Регулирование фибробластических процессов в склеральной ране при помощи сульфатированных гликозаминогликанов

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.01.07 - глазные болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

РЕГУЛИРОВАНИЕ ФИБРОБЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В СКЛЕРАЛЬНОЙ РАНЕ ПРИ ПОМОЩИ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ

Горбунова Ксения Сергеевна

Москва - 2013

Работа выполнена в ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Научный руководитель: Тахчиди Христо Периклович, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН, проректор ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России

Официальные оппоненты:

- Егоров Евгений Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой офтальмологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России

- Борзенок Сергей Анатольевич, доктор медицинских наук, заведующий центром фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ "МНТК "Микрохирургии глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России

Ведущая организация: ГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" Минздрава России

Защита состоится "25" ноября 2013 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.014.01 при ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А.

Автореферат разослан "___" октября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.В. Агафонова

Список сокращений

АГО - антиглаукоматозная операция

ВГД - внутриглазное давление

ВГЖ - внутриглазная жидкость

ГАГ - гликозаминогликаны

ГПМЦ - гидроксипропилметилцеллюлоза

ИСП - интрасклеральная полость

КС - кератансульфат

МНГСЭ - Микроинвазивная непроникающая глубокая склерэктомия

НГСЭ - непроникающая глубокая склерэктомия

НПВС - нестероидные противовоспалительные средства

ПГ - протеогликаны

ПОУГ - первичная открытоугольная глаукома

сГАГ - сульфатированные гликозаминогликаны

Х-4,6-С - хондроитин-4,6-сульфат

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Возможность регулирования клеточной пролиферации является одной из актуальных и активно развивающихся направлений в различных областях медицины. Одним из открытых вопросов в офтальмохирургии является возможность модулирования воспалительно-репаративный ответ в соединительной ткани склеры на хирургические вмешательства в различных клинических ситуациях. Важнейшей проблемой в офтальмологии является глаукома, при которой хирургическое лечение считается наиболее эффективным (Федоров С.Н. с соавт., 1981; Нестеров А.П., 1982, 1995; Еричев В.П., 1999; Либман Е.С. с соавт., 2004; Курышева Н.И., 2004; Егоров Е.А. с соавт., 2011). Однако вследствие морфологических изменений в склере, иммунного дисбаланса во влаге передней камеры и в слезной жидкости, выявляемых при глаукоме, происходит избыточное рубцевание зоны хирургического лечения и эффективность антиглаукомных операции снижается (Бабушкин А.Э., 1990; Козлов В.И. с соавт. 1997; Белова Л.В. с соавт., 2003; Тахчиди Х.П. с соавт., 2003; Шмырёва В.Ф. с соавт. 2005). Поэтому становится актуальным изучение патоморфологических особенностей склеральной ткани при глаукоме и возможные методы коррекции фибробластических процес-сов при оперативном лечении.

Существующие антиглаукомные операции разделяются на два направления - проникающего и непроникающего типа. Важным этапом в развитии непроникающих вмешательств стала разработанная С.Н. Федоровым и В.И. Козловым в 1987 году технология непроникающей глубокой склерэктомии, которая получила широкое распространение благодаря меньшему количеству интраоперационных и послеоперационных осложнений, в отличие от операций фистулизирующего типа (Федоров С.Н. с соавт., 1989). В 1999 году эта технология была усовершенствована Х.П. Тахчиди как микроинвазивная НГСЭ, при этом уменьшался объем хирургической инвазии с сохранением гипотензивного эффекта классической НГСЭ. При МНГСЭ происходит минимальное повреждение тканей в зоне фильтрации, что существенно снижает ответную воспалительную реакцию на повреждение и обуславливает меньший объем рубцевания (Тахчиди Х.П. с соавт., 2001, 2003, 2008).

Для пролонгирования гипотензивного эффекта операции создаются имплантаты и дренажи из разных материалов. Однако любой чужеродный материал вызывает стереотипную воспалительно-репаративную реакцию с формированием соединительнотканной капсулы вокруг инородного тела (Шехтер А.Б., Розанова И.Б., 1999).

Для регулирования фибропластических процессов в зоне АГО стали применять медикаментозное сопровождение, такое как глюкокортикостероиды (ГКС), нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), протеолитические ферменты и цитостатики (Strauss G.H. et al., 1991; Nguyen K.D., Lee D.A., 1992; Иванова Е.С., 1999; Donohue E.K., Cioffi G.A. et al., 2011). Наибольшее распространение для данной цели получили препараты цитостатического ряда. Но они вызывают серьезные осложнения, которые связаны с токсическим действием на все активно делящиеся клетки тканей (Hong S.J. et al., 2001; Coppens G., Maudgal P., 2010). Протеолитические ферменты, ГКС и НПВС характеризуются невысоким процен-том осложнений, однако оказались малоэффективными и не используются в широкой практике. Поэтому с целью регуляции фибропластических процессов в зоне антиглаукомной операции становится актуальным изучение естественных регуляторов физиологических и патологических процессов, одним из таких являются гликозаминогликаны.

Сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) могут осуществлять тонкую регуляцию воспалительного процесса и коллагеногенеза (Шехтер А.Б., Серов В.В., 1991; Jackson R. L. еt al., 1991; Панасюк А.Ф., Ларионов Е.В., 2000; Gandhi N.S., Mancera R.L., 2008; Varki A. еt. al., 2009). Широкое применение сГАГ нашли в офтальмологии, благодаря возможностям регулировать обменные процессы в брадитрофных тканях, изменять конформацию различных молекул, определяя их активность, регулировать продукцию цитокинов (Jackson R.L. еt. al., 1991; Iozzo R.V. 1998; Varki A. еt. al., 2009; Conrad A.H. et. al., 2010). При репаративных процессах сГАГ регулируют агрегацию молекул коллагена, определяют длину, диаметр и ориентацию фибрилл (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981; Scott J.E., Parry D.A., 1992). Они входят в состав вискоэластиков, используемых в офтальмохирургии, являются основными действующими компонентами препарата "Баларпан" и вископротектора "Оквис", применяемых для улучшения репарации роговицы, являются активными компонентами раствора для хранения роговиц (среда "Борзенка-Мороз"), а также ими насыщают коллагеновые дренажы ("Ксенопласт", "iGen"), применяемые в хирургии глаукомы для профилактики избыточного рубцевания в зоне АГО (Анисимов C.И., 2007; Aptel F. et. al., 2009; Санторо Э.Ю. 2012). Однако в настоящее время для регуляции репаративных процессов используются только дренажные имплантаты с насыщением их сГАГ, которые представлены исключительно хондроитинсульфатом, выделенным из костной ткани (Анисимов С.И. с соавт., 2008; Санторо Э.Ю., 2012).

Цель настоящего исследования - экспериментально-морфологическое обоснование антипролиферативных свойств оригинальной смеси сульфатированных гликозаминогликанов в регуляции фибробластических процессов в склеральной ране.

Задачи исследования:

1. Определить in vitro воздействие различных концентраций опытных образцов смеси сГАГ в растворе на процессы пролиферации культуры фибробластов мыши линии L929.

2. Определить in vitro воздействие различных концентраций опытных образцов смеси сГАГ в гелевой форме на процессы пролиферации культуры фибробластов мыши линии L929.

3. Разработать способ доставки и дозирования гелевой формы смеси сГАГ в зону операции.

4. Выбрать оптимальные концентрации и форму смеси сГАГ с антипролиферативными свойствами и подтвердить их действие в эксперименте in vivo на модели фибробластических процессов в склере в зоне моделирования антиглаукомной операции.

Научная новизна результатов исследования:

1. Впервые установлен бимодальный эффект смеси сГАГ, заключающийся в стимулировании пролиферации культуры фибробластов при воздействии на них низких концентраций (0,1%, 0,5%) смеси сГАГ и в подавлении пролиферации при применении высоких концентраций (1 - 5%) смеси сГАГ.

2. Впервые определен диапазон концентраций смеси сГАГ с антипролиферативными свойствами в пределах от 1% до 2%, которые не токсичны и способствуют подавлению пролиферации фибробластов in vitro и замедлению фибробластических процессов в эксперименте in vivo.

3. Впервые установлено, что высокие концентрации смеси сГАГ - от 3% до 5% обладают скрытой отсроченной цитотоксичностью, которая проявляется в виде изменения морфологии фибробластов в культуре in vitro в динамике и развития гиперосмотического состояния с интерстициальном отеком в тканях по результатам эксперимента in vivo, приводящее к нарушению фибробластических процессов в зоне моделирования антиглаукомной операции.

Практическая значимость результатов работы:

1. Разработан способ доставки и дозирования гелевой формы смеси сГАГ в зону операции при помощи оригинального поршневого дозатора, в соответствии с рассчитываемым объемом создаваемой интрасклеральной полости.

2. Гелевые формы смеси сГАГ с концентрацией в диапазоне от 1% до 2% не токсичны, обладают антипролиферативным действием, способствуют подавлению избыточного рубцевания и длительному сохранению интрасклеральной полости.

3. К применению в клинике не рекомендованы высокие концентрации смеси сГАГ (от 3% до 5%) в связи с возможностью возникновения интерстициального отека тканей с последующим нарушением фибробластический процессов, приводящих к неравномерному рубцеванию зоны операции.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Регулирование фибробластических процессов в склеральной ране возможно осуществлять при помощи различных концентраций оригинальной смеси хондроитин-4,6-сульфатов и кератансульфата, используя бимодальные свойства данной смеси сГАГ в отношении пролиферации фибробластов.

2. Гелевая форма смеси сГАГ в диапазоне концентраций от 1% до 2%, обладающая антипролиферативными свойствами, может быть использована в качестве изделия медицинского назначения в сопровождении антиглаукомной хирургии непроникающего типа с доставкой ее в зону операции при помощи оригинального поршневого устройства в необходимом объеме в зависимости от размеров интрасклеральной полости.

