросеквенирование является новым поколением методик секвенирования, нашедшее свое применение, как в фундаментальных исследованиях, так и в диагностических целях [64]. Эта методика позволяет анализировать большой объем клинического материала, не теряя при этом точности результатов. Метод не требует применения электрофоретической детекции продуктов амплификации, широко использующейся в области молекулярной диагностики [54]. Разработана тест-система на выявление полиморфных гиперсекреторных вариантов гена ММП-1, которая позволит определять индивидуальный риск развития заболеваний органов дыхания у здоровых лиц, поступающих на пылеопасные производства, проводить необходимые профилактические и реабилитационные мероприятия.

Таким образом, биохимическую диагностику целесообразно дополнять молекулярно-генетической, которая, обладая более широкими возможностями, одновременно является и более экономичной. Следует подчеркнуть, что указанные выше методы исследования являются необходимыми для выявления индивидуального риска развития бронхолёгочной патологии не только в клинике медицины труда, но активно используются в общей пульмонологии и в педиатрии.

Результаты исследований системы «протеолиз-антипротеолиз».

В группе больных профессиональными заболеваниями лёгких от воздействия промышленных аэрозолей дефицитные генотипы установлены в 5% случаев, среди больных бронхолёгочными заболеваниями непрофессионального генеза - в 10% случаев. Более низкая встречаемость дефицитных вариантов белка у больных профессиональной патологией объясняется элиминацией лиц с подобным генетическим дефектом в начале профессиональной деятельности в связи с развитием заболеваний органов дыхания с тяжёлым клиническим течением.

Сопоставление результатов генетического полиморфизма a1-ИП с клиническими проявлениями показало, что наличие гомозиготного дефицитного варианта (ZZ) гена a1-ИП характеризуется формированием быстро прогрессирующего, хронического профессионального бронхита тяжелого течения даже при небольшом (5-7) лет стаже работы в условиях воздействия промышленных аэрозолей, незначительно превышающих ПДК.

Система ингибитора протеиназ регулируется несколькими генами и в зависимости от их соотношения в одних случаях может в большей степени страдать антипротеиназная система, в других - имеется наследственно обусловленное увеличение синтеза лейкоцитарной эластазы, коллагеназы, катепсина В, G и др. Генетический полиморфизм протеолитических ферментов на сегодняшний день остается неизученным.

Комплексные исследования по определению активности протеиназ (эластазы, катепсина G) и генетического полиморфизма альфа-1 ингибитора протеиназ позволили выявить выраженный дисбаланс в системе «протеолиз-анттипротеолиз» у больных профессиональными заболеваниями органов дыхания. Следует отметить, что высокие уровни протеолитических ферментов у больных профессиональными заболеваниями бронхо-легочной системы в сравнении с больными заболеваниями органов дыхания непрофессионального генеза, даже при отсутствии генетически - детерминированного дефицита альфа-1-ингибитора протеиназ и достаточно высоких или нормальных количественных уровнях данного белка, способствуют развитию декомпенсации системы «протеолиз - антипротеолиз», что приводит к повреждению компонентов паренхимы легких и развитию патологии.

В связи с этим нами разработаны критерии оценки биологического баланса в системе «протеиназы-ингибиторы», которые могут служить маркерами воспалительных и деструктивных процессов в легочной ткани, критериями воздействия промышленных аэрозолей на течение патологического процесса, и индивидуального риска развития профессиональных заболеваний органов дыхания.

При исследовании генетического полиморфизма б1-ИП обращает на себя внимание группа больных профессиональной бронхиальной астмой, в которой наблюдается наибольшая встречаемость гетерозиготных дефицитных вариантов PI MZ - 10.8%. В группе здоровых рабочих гипосекреторные варианты гена б1-ИП не обнаружены. Таким образом, формирование бронхиальной астмы в группе обследованных больных с дефицитным вариантом б1-ИП имело генетически детерминированный характер, реализованный воздействием производственных факторов.

Активность матриксных металлопротеиназ в тканях зависит от уровня экспрессии их генов и от наличия активаторов, переводящих неактивный про-фермент в активную форму, и ингибиторов.



Рис. 9. Схема взаимодействия ферментов и их ингибиторов

За избыточный синтез ММП-1 отвечает ген, расположенный в 11-й паре хромосом. При определении генотипов ММП-1 были обнаружены гетерозиготный генотип с инсерциями гуанина (G/-) G1 у 47% обследованных лиц с профессиональной бронхо-легочной патологией, и гомозиготный генотип с делециями гуанина (-/- ) G2 у - 15% (рис. 13). Полученные данные свидетельствуют о наследственно детерминированном повышении секреции протеолитического фермента матриксной металлопротеиназы-1, обладающей деструктивным действием.

