Биологическая характеристика клебсиелл, выделенных от бройлеров

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биологическая характеристика клебсиелл, выделенных от бройлеров

В настоящее время серьёзной проблемой промышленного птицеводства являются массовые желудочно-кишечные и респираторные болезни, вызываемые различными ассоциациями бактериальных агентов.

Одним из ведущих агентов вызывающих такие заболевания у бройлеров, являются клебсиеллы. В настоящее время недостаточно сведений о биологических, культуральных характеристиках микроорганизма этого рода, выделяемых от бройлеров (Ковалёва Е.П., Рейзис А.П., 1993).

Материалы и методы исследований. Культуральные свойства выделенных микроорганизмов изучали в процессе выращивания на плотных и жидких питательных средах. Особое внимание обращали на форму, величину, структуру и консистенцию колоний. Серологическию типизацию изолятов проводили в РА, по общепринятой методике с типа специфическими сыворотками, изготовленными фирмой «Илья Мечников» НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской АМН. Гемолитическую активность определяли на МПА с добавлением 5% дефибринированной крови различных видов животных. Токсигенность выделенных культур проводили методом биотестирование на инфузориях рода стилонихии и по тесту отёка лапки белых мышей.

Результаты исследований. Морфокультуральные и биохимические свойства изучили у 257 выделенных от птиц культур клебсиелл. При микроскопии клебсиеллы представляли собой грамотрицательные палочки с закруглёнными концами, длина и толщина которых колебалась от 0,6 до 6 мкм и от 0,3 до 1,5 мкм, соответственно, располагающиеся единично, парами или короткими цепочками. Все выделенные культуры имели капсулу. Однако после длительного культивирования на питательных средах некоторые штаммы (15,2% или 39 культур) теряли способность к капсулообразованию, другие, наоборот, сохраняли капсулу в течение всего срока исследований. Восстановление капсул отмечали после пассирования клебсиелл через углеродсодержащие среды (МПБ с 2% содержанием сахаров: глюкозы, лактозы, сахарозы) или организм лабораторных животных (белые мыши).

Все выделенные от бройлеров культуры клебсиелл хорошо росли в аэробных условиях на обычных питательных средах при температуре от 20⁰С до 43⁰С, при рН от 5,5 до 8,2. Оптимальная температура роста 37 -38⁰ С, оптимум рН - 7,2- 7,4.

При культивировании клебсиелл на МПБ наблюдалось интенсивное помутнение среды с одновременным образованием слизистого осадка. Некоторые штаммы (77% или 197 культур) образовывали пристеночное кольцо и плёнку, что свидетельствует о наличии у них фимбрий.

На МПА клебсиеллы формировали круглые, блестящие колонии беловато-серого цвета, диаметром 1, 0 - 3,0 мм, в слизистые в 54,9% случаев.

На висмут-сульфит агаре все изученные культуры клебсиелл формировали блестящие круглые колонии коричневые (у 89,1% - 228 культур), или прозрачные, как слизистые (57,6% - 148 культур), так и не слизистые (42,4 % или 109 изолятов), размерами от 0,3 до 2,5 мм. Штаммы K. rhinoscleromatis и K. ozaenae формируют выпуклые, гладкие колонии S формы, а K. oxytoca - плоские и шероховатые - R формы.

На агаре Эндо в большинстве случаев - 252 культуры (98,1%) росли колонии малинового цвета различной интенсивности - лактозапозитивные штаммы и 7 культур (1,9%) образовывали колонии розового цвета - лактозанегативные штаммы. Все культуры K. oxytoca формировали колонии бледно-розового цвета - то есть не ферментировали лактозу. Диаметр колоний 24 часовых культур на среде Эндо варьировал от 0,5 до 2 мм.

Все культуры клебсиелл, изолированные от бройлеров продуцировали 5-аминосалицилатдекарбоксилазу. На специализированной дифференциальной питательной среде «КЛЕБСИЕЛЛА 5-АСК-20», образовывали вокруг колоний широкую зону чёрно-коричневого цвета - в результате образования пара-аминофенола.

На 5% кровяном агаре с дефибринированной крови барана K. oxytoca образовывала круглые блестящие неслизистые колонии серовато-белого и серовато-желтого цвета, диаметром 1,7 - 7,0 мм, а K. rhinoscleromatis, K. ozaenae - слизистые серого цвета, диаметром 0,8 - 4,5 мм.

Все колонии клебсиелл на скошенном агаре были прозрачны в проходящем свете и имели розово-дымчатый или оранжево-дымато-зеленоватый тип свечения.