Внедрение в практику. Результаты диссертационной работы используются в лекционных курсах для клинических ординаторов, аспирантов и курсантов Научно-педагогического центра ФГБУ "МНТК "Микрохирургии глаза" им. акад. С.Н. Федорова".

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Всероссийской научной конференции молодых ученых с участием иностранных специалистов "Актуальные проблемы офтальмологии" (Москва, 2011), на IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Федоровские чтения-2011" (Москва, 2011), на научно-клинической конференции ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России (Москва, 2012), на 10-th European Glaucoma Society Congress: EGS2012 (Дания, Копенгаген, 2012), на European Society of Ophthalmology Congress: SOE 2013 (Дания, Копенгаген, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 4 - в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Имеются два патента РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 121-й странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 19-ю рисунками, содержит 5 таблиц. Список использованной литературы включает 236 источников, из них - 103 отечественных и 133 зарубежных.

Смесь сульфатированных гликозаминогликанов, состоящая из роговичных хондроитин-4,6-сульфатов и кератансульфата, разработана в ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России совместно с ООО "НЭП МГ". Исследование созданной смеси проводилось при непосредственном участии к.м.н. Е.Х. Тахчиди, зам. ген. директора ООО "НЭП МГ" С.В. Новикова.

Экспериментальные исследования in vitro были выполнены на базе ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова (директор - д.м.н., профессор, акад. РАМН С.В. Готье) в центре по исследованию биоматериалов для искусственных органов (зав. испытательной лаб. биологической безопасности медицинских изделий, д.б.н. Н.В. Перова; при участии к.б.н. В.А. Егоровой).

Экспериментальные исследования in vivo выполнены на базе Калужского филиала ФГБУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России (директор - к.м.н. А.В. Терещенко) при поддержке зам. директора по научной работе Калужского филиала - д.м.н., проф. Ю.А. Белого. Выражаю благодарность за помощь в выполнении эксперимента ведущего научного сотрудника отдела хирургии глаукомы к.м.н. Т.В. Соколовскую.

Морфологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем (зав. центром - д.м.н. С.А. Борзенок). ФГБУ "МНТК "Микрохирургии глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России, при непосредственном участии зав. лабораторией, к.м.н. А.В. Шацких.

Содержание работы

гликозаминогликан антипролиферативный фибробластический

Диссертационная работа представляет собой комплекс экспериментальных исследований смеси сГАГ in vitro и in vivo.

Материалы и методы

Исследуемая смесь сГАГ в оригинальном составе из хондроитин-4-сульфатов, хондроитин-6-сульфатов и кератансульфатов, была выделена из прозрачной неизмененной стромы роговиц сельскохозяйственных животных на базе ООО НЭП "Микрохирургия глаза". Оригинальность смеси сГАГ заключается в том, что впервые Х-4,6-С исследуется вместе с КС; Х-4,6-С и КС в полученной смеси находятся в таком же стехиометрическом соотношении, как и в интактной прозрачной роговице; молекулы сГАГ прозрачной роговицы короткоцепочечные, вследствие этого, они характеризуются высокой химической активностью.

Смесь сГАГ исследуется в двух формах: в растворе (физиологический раствор) и pН нейтральном геле (2% гидроксипропилметилцеллюлоза). В фармакологии 2% ГПМЦ применяют для пролонгирования действия активных веществ, она полностью резорбируется в биологических тканях в течение 24-72 часов и не обладает цитотоксическим эффектом.

В эксперименте проводили исследование образцов с концентрациями активного вещества 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3% и 5% как в растворе, так и в гелевой форме.

Структура эксперимента

В исследовании in vitro на культуре фибробластов мыши линии L929 первой серией эксперимента изучали влияние опытных образцов с различными концентрациями смеси сГАГ в растворе и выявляли концентрации с антипролиферативными свойствами. Второй серией эксперимента проверяли возможность сохранения таких же свойств различных концентраций смеси сГАГ в гелевой форме с выявлением оптимальных концентраций с антипролиферативным действием на культуру фибробластов.

В последующем эксперименте in vivo исследовали влияние на фибробластические процессы в склеральной ране глазного яблока экспериментальных животных смеси сГАГ с антипролиферативными концентрациями в гелевой форме, так как гелевая форма наиболее технологична (из известных форм) для удержания действующего вещества в операционной ране во время хирургических манипуляции, кроме того, за счет вязкости происходит постепенное высвобождение активного вещества и его регуляторное влияние на воспалительно-репаративный процесс оказывается до полной биодеградации 2% ГПМЦ.