Рис.10 Частота встречаемости гиперсекреторных аллелей гена ММП-1 у обследованных лиц



Результаты изучения распределения мутаций (инсерций G1 и делеций G2) по различным нозологическим формам представлены на рис.14. Наибольшее количество гетеро- и гомозиготных вариантов гена ММП-1 встречалось в группах профессионального хронического бронхита и силикоза соответственно 87% и 85% .

Рис.11 Встречаемость нормального, гомо и гетерозиготного вариантов гена ММП-1 в зависимости от нозологической формы патологии (АЦК -Асбест-цементный комбинат)

При сопоставлении тяжести клинического течения заболевания и наличия мутаций была выявлена достоверная связь между этими показателями. Так при наличии гетеро- и гомозиготных вариантов частота развития эмфиземы легких и пневмосклероза существенно превышает наличие этих клинических признаков у лиц при отсутствии мутаций (таб.2).

Таблица 2 - Зависимость тяжести течения заболевания от наличия гиперсекреторных мутаций гена ММП-1

Мутации ММП-1	Дыхательная недостаточность (степень)	Эмфизема легких	Пневмосклероз
	1, 1-2	2, 2-3	3
отсутствие инсерций/делеций - норма	22%	38%	5%	28%	16%
гетерозиготный G1 генотип (инсерция)	17%	51%	25%	71%**	58%**
гомозиготный G2 генотип (делеция)	11%	53%	26%	84%**	42%*

Примечание. Достоверность различий с группой лиц с отсутствием делеций/инсерций. **р<0,001; * р<0,05

Так эмфизема у носителей гетерозиготного генотипа G1 встречалась у 71% лиц(ч2 - 17,23 при р‹0,0001), у носителей гомозиготного генотипа G2 - у 84% лиц (ч2 -14,77 при р‹0,0001), при отсутствии инсерцй/делеций эмфизема встречалась в 28% случаев. Признаки пневмосклероза у носителей гетерозиготного генотипа G1 встречалась у 58% лиц (ч2 - 12,8 при р‹0,0001), у лиц имеющих гомозиготный вариант генотипа G2частота встречаемости составила 42% (ч2 - 4,6 при р‹0,032), тогда как при отсутствии инсерций/делеций признаки пневмосклероза наблюдались у 16% лиц.

Также были проанализированы сочетания полиморфных аллельных вариантов генов матриксной металлопротеиназы-1 и б1- ингибитора протеиназ, один из которых связан с гиперсекрецией матриксной металлопротеиназы-1, обладающей деструктивным действием, а другой с гипосекрецией б1- ингибитора протеиназ и снижением ингибиторного потенциала у отдельных лиц с професстональной бронхо-легочной патологией. У 5 человек было выявлено сочетание 2 мутаций. Анализ зависимости тяжести клинического течения от наличия сочетания неблагоприятных аллельных вариантов гена матриксной металлопротеиназы-1 и б1- ингибитора протеиназ представлен в таблице 3. Проведенный анализ выявил, что наличие совпадения гипо- и гиперсекреторных аллелей генов матриксной металлопротеиназы-1 и б1- ингибитора протеиназ характеризуется более тяжелым течением (дыхательная недостаточность - 2, 2-3 степени, наличие эмфиземы легких и сопутствующей кожной и бронхолегочной патологии.



Таблица 3 - Сочетание полиморфных гипо- и гиперсекреторных аллелей генов б1-ИП и ММП-1 у больных профессиональной бронхолегочной патологией.

Диагноз	Дыхательная недостаточность	Курение	Эмфизема легких	Пневмосклероз	Проф. Патология	генотип ММП-1	Генотип б1-ИП
Профессиональная бронхиальная астма, ср.тяж.теч.	2	+	-	-	-	гетерозиготный G1 генотип (инсерция)	PiMZ
Профессиональная бронхиальная астма, ср.тяж.теч., гормон зависимая	2	+	+	-	аллергич. риносинусопатия	гетерозиготный G1 генотип (инсерция)	PiMZ
фиброзирующий альвеолит	2-3	+	+	+	экзема	гетерозиготный G1 генотип (инсерция)	PiMZ
Профессиональная бронхиальная астма, аллерг.	2	-	-	-	дерматит вер.конеч	гетерозиготный G1 генотип (инсерция)	PiMS
Профессиональный хронический бронхит	2	+	+	+	экзема	гомозиготный G2 генотип (делеция)	PiMS

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что профессиональные болезни бронхо-легочной системы при воздействии промышленных аэрозолей возникают преимущественно у лиц с детерминированным генотипом и являются следствием взаимодействия наследственно обусловленных и внешних факторов производственной среды.