Культуры клебсиелл выделенные от бройлеров обладали высокой биохимической активностью (таблица 1).

Как видно из данных таблицы 1, все культуры K. rhinoscleromatis сбраживали глюкозу, маннит, инозит, сорбит, арабинозу и мальтозу, 88,9% культур ферментировали сахарозу, 99,2% давали положительную реакцию с малонатом натрия и 100% культур - отрицательную с цитратом натрия. 91,7% культур K. rhinoscleromatis отрицательно реагировали с цитратом натрия с глюкозой, 100% - не продуцировали индол и сероводород, не обладали уреазной активностью.

K. ozaenae в 25% положительно реагировала с цитратом натрия и продуцировала лизиндекарбоксилазу, 75% культур обладали ферментативной активностью в отношении лактозы и сахарозы, 50% продуцировали в-галактидазу и сбраживали сорбит, 25% - инозит, с образованием кислоты.

Культура K. oxytoca, выделенная от бройлеров, отрицательно реагировала в тесте с малонатом натрия, продуцировала индол, в - галактидазу и ацетилметилкарбинол, обладала уреазной активностью, активно ферментировала сахара.

Серологический профиль клебсиелл определяли по типу капсульного антигена.

Для стимуляции капсулообразования клебсиелл культивировали на агаровой среде Ворфеля - Фергюсона в течение 24 часов. Серологическую идентификацию проводили в реакции агглютинации на стекле, смешивая 10 мкл смыва агаровых культур в концентрации 10¹⁰ - 10¹¹ кл/мл в физиологическом растворе рН - 7,2 с 30 мкл агглютинирующей капсульной сыворотки.

В результате проведенных исследований установили, что все 252 культуры K. rhinoscleromatis (100%) относились к серогруппе К - 5, 75% культур K. ozaenae - к К - 68 и 25% - к К - 25. Культура K. oxytoca - к сероварианту К - 70 (таблица 2).

Таблица 1

Ферментативная характеристика клебсиелл выделенных от бройлеров.

Наличия двух и более типов К-антигена у изученных клебсиелл не выявили.

Таблица 2

Антигенная структура клебсиелл, выделенных от бройлеров. n=257

Ферментативная активность клебсиелл различных сероваров одного вида различалась: Культуры K. ozaenae, отнесённые к серологическому варианту К - 68, в отличие от серологического типа К - 25, отрицательно реагировали с цитратом натрия, не продуцировали лизиндекарбоксилазу и не сбраживали инозит, но активно ферментировали лактозу и сахарозу. Таким образом, культуры клебсиелл, выделенные от бройлеров обладали значительной вариабельностью морфологических, культуральных и биохимических свойств, но имели узкий спектр сероваров.

Патогенность выделенных от птиц изолятов клебсиелл определяли на беспородных белых мышах, весом 18 - 20 грамм, при внутрибрюшинном заражении смывами агаровых суточных культур и бульонными 24-часовыми культурами в объеме 0,5 мл/ мышь. Установили, что все выделенные из инкубационных яиц, замерших эмбрионов, вынужденно убитых и павших цыплят бройлеров и взрослой птицы культуры клебсиелл патогенны для белых мышей. Гибель животных вызывали как суточные агаровые, так и бульонные культуры. При внутрибрюшинном заражении смывами агаровых культур гибель мышей регистрировали через 18-24 часа. В более короткие сроки животные гибли после введения бульонной культуры (5 - 7 часов), что, по нашему мнению, свидетельствует о наличии экзотоксина. У большинства выделенных штаммов клебсиелл (241 культура или 93,8%) LD₅₀ находилась в пределах 400-600 млн. м. т./мышь, 16 культур или 6,2% были более вирулентны - LD₅₀ - 200-250 млн. м. т./мышь. Слизистые культуры K. rhinoscleromatis, K. ozaenae обладающие мощной капсулой, оказались более вирулентными по отношению к белым мышам, чем бескапсульные K. oxytoca. При заражении минимальными дозами (50 млн. м. т./мышь), гибель мышей регистрировали через 10-14 дней. Оставшиеся в живых животные в течение 18-20 дней являлись бактерионосителями - при убое мышей по истечении указанного срока из крови, печени и селезёнки выделяли исходные культуры клебсиелл в концентрации 10² - 10³ КОЕ/мл.

Одним из факторов патогенности клебсиелл, является цитотоксичность (гемолитическая активность). Гемолизины состоят из полипептидов и липополисахаридов, обладающих способностью лизировать эритроциты различных видов животных.