Технология проведения всех тестов in vitro выполнялась по стандартной методике культивирования. Высевание культуры фибробластов мыши линии L929 происходило в культуральные плоскодонные 96-луночные планшеты из полистирола, визуально клетки оценивали с помощью бинокулярного инвертированного микроскопа Биолам П-I (Ломо, Россия) при увеличении х 100, динамику роста культуры фибробластов оценивали с использованием автоматического цифрового иммерсионного конфокального микроскопа ConfoScan3 (Nidek Technologies, Япония).

Первоначально в эксперименте in vitro в соответствии со стандартными протоколами исследований медицинских изделий перед изучением их предполагаемого механизма действия проводилось исследование на определение возможной цитотоксичности нового вещества в течение 24 часов. Исследование выполняли методом прямого контакта смеси сГАГ с культурой фибробластов мыши линии L929 (в соответствие с ГОСТ Р ИСО 10993.5-99. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы in vitro).

После теста на цитотоксичность активного вещества выполняли эксперимент. В первой серии исследования для опытных образцов различных концентраций смеси сГАГ в растворе контролем служили клетки без добавления какого-либо образца активного вещества (культуральный полистирол). Во второй серии для опытных образцов смеси сГАГ в гелевой форме контролем были клетки с добавлением геля без смеси сГАГ (0% сГАГ в геле). Посев клеток в контрольных группах проводили аналогично посевам с опытными образцами. Подсчет количества клеток в опытных и контрольных группах производили через 24 ч., 72 ч., 96 ч. и 144ч.

Последующий эксперимент in vivo по исследованию антипролиферативного действия смеси сГАГ в гелевой форме на фибробластические процессы в склеральной ране проводился на 72 глазах 36 кроликов породы Шиншилла одного возраста весом 2,5-3,5 кг. Всем животным в условиях операционной под наркозом было произведено иссечение глубоких слоев склеры по типу непроникающей глубокой склерэктомии, что послужило моделью для фибробластических процессов в склеральной ране. Полноценную непроникающую антиглаукомную операцию с функциональным эффектом провести у кроликов не возможно по причине различий в строении дренажной системе.

Операцию проводили в верхнем сегменте глазного яблока, конъюнктивальными ножницами производили разрез конъюнктивы параллельно лимбу длинной 6-7 мм и отсепаровывали ее тупым способом. Выкраивали и отсепаровывали поверхностный склеральный лоскут размером 5х 5 мм на 1/3 толщины склеры. При необходимости проводили коагуляцию кровоточащих сосудов. Затем отсепаровывали и удаляли глубокий лоскут склеры, оставляя тонкий слой на поверхности сосудистой оболочки. В сформированное интрасклеральное ложе вводили исследуемое вещество в геле либо чистый гель, либо без дополнительных манипуляций сразу приступали к подшиванию поверхностного склерального лоскута двумя узловыми швами 8-0 и накладывали непрерывный шов на конъюнктиву 10-0.

Было сформировано три опытные (36 глаз) и две контрольные (36 глаз) группы. У каждого кролика правый глаз был опытным, а левый служил контролем. В опытной группе 1 (12 глаз) интраоперационно в ИСП вводили смесь 1% сГАГ в геле, в опытной группе 2 (12 глаз) - смесь 2% сГАГ в гелевой форме, в опытной группе 3 (12 глаз) - смесь 5% сГАГ в гелевой форме.

В контроле-1 проводили операцию модель НГСЭ без добавления каких - либо веществ (18 глаз), в контроле-2 во время операции в ИСП вводили гель без добавления активного вещества (18 глаз).

Способ доставки и дозирования смеси сГАГ

Для определения объема смеси сГАГ в гелевой форме необходимой для введения в зону операции моделирования НГСЭ был произведен расчет объема создаваемой ИСП. Для этого был определен объем иссекаемого глубокого склерального лоскута по формуле:

V=abc, где a - длина глубокого лоскута, b - его ширина, c - толщина.

Необходимые параметры глубокого лоскута определили исходя из толщины склеры в области хирургического вмешательства и линейных размеров модели НГСЭ.

В эксперименте по гистологическим препаратам нескольких интактных глаз кролика в области от лимба до экватора в зоне хирургического вмешательства была рассчитана толщина склеры. Средняя толщина склеры составила 0,198±0,014 мм. Линейные параметры НГСЭ как поверхностного, так и глубокого склеральных лоскутов составляют 5х 5 мм, толщина поверхностного склерального лоскута составляет 1/3 всей склеры и равна 0,066 мм, толщина глубокого склерального лоскута составляет 0,082 мм, а толщина остаточной склеральной ткани на хориоидеи равна 0,05 мм.

Таким образом, полученный объем иссеченного глубокого склерального лоскута: V=5х 5х 0,082=2,05 мм 3, равен объему сформированной ИСП. Следовательно, в интрасклеральную полость вводили 0,002 мл активного вещества. Для доставки в зону операции необходимого объема изучаемой смеси сГАГ было разработано устройство для дозированного введения вещества с минимальным объемом 0,001 мл и с шагом 0,001 мл (Положительное решение на изобретение заявка №2011125471/14 (037572) от 22.06.2011 и заявка №2011136768/14(054700) от 06.09.2011).