Комплексные исследования, включающие изучение генотипа и биохимического фенотипа организма с использованием биохимических и молекулярно-генетических методов в сопоставлении с клиническим фенотипом расширяют подходы к оценке состояния здоровья работающих, к изучению патогенетических механизмов развития профессиональных и производственно-обусловленных заболеваний, к обоснованию критериев индивидуального риска развития профессиональной патологии. Полученные результаты и дальнейшие перспективы исследований имеют большое медико-социальное значение в решении проблемы профилактики профессиональных заболеваний бронхо-легочной системы при воздействии промышленных аэрозолей.

Успехи молекулярной генетики, основанной на геномных и протеомных исследованиях, открывают новые возможности для медицины труда, а именно - новые подходы к оценке риска развития профессиональных и производственно-обусловленных заболеваний, уточнению патогенеза болезней, выявлению причин клинического полиморфизма, определению протективных генетических систем, расширяющих норму реакции человека в поддержании гомеостаза при воздействии факторов производственной среды и трудового процесса.

Список использованной литературы

1. Аверьянов А.В., Поливанова А.Э. Нейтрофильная эластаза и болезни органов дыхания. Пульмонология 2006; 5: 74-77.;

2. Бабок А.А. Изучение роли тканевых протеиназ и их ингибиторов в патогенезе патологии лёгких пылевой этиологии: Дис. … канд. мед. наук. - Москва, 1990

3. Биохимия. Медицинские и биологические аспекты: Пер. с франц. / Под ред. Ж. Крю. - М.: Медицина, 1979. - 510 с.;

4. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. - К.: Здоровья, 1988. - 200 с.

5. Вилкинсон Д. Принципы и методы диагностической энзимологии. - М.: Медицина, 1981. - 624 с.;

6. Винник Л.А., Герович Л.М. Эластаза крови при туберкулёзе и других заболеваниях лёгких // Проблемы туберкулёза. - 1985. - № 12. - С. 35-39.;

7. Гайцхоки В.С. Молекулярно-генетическая гетерогенность наследственных болезней // Вопросы медицинской химии. - 1997. - Т. 43, № 5. - С. 290-299.

8. Герштейн Е.С., Короткова Е.А., Пророков В.В., Кушлинский Н.Е. Матриксные металлопротеиназы как биологические маркеры прогноза рака толстой кишки // Бюлл. эксперим. биологии и медицины.--2008.--Т.145, № 3.--С.337--341.;

9. Дин Р. Свободные радикалы, протеолиз и функции лизосом // Структура и функции лизосом. - М., 1986. - С. 60.;

10. Дубровин С.М., Муромцев А.В., Новикова Л.И. б2-макроглобулин: современное состояние вопроса (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. - 2000. - № 6. - С. 3-7.;

11. Иващенко Т.Э., Сиделева О.Г., Петрова М.А., Гембицкая Т.Е., Орлов А.В., Баранов В.С. Генетические факторы предрасположенности к бронхиальной астме // Генетика. - 2000. - Т.36. - № 9. - С. 1

12. Кадурина Т.И. Наследственные коллагенопатии. - СПб.: Невский Диалект, 2000. - 271 с.;

13. Коган Е.А., Корнев Б.М., Попова Е.Н. и др.Межклеточные взаимодействия в морфогенезе инициальных повреждений и склероза при интерстициальных болезнях лёгких / // Вестник РАМН. - 1995. - № 5. - С. 23-30.;

14. Корнеленко Т.А., Свечникова И.Г. Регуляция цистеиновых протеиназ лизосом печени при стимуляции и депрессии макрофагов // Вестник РАМН. - 1998. - № 10. - С. 26-29.;

15. Кубышкин А.В. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в развитии деструктивных процессов при заболеваниях лёгких // Советская медицина. - 1984. - № 9. - С. 42-46.

16. Локшина Л.А. // Химические факторы регуляции активности и биосинтеза ферментов / Под ред. В.Н. Ореховича. - М., 1969. - С. 82-118.41.