Изучение гемолитической активности 257 штаммов клебсиелл выделенных от бройлеров (таблица 3), проводили на 2% мясопептонном агаре с добавлением 1% глюкозы и 5% дефибринированной крови наиболее часто применяемых в лабораторной практике видов животных: барана, кролика, морской свинки. Предварительно культуры клебсиелл различных видов в течение 18-20 часов культивировали на бульоне Хоттингера.

Как свидетельствуют данные, приведенные в таблице 3, при использовании дефибринированной крови барана 100% культур клебсиелл проявляли гемолитическую активность, 79 культур (30,7%) продуцировали в- гемолизины, а 178 культур (69,3%) - б - гемолизины.

Гемолитической активностью по отношению к эритроцитам кролика обладали 184 культуры или 71,5%, формируя вокруг колоний зону б - гемолиза, а 73 культуры или 28,5% не проявляли гемолитической активности к эритроцитам этого животного. Не одна из изучаемых культур клебсиелл не гемолизировала эритроциты морской свинки.

Таблица 3

Гемолитическая активность рода Klebsiella, выделенных от бройлеров.

Примечание: в числителе - количество культур; в знаменателе - % соотношения.

клебсиелла биохимический серологический гемолитический

Исходя из результатов, полученных при изучении гемолитической активности культур клебсиелл выделенных от птиц, можно сделать вывод, что на агаре с использованием 5% дефибринированной крови барана гемолитическая способность клебсиелл выражена более интенсивно (в и б гемолиз). При использовании агара с добавлением 5% дефибринированной крови кролика гемолитическуя активность у клебсиелл менее выражена (б и г гемолиз), а в отношении эритроцитов морской свинки гемолитическая активность не проявлялась г гемолиз.

Способность к токсинообразованию, по мнению ряда исследователей (Бондаренко В.М. и др., 1986; Jhanjee A., Asnani P., 1982; Kahlich R. et al., 1982; Ivanof A. et al., 1983), является одним из основных факторов патогенности клебсиелл.

Продукцию экзотоксинов у изучаемых культур определяли по тесту отека лапки на белых беспородных мышках.

Установили, что при введении фильтрата 12,4% (32 культуры) клебсиелл масса лапы мыши вследствие её отёка увеличилась на 20 - 34 мг - слаботоксичные штаммы. Количество умеренно токсичных возбудителей было больше - 36,2% или 93 культуры, при введении фильтратов которых масса лапы мышки увеличивалась на 38 - 62 мг и 8,6% - 22 культуры -высокотоксичные штаммы, масса лапки мышки увеличивалась на 66 - 97 мг; Экзотоксигенная активность отсутствовала у 110 протестированных культур, или 42,8%, при введении фильтратов этих культур клебсиелл увеличение массы лапы мышки было менее 12 мг.

Таким образом, установили, что экзотоксины продуцировало 57,2% или 147 культур выделенных от бройлеров клебсиелл.

Максимальное накопление токсинов в фильтратах культур клебсиелл отмечали на 3-5 сутки культивирования.

Биотестирование общей токсигенности выделенных клебсиелл проводили на инфузориях стилонихиях.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что 64,6% или 166 культур Klebsiella способны продуцировать токсины, то есть 7,4% или 19 культур кроме экзотоксина продуцировали токсины других типов.

Процент погибших стилонихий после контакта со средой культивирования Klebsiella, продуцирующих гемолизины и токсины - 41,7. Количество лизированных инфузорий после контакта со средой культивирования Klebsiella, продуцирующие только гемолизины было в 1, 76 раз ниже и равнялось 23,7%.

Антилизоцимный признак у клебсиелл способствует подавлению фагоцитоза, а также сохранению и возможно, размножению обладающих им штаммов в фаголизосоме. Установлено, что антилизоцимный фактор участвует в инфекционном процессе и с полным основанием, может быть причислен к факторам патогенности. При наличии штаммов такого типа у больных наблюдается более тяжёлое течение заболевания и более длительное выделение возбудителя (Бондаренко В.М., Петровская В.Г., Потатуркина-Нестарова Н.И., 1996).

При изучении антилизоцимной активности клебсиелл экспресс - методом на плотной питательной среде установили, что все 257 (100%) выделенные от птиц культуры клебсиелл обладали антилизоцимной активностью. Средняя величина АЛА клебсиелл составила - 4,9 ± 0,2 мкг (концентрация лизоцима мкг/мл).

Анализируя полученные результаты можно констатировать, что 64,6% выделенных от бройлеров культур клебсиелл обладали токсигенной и 100% - антилизоцимной и гемолитической активностью.

Размещено на Allbest.ru