Клиническое наблюдение за глазами экспериментальных животных в послеоперационном периоде проходило ежедневно в течение первых семи дней, затем через 3 и 6 недель. Обследование лабораторных животных включало биомикроскопию на щелевой лампе "Zeiss" (Германия) и непрямую офтальмоскопию при помощи бинокулярного офтальмоскопа "Heine" (Германия). Животных выводили из эксперимента через 1, 3 и 6 недель после операции под общим наркозом путем воздушной эмболии. Глазные яблоки энуклеировали, фиксировали в 10%-ом растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, подвергали стандартной обработке с обезвоживанием и обезжириванием в спиртах восходящей концентрации, заключали в парафин, далее изготавливали серийные срезы с окрашиванием гематоксилин - эозином и по методике Ван Гизона и проводили гистологи-ческие исследования. Препараты изучали под микроскопом Leica DM LB2 (Германия) при х 50, х 100, х 200 и х 400 - кратном увеличении с последующим фотографированием.

Результаты серий исследований функционального действия смеси сГАГ на культуру фибробластов in vitro

Результаты эксперимента оценивали по двум критериям: количественный - подсчет клеток в культуре на определенных этапах эксперимента и качественный - изменение морфологии фибробластов в культуре под действием изучаемой смеси сГАГ различных концентраций в динамике исследования.

Проведенный тест на цитотоксичность за время инкубации 24 часа не выявил ни качественных, ни количественных изменений фибробластов в культуре. Следовательно, исследуемая смесь не является токсичной.

По истечении 24 часов инкубации наибольший прирост количества клеток отмечали в опыте с концентрацией 0,5%-ой смеси сГАГ - 185±20 кл/ммІ, а наименьший прирост числа клеток - в опыте с концентрацией 5%-ой смеси сГАГ - 97±10 кл/ммІ. При этом в контроле количество клеток составляло 128 ±17 кл/ммІ.

Через 72 часа исследования наибольший прирост количества клеток отмечался в опыте с 0,5%-ой концентрацией смеси сГАГ - 304±17 кл/ммІ. Начиная с 1%-ой концентрации смеси сГАГ, прирост количества фибробластов уменьшался и минимальное их количество все также отмечалось в опытной группе с концентрацией 5%-ой смеси сГАГ - 183±21 кл/ммІ. В контроле к этому времени количество фибробластов составляло 247±16 кл/ммІ.

По прошествии 144 часов наблюдалась такая же реакция культуры клеток на образцы смеси сГАГ: максимальный прирост числа фибробластов был в опыте с 0,5%-ой концентрацией смеси сГАГ - 1401±26 кл/ммІ, начиная с 1%-ой концентрации смеси сГАГ прирост количества клеток в лунках уменьшался и достигал минимума в опыте с 5%-ой концентрацией смеси сГАГ - 619±22 кл/ммІ. Численные данные результатов первой серии эксперимента представлены в табл. 1.

За время инкубации до 72 часов включительно изменение морфологии клеток не выявлено. По истечении 144 часов в опытных образцах с концентрациями 3%-ов и 5%-ов смеси сГАГ в растворе отмечались следующие особенности: фибробласты были уменьшены в размере, уменьшилось количество отростков, происходило сморщивание клеток и сглаживание контуров ядер, в культуре определялись фрагменты разрушенных клеток.

На этом первая серия эксперимента была прекращена, так как в контрольной и опытной группе с 0,5%-ой концентрацией смеси сГАГ образовался сплошной монослой из клеток, что затрудняло дальнейшее исследование динамики роста.

Во второй серии эксперимента с исследованием гелевой формы смеси сГАГ через 24 часа максимальный прирост количества клеток наблюдался в опыте с 0,5%-ой концентрацией активного вещества - 250 ±17 кл/ммІ, уменьшение прироста числа фибробластов наблюдалось в опыте с 1%-ой концентрацией смеси сГАГ - 143 ±18 кл/ммІ, а минимальное количество клеток отмечалось в образце с 5%-ой концентрацией смеси сГАГ - 130 ±10 кл/ммІ.

Через 72 часа инкубации сохранялась тенденция количественного прироста клеток в группах: максимальное число 705 ±16 кл/ммІ - в опыте с 0,5-ой% концентрацией смеси сГАГ в геле, уменьшение прироста числа фибробластов наблюдалось в образце с 1%-ой концентрацией - 402 ±15 кл/ммІ, минимальный прирост клеток отмечался в образце с 5%-ой концентрацией активного вещества в геле - 400 ±13 кл/ммІ.

Через 96 часов при сохранившейся тенденции прироста числа клеток отмечали: максимальное количество фибробластов 810 ±10 кл/ммІ - в опыте с 0,5%-ой концентрацией смеси сГАГ в геле, уменьшение прироста количества фибробластов в опыте с 1%-ой концентрацией - 607±16 кл/ммІ, минимальный прирост клеток отмечался в образце с 5%-ой концентрацией активного вещества в геле - 470 ±14 кл/ммІ. Численные данные результатов второй серии эксперимента представлены в табл. 2.