17. Локшина Л.А., Соловьёва Н.И., Орехович В.Н. Роль лизосамальных протеиназ в деструкции тканей // Вопросы медицинской химии. - 1987. - № 5. - С. 38-43.;

18. Локшина Л.А., Соловьёва Н.И., Орехович В.Н. Роль лизосомальных протеиназ в деструкции ткани при физиологических и некоторых патологических состояниях // Структура и функции лизосом. - М., 1986. - С. 121-122.;

19. Ляхович В.В., Цырлов И.Б. «Индукция ферментов метаболизма ксенобиотиков»/ Отв. ред. А. А. Ясайтис 242 с. ил. 22 см. Новосибирск Наука Сиб. отд-ние 1981

20. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск, 1989.;

21. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. - Казань, 1993.;

22. Монахов Н.К., Игнатьев В.А., Шаловский М.М. и др.Этиологическое значение наследственного дефицита б1-ингибитора протеиназ в формировании заболеваний органов дыхания / // Терапевтический архив. - 1989. - № 3. - С. 88-90.

23. Нагорная В.Н. Эластаза и её ингибиторы в патогенезе доброкачественных опухолей яичников // Вопросы медицинской химии. - 1989. - № 6. - С. 73-77.;

24. Оглоблина О.Г. Роль протеиназ гранулоцитов и их ингибиторов в патогенезе неспецифических эндобронхитов // Вопросы медицинской химии. - 1984. - № 1. - С. 3-10.;

25. Орехович В.Н., Локшина Л.А., Елисеева Ю.Е., Павлихина Л.В., Роль протеолитических ферментов в регуляции физиологических процессов / // Вестник АМН СССР. - 1984. - № 8. - С. 3-11.;

26. Радченко В.Г., Шабров А.В., Зиновьева Е.Н. Основы клинической гепатологии. Заболевания печени и билиарной системы. - СПб.: Диалект; М.: БИНОМ, 2005. - 864 с.: ил.

27. Соловьева Н.И., Елисеева Ю.А., Локшина Л.А. Протеолитические ферменты и их биологические функции. Вестник РАМН 1995; 2: 3--9;

28. Спицын В.А., Новорадовский А.Г., Спицына Н.Х., Парик Ю.Я. Полиморфизм б1-антитрипсина в популяциях Памира. Репродуктивная компенсация - возможный механизм поддержания генетического разнообразия популяций по генам Pi у человека // Генетика. - 1989. - №25. - С. 2218 - 2224

29. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань. - М., 1981. - 240 с.;

30. Хорькова Р.М., Оглоблина О.Г., Розинова Н.Н. и др.Клиническое значение исследования активности протеиназ полиморфноядерных лейкоцитов и их ингибиторов в бронхиальном секрете детей, больных хронической пневмонией / // Вопросы охраны материнства и детства. - 1982. - Т. 27, № 11. - С. 25-29

31. Чиненная О.В. Фено- и генотипические особенности протеиназно-ингибиторной системы у больных профессиональными заболеваниями органов дыхания Дис….канд.мед.наук, Москва,2003

32. Baggiolini M., Shnider J., Bretz U. et al //Cellular mechanism of proteinase realease from inflammatory cells and the degradation of extra cellular proteins / Protein degradation Health and Diseases. - Amsterdam, 1980. - P. 105-121

33. Basargina, M.A. Activity of Matrix Metalloproteinases and their Inhibitor in Children with Bronchopulmonary Dysplasia / I.V. Davydova, G.V. Yatzik, Т.V. Bershova, М.А. Basargina // European Respiratory Journal.- Austria.-2009.-Р.719.

34. Bej A.K., Mahbubani M.H. et al / /Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology / Am. J. of Med. Gen. - 1991. - Vol. 26, N. 4. - P. 321-334.

35. Beeh KM, Beier J, Kornmann O, Buhl R. Sputum matrix metalloproteinase-9, tissue inhibitor o metalloprotmease-1, and their molar ratio in patients with chronic obstructive pulmonary disease, idiopathic pulmonary fibrosis and healthy subjects. Respir Med 2003; 97: 634-9.;

36. Cardoso WV, Sekhon HS, Hyde DM, Thurlbeck WM. Collagen and elastin in human pulmonary emphysema. Am Rev Respir Dis 1993; 147: 975-81.;

37. Chen D.C. et al., 2003; Royo J.L. et al., 2009

38. D'Ardenne A.J., Gee M. Fibronectin in disease // J. Pathol. - 1984. - Vol. 142. - P. 235-251.

39. Davidson B., Reich R., Risberg B. et al. The biological role and regulation of matrix metalloproteinases;

40. Dunn A.D. Cysteine proteinases from human thyroids and their actions on thyroglobulin / // Endocrinology. - 1988. - Vol. 123, N. 2. - P. 1089-1097.