При оценке морфологии клеток в течение 72 часов никаких изменений выявлено не было ни в контрольных группах, ни в образцах с различными концентрациями смеси сГАГ в геле. Однако, как и на конечном этапе эксперимента с растворами смеси сГАГ, в данной серии через 96 часов в образцах с гелевой формой смеси сГАГ с концентрациями 3% и 5% отмечалось уменьшение размеров фибробластов, с уменьшением количества их отростков и сглаживанием контуров ядра, и также в культуре выявлялись фрагменты разрушенных клеток.

Дальнейший эксперимент был прекращен, вследствие образования монослоя в контрольной и опытной группе с 0,5%-ой концентрацией смеси сГАГ в геле и затруднением подсчета прироста клеток.

Таким образом, в результате проведения двух серий эксперимента in vitro выявлены регуляторные свойства смеси сГАГ: низкие концентрации (0,1%, 0,5%) активного вещества сГАГ стимулируют пролиферацию фибробластов в культуре, а высокие концентрации (1% - 5%) смеси сГАГ угнетают пролиферацию клеток, что говорит о бимодальном эффекте (Хилькин А.М., Шехтер А.Б. с соавт., 1976), заключающимся в противоположном воздействии различных концентраций активного вещества на систему или ткань. Концентрации 3% и 5%-ой смеси сГАГ в растворе и в геле на поздних стадиях инкубации вызывают отсроченный цитотоксический эффект в виде появления в культуре фрагментов разрушенных клеток.

Гелевая форма смеси сГАГ сохраняет бимодальность действия различных концентраций на культуру фибробластов. При этом гелевая форма значительно удобнее (технологичнее) для применения во время хирургических операций и обеспечивает пролонгацию действующего вещества. Это позволило проведение дальнейшего исследования только гелевой формы с антипролиферативными концентрациями смеси сГАГ in vivo.

Таблица 1. Плотность фибробластов мыши линии L929 (кл/ммІ) в зависимости от времени инкубации с исследуемыми образцами растворов сГАГ (М±m)

Время инкубации	Поли-стирол	0,1%	0,5%	1%	2%	3%	5%
24 ч	128±17	123±16	185±20	135±14	104±17	116±5	97±10
72 ч	247±16	275±16	304±17	204±25	190±16	202±4	183±21
144 ч	1228±22	1099±25	1401±26	1000±22	870±18	664±21	619±22

Таблица 2. Плотность фибробластов мыши линии L929 (кл/ммІ) в зависимости от времени инкубации с исследуемыми образцами гелей сГАГ (М±m)

Время инкубации	0% контроль	0,1%	0,5%	1%	2%	3%	5%
24 ч	183±15	220±26	250±17	143±18	170±18	202±8	130±10
72 ч	470±9	500±20	705±16	402±15	515±21	513±13	400±13
96 ч	784±16	790±18	810±10	607±16	599±15	602±19	470±14

Результаты эксперимента по изучению антипролиферативного действия гелевой формы смеси сГАГ in vivo

На основании результатов эксперимента in vitro для экспериментально-морфологического исследования были выбраны концентрации смеси сГАГ в гелевой форме с антипролиферативным действием (1% и 2%) без цитотоксического эффекта и максимальная антипролиферативная концентрация (5%) с проявлением отсроченного цитотоксического действия.

Результаты объективных методов исследования. В первые сутки в опытных и контрольных группах клиническая картина всех прооперированных глаз была схожей: отмечалась инъекция глазного яблока в зоне операции, швы конъюнктивы были адаптированы. К 7-м суткам все наблюдаемые глаза были практически спокойны. На протяжении всего срока наблюдения роговица, влага передней камеры оставались прозрачными; глубина передней камеры была средней; радужка оставалась структурной, зрачок округлым в центре; хрусталик был прозрачный; рефлекс с глазного дна оставался розовым (диск зрительного нерва был неизменен, сосуды соразмерны). Признаков внутриглазной гипертензии или гипотонии не было.

Результаты морфологических исследований

Срок наблюдения 1 неделя. При гистологических исследованиях глазных яблок в контрольной группе 1 (модель НГСЭ без введения веществ) отмечали умеренное количество клеточных элементов, среди которых преобладали фибробласты, что соответствовало реакции ткани на оперативное вмешательство, края иссеченных волокон склеры, выступающие в ИСП, были разнонаправленные.

В контрольной группе 2 (модель НГСЭ с введением геля) наблюдали аналогичную морфологическую картину. Отличия касались качественного состава клеточной инфильтрации в окружающих операционную зону тканях: по сравнению с контрольной группой 1, было отмечено чуть бомльшее количество макрофагов и эозинфилов, что может быть расценено как незначительная реакция на гель. Однако их количество свидетельствовало об отсутствии выраженности воспаления и подтверждало интактность самого геля.

В опытной группе 1 (модель НГСЭ с введением 1%-ой концентрации смеси сГАГ в геле) стенки ИСП были без разволокнения, наблюдали минимальную воспалительную реакцию (практически отсутствие клеточной инфильтрации стенок ИСП, нет макрофагов и эозинофилов, малое количество активных форм фибробластов).

Достоверных различий при применении 1% и 2% концентраций смеси сГАГ как на сроке 1 неделя, так и в последующем замечено не было.

Срок наблюдения 3 недели. В контрольной группе 1 отмечали созревание коллагеновых волокон, неоангиогенез и отсутствие ИСП. Клеточная реакция свидетельствовала о сохранении пролиферативной активности фибробластов.

Во 2-ой контрольной группе отмечали удлинение сроков сохранения ИСП по сравнению с контрольной группой 1: частичное сохранение ИСП с продолжающимися фибробластическими процессами и неоангиогенезом.

В опытной группе 1 и 2 (с введением 1%-ой и 2%-ой концентрации смеси сГАГ в геле соответственно) ИСП сохранялась или отмечалось ее частичное замещение новообразованной тканью. Новообразованная ткань была представлена единичными тонкими "паутинообразными" волокнами, практически с отсутствием клеточного компонента.

Срок наблюдения 6 недель. В контрольной группе 1 наблюдалось формирование грубого рубца с деформацией поверхностного склерального лоскута.

В контрольной группе 2 наблюдали полную резорбцию геля и образование рубца склеры аналогично 1-ой контрольной группе, с умеренной воспалительной инфильтрацией по ходу ИСП, иногда с сохранением объема тканей.

В опытной группе 1 и 2 - зона сформированной ИСП была пористой, пронизана тонкостенными капиллярами, окруженными рыхлой волокнистой соединительной тканью. Наружный склеральный лоскут и прилежащая конъюнктива были разрыхлены. Степень зрелости коллагеновых волокон была низкой, об этом свидетельствовала меньшая интенсивность окраски фуксином соединительной ткани в этой зоне по методике Ван Гизона.

Результаты гистологических исследований реакции склеральной ткани в 3-й опытной группе (5% сГАГ)

Срок наблюдения 1 неделя. В опытной группе 3 реакция на оперативное вмешательство практически отсутствовала - отмечались единичные клетки воспаления, четкое отграничение иссеченной склеры.

В склере, формирующей внутреннюю стенку ИСП, отмечали интерстициальный отек, распространяющийся на 1/3 оставшейся ее толщины. Отек вызывал набухание отдельных волокон и нарушение их упорядоченного линейного хода. Отмечалась четкая граница между деструктуризированной и неизмененной частью склеры. Деструктуризация приводила к появлению бесклеточных участков разрыхления склеры, с чередующимися очагами клеточной активности в уплотненных фрагментах.

Срок наблюдения 3 недели. Структура ИСП была не однородна, отмечалось ее частичное замещение с обилием новообразованных сосудов, способствовавших сохранению отечности. При этом стенки новых сосудов не были полноценными и любое повреждение вызывало кровоизлияние.

Срок наблюдения 6 недель. Исходное гиперосмотическое состояние с отеком ткани, наблюдаемое в ранние сроки эксперимента, привело к нарушению фибробластических процессов и неравномерному замещению послеоперационной полости: участки уплотнения с формированием рубца и врастанием сосудов сменялись рыхлой волокнистой тканью, что проявлялось деформацией зоны операции. В участках разрыхления умеренный клеточный инфильтрат свидетельствовал о незавершенности (продолжении) фибробластического процесса.

Таким образом, в результате эксперимента in vivo доказано антипролиферативное действие смеси сГАГ в гелевой форме в концентрациях 1% и 2%, проявляющееся в длительном сохранении ИСП и замещением ее на рыхлую волокнистую соединительную ткань, проросшую новообразованными сосудами, что расценено как положительный результат. При этом данные концентрации смеси сГАГ на протяжении всего эксперимента не выявили токсического действия на ткани.

Установлено, что 5% концентрация смеси сГАГ в эксперименте in vivo также как и in vitro обладала цитотоксичностью, которая проявилась в виде гиперосмотического состояния тканей с разрушением клеток и с нарушением фибробластических процессов при заживлении. Это приводило к неравномерному замещению созданной интрасклеральной полости фрагментами одновременно плотной и рыхлой соединительной тканью, несмотря на выраженный антипролиферативный эффект.

Выводы

1. Оригинальная смесь сГАГ, состоящая из кератансульфата и хондроитин-4,6-сульфатов, в растворе in vitro обладает различным эффектом на пролиферацию фибробластов мыши линии L929: в низких концентрациях сГАГ (0,1-0,5%) стимулирует пролиферацию клеток, в высоких концентрациях смесь сГАГ (1-5%) подавляет фибробластические процессы, что является бимодальным эффектом.