41. Finlay GA, Russell KJ, McMahon KJ et al. Elevated levels of matrix metalloproteinases in bronchoalveolar lavage fluid of emphysematous patients. Thorax 1997; 52: 502-6.;

42. Gabrijeleic D., Gallwitzer R., Popovic T., Turk V./Proteolitic cleavage of human fibrinogen by cathepsin B / / Biol. Chem. Hoppe-Seyler. - 1988. - Vol. 369. - P. 287-292.

43. Gill S.E., Parks W.C. Metalloproteinases and their inhibitors: regulators of wound healing. Int J Biochem Cell Biol 2008; 40: 6--7: 1334--1347.

44. Hayashibara T., Yamada Y., Onimaru Y. et al. Matrix metalloproteinase-9 and vascular endothelial;

45. Henry M.T., K. McMahon, A.J. Mackarel, K. Prikk, T. Sorsa, P. Maisi, R.

Sepper, M.X. FitzGerald and C.M. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in sarcoidosis and IPF O'ConnorEur Respir J 2002;

metalloproteinase by bone marrow and peripheral blood pre-B cells in childhood acute lymphoblastic metalloproteinase secretion by haematopoietic and stromal precursors and their production in normal and MMP-2 may indicate a good prognosis in AML. Anticancer Res. 1999; 19: 4395-4400. MMP-9 in cancer, e.g. acute leukaemia. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2004; 50: 87-100.

46. Imai K, Dalai SS, Chen ES et al. Human collagenase (matrix metalloproteinase-1) expression in the lungs of patients with emphysema. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163: 786-91.

47. Janoff A., White R., Carp U. et al /Lung injury induced by leukocytic proteases //Amer. J. Path. - 1979. - Vol. 97. - P. 111-136

48. Lanone S, Zheng T, Zhu Z et al. Overlapping and enzyme-specific contributions of matrix metalloproteinases-9 and -12 in IL-13-induced inflammation and remodeling. J Clin Invest 2002; 110: 463-74.

49. McDonald J. The exopeptidases // Proteinases in Mammalian Tissues and Cells. - Holle-Wittenberg, 1982. - P. 20-59.

50. Mornex J.F., Crystal R. Protease-antiprotease imbalance in lung diseases // Marker Proteins Inflammation. - New York, 1989. - P. 261-270.;

51. Morrison H.M., Afford S.C., Stockley R.A. Inhibitory capacity of б1-antitrypsin in lung secretions: Variability and the effect of drugs // Thorax. - 1984. - Vol. 39, N. 7. - P. 510-516.;

52. Morrison H.M., Crystal R. Protease-antiprotease theory of emphysema: Time for reappraisal // Clin. Sci. - 1987. - Vol. 72, N. 2. - P. 151-158.

53. Nagase H., Woessner J.F. Matrix metalloproteinases. J. Biol. Chem. 1999; 274: 21491-21494].

54. Ogino S. et al, 2005

55. Ooyama T., Sakamato H. Elastase in prevention of arterial ageing and the treatment of atherosclerosis // Ciba Foundation Sympos. - 1995. - Vol. 192. - P. 307-320.

56. Ooyama T., Fucuda K., Masuda S. et al /Administration of elastase block the formation of fragmented elastic fibers in aorta or rabbit / / Artery. - 1989. - Vol. 16, N. 6. - P. 293-311.;

57. Russell RE, Thorley A, Culpitt SV el al. Alveolar macrophage-mediated elastolysis: roles ofmatrix metalloproteinases, cysteine, and serine proteases. Am J 58. Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002; 283: L867-73.

59. Sadallah S., Hees C., Miot S. et al. Elastase and metаlloproteinase activities regulate soluble complement receptor 1 relase. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 3754-3761

60. Stockley R. Proteolytic enzymes, their inhibitors and lung diseases // Clin. Sci. - 1983. - Vol. 64. - P. 119-126.

61. Stone P., Calore J., Shider G. /et al Role of б2-macroglobulin-elastase complexes in the pathogenesis of elastase-induced emphysema in hamsters // J. Clin. Invest. - 1982. - Vol. 69. - P. 920-931.

62. Tetley TD: New perspectives on basic mechanisms in lung disease. 6. Proteinase imbalance: its role in lung disease.Thorax 1993, 48:560-565

63. Vihinen P., Kahari V.M. Matrix metalloproteinase in cancer: prognostic markers and therapeutic targets.

64. Voelkerding K.V. et al, 2009

65. Yang L., Dong Z.R., Wen S.P. et al. Relationship between VEGF and MMP-2, MMP-9 in 82 patients;

66. Zucker S., Hymowitz M., Conner C. et al. Measurement of matrix metalloproteinases and tissue inhibitors

Размещено на Allbest.ru

...