2. Изменение формы смеси сГАГ с раствора на гель в эксперименте in vitro сохраняет бимодальность эффекта влияния на пролиферацию фибробластов: в низких концентрациях смесь сГАГ (0,1-0,5%) усиливает пролиферацию, в высоких концентрациях смесь сГАГ (1-5%) - подавляет.

3. Разработан способ доставки гелевой формы смеси сГАГ с использованием оригинального устройства для дозирования, которое позволяет вводить необходимое количество вещества в зону хирургического вмешательства, рассчитанное в зависимости от размеров формируемой интрасклеральной полости, а также дает возможность сохранить активность и стерильность вещества. Гелевая форма более технологична при хирургических вмешательствах.

4. Эффективными антипролиферативными свойствами обладает гелевая форма смеси сульфатированных гликозаминогликанов с диапазоном концентраций от 1% до 2%, которые в эксперименте на модели заживления хирургической склеральной раны у кроликов подтвердили свои свойства. Данный диапазон концентрации может быть рекомендован для дальнейших клинических исследований.

5. Высокие концентрации смеси сГАГ (3-5%) обладают отсроченным цитотоксическим эффектом, проявляющимся в виде изменений в морфологии фибробластов и частичного разрушения клеток in vitro, способны вызывать в тканях гиперосмотическое состояние с явлениями интерстициального отека и постепенным разрушением клеток в прилегающих тканях in vivo, с последующим нарушением фибропластических процессов в ране.

Практические рекомендации:

1. Гелевая форма оригинальной смеси сульфатированных гликозаминогликанов, представленных хондроитин-4,6-сульфатами и кератансульфатом, экстрагированных из прозрачных роговиц сельскохозяйственных животных, в диапазоне концентрации от 1% до 2%, обладает антипролиферативными свойствами и может быть использована в качестве средства для профилактики избыточного рубцевания в зоне хирургически сформированных путей оттока внутриглазной жидкости при антиглаукомных операциях.

2. Применение оригинального устройства для дозирования гелевой формы смеси сГАГ позволит рационально расходовать используемое вещество с введением необходимого количества смеси, в зависимости от размеров интрасклеральной полости, с сохранением активности и стерильности вещества.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Горбунова К.С., Новиков С.В., Шацких А.В., Тахчиди Е.Х. Антипролиферативное действие комплекса сульфатированных гликозаминогликанов при ранозаживлении склеры // Материалы научно-практической конференции "Актуальные проблемы офтальмологии". Сборник научных трудов. - Москва.- 2011. - С.79-81.

2. Тахчиди Х.П., Тахчиди Е.Х., Новиков С.В., Шацких А.В., Горбунова К.С. Интраоперационная профилактика рубцевания при антиглаукомных операциях в эксперименте in vivo // Сборник научных статей IX международной конференции Глаукома: теориии, тенденции, технологии HRT клуб Россия - 2011. - С. 322-326.

3. Тахчиди Х.П., Новиков С.В., Шацких А.В., Тахчиди Е.Х., Горбунова К.С. Особенности функционального значения комплекса cульфатированных гликозаминогликанов в регулировании пролиферации фибробластов in vitro // Морфология. - 2012. -Т. 142. - №5. - С. 49-54.

4. Novikov S.V., Shatskikh A.V., Takhchidi E. Kh., Gorbunova K.S. Sulfated glycosaminoglycan (sGAG) mixture - a new anti-scarring agent for glaucoma surgery // 2012 European Glaucoma Society Congress Abstracts and posters: http://www.oic.it/~egscopenaghen2012/posters/june20/P5.16/poster.pdf [Электронный ресурс]

5. Тахчиди Х.П., Новиков С.В., Шацких А.В., Тахчиди Е.Х., Горбунова К.С. Перспективность использования естественных регуляторов для профилактики избыточного рубцевания при антиглаукомных операциях (обзор литературы) // Практическая медицина. - 2012. - Т. 1. - № 59. - С. 150-153.

6. Тахчиди Х.П., Тахчиди Е.Х., Новиков С.В., Шацких А.В., Горбунова К.С. Интраоперационная профилактика рубцевания при моделировании непроникающей глубокой склерэктомии в эксперименте in vivo // Офтальмохирургия. - 2012. - №4. С. 556-60.

7. Тахчиди Е.Х., Горбунова К.С. Применение сульфатированных гликозаминогликанов в офтальмологии // Вестник ОГУ.- 2012. - № 12 (148) - С. 201-204.

8. Takhchidi E., Novikov S., Shatskikh A., Gorbunova K. The antiproliferative effect of sulfated glycosaminoglycans mixture in vitro // SOE 2013 Congress. Abstract book. - Copenhagen. - Р. 92.

9. Gorbunova K., Takhchidi E., Shatskikh A., Novikov S. The antiproliferative effect of sulfated glycosaminoglycans mixture for scleral wound healing in vivo // SOE 2013 Congress. Abstract e-book. - Copenhagen. - Р. 93.

Размещено на Allbest.ru

...