Транскриптомная активность эстроген-регуляторных генов при малигнизации тканей тела матки

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

По данным ВОЗ в 2014 году во всем мире было зафиксировано около 320 тысяч новых случаев рака тела матки, что ставит данную патологию на шестое место по распространенности среди онкологических заболеваний у женщин в развитых странах. Ведущую роль в патогенезе данного заболевания играет гиперэстрогения эндогенного или экзогенного происхождения. Эстрогены стимулируют пролиферацию клеток, индуцируя синтез факторов роста и их рецепторов, в том числе и эстрогеновый рецептор б типа (ERб или ESR1). Увеличение концентрации эстрогенов может приводить к гиперплазии тканей эндометрия, которая, несмотря на свою обратимость, способна прогрессировать в атипический вариант, предрасположенный к перерождению в рак.

Ещё одним важным элементом патогенеза гормонозависимого рака является образование эстрогенов из андрогенов, катализируемое микросомальным, НАДФН-зависимым ферментом - цитохромом Р450 19-го семейства (ароматазой). Ген, кодирующий цитохром P-450 ароматазу известен как CYP19 (15q21.2).

Эффект эстрогенов на клетку реализуется через их взаимодействие с рецепторами, которые, в свою очередь, активируют гены-мишени во многих тканях. Идентифицировано два вида эстрогеновых рецепторов - ER: б и в. Показано, что повышенная экспрессия ERб (ESR1) сопровождает процессы трансформации во многих тканях, тогда как ERв (ESR2) играет ключевую роль в регуляции митотической активности, обеспечивая защиту от ERб-индуцированной гиперпролиферации. Показано, что содержание ERб может измениться в ответ на повышение концентрации эстрогенов, что, в свою очередь, приводит к усилению пролиферации в тканях-мишенях. Одним из механизмов этого процесса может быть увеличение активности ароматазы.

Метаболическая активация эстрадиола также является ключевым фактором в канцерогенезе эндометрия. Цитохромы Р450 1А1 (CYP1A1) и Р450 1В1 (CYP1B1) катализируют гидроксилирование 17-бета-эстрадиола (Е2) в С-2 и С-4 положении соответственно. 4-гидрокси эстрогены (метаболиты CYP1B1) получили особое внимание из-за их важной роли в злокачественной трансформации различных органов, включая эндометрий, в котором CYP1B1 показывает высокий уровень экспрессии.

Целью нашего исследования стало изучение изменения экспрессии генов ответственных за рецепцию эстрогенов и метаболизм стероидов: CYP1A1, CYP1B1, CYP19A, ESR1, ESR2, GPER, STS и SULT1E1 при малигнизации тканей тела матки для расширения представлений о молекулярных механизмах этого процесса.

Для исследования относительной экспрессии генов послужили опухолевые и условно здоровые ткани матки 27 пациенток Юга России в возрасте 38-72 лет с гистологически подтвержденным диагнозом рак тела матки, поступивших на лечение в РНИОИ ФГБУ МЗ РФ в 2014 - 2015 гг.

Фрагменты тканей гомогенизировали в жидком азоте и проводили экстракцию суммарной РНК по методу P. Chomczynski и N. Sacchi. Полученные препараты РНК обрабатывали ДНКазой («Синтол», Россия) для удаления следов геномной ДНК. Синтез кДНК проводили с использованием коммерческих наборов «Reverta-L» («Интерлабсервис», Россия).

Методом RT-qPCR проводили определение относительной экспрессии 8 генетических локусов, ответственных за рецепцию и метаболизм эстрогенов: CYP1A1, CYP1B1, CYP19A, ESR1, ESR2, GPER, STS и SULT1E1. Дизайн праймеров для RT-qPCR осуществляли с использованием референтных последовательностей ДНК NCBI GenBank. В качестве референтного гена использовали ген ACTB.

RT-qPCR проводили в 25 мкл ПЦР-смеси, содержащей 12 нг кДНК, 0,25мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCl2, 1х ПЦР-буфер и 1 ед.акт. SynTaq ДНК-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами («Синтол», Россия), краситель EVA-Green (Ч1) и по 400 нМ прямого и обратного праймеров для референтного гена (актина, ACTB) или гена-мишени. RT-qPCR проводили на термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). Относительную экспрессию генетического локуса (RЕ) рассчитывали по формуле RЕ=2-ДДCt.

Далее вычисляли медиану RЕоп опухолевых образцов и медиану RЕк контрольных (условно нормальная ткань) для каждого генетического локуса и рассчитывали соотношение относительной экспрессии генов в опухолевой ткани по отношению к нормальной ткани: RЕоп / RЕк.

Статистический анализ выполняли с использованием прикладных пакетов программ Microsoft Excel 2013 и STATISTICA 8.0. Оценку различий проводили с использованием критерия Манна-Уитни для порогового уровня статистической значимости р<0.05.

В ходе проведенного исследования обнаружено статистически достоверное увеличение экспрессии гена ESR1 на 124% (p<0,05) в опухолевой ткани по сравнению с условно здоровой тканью тела матки у пациенток в возрасте от 38 до 72 лет, что подтверждает данные о связи гиперэкспрессии гена ESR1 с процессами онкотрансформации клеток. Достоверного изменения экспрессии других генетических локусов в данной выборке обследуемых (38 - 72 лет) не обнаружено.

В группе пациенток от 38 до 55 лет обнаружено достоверное увеличение экспрессии гена SULT1E1 на 200% (p<0,005), а в группе пациенток старше от 56 до 72 лет обнаруживается достоверное повышение экспрессии гена ESR1 на 124% (p<0,005) в опухолевой ткани по сравнению с условно здоровой тканью тела матки.

Следовательно, наблюдаемый эффект гиперэкспрессии гена ESR1 в выборке пациенток возрастом 38-72 лет обеспечивается особенностями экспрессии данного гена у пациенток старше 55 лет, что свидетельствует о важной роли повышенной транскрипционной активности гена ESR1 в малигнизации тканей матки в постменопаузе и о возможности использования данного параметра в качестве биомаркера у возрастной группы пациенток старше 55 лет. эндогенный матка канцерогенез метаболический

Дробление имеющейся выборки по стадиям дифференцировки клеток опухолей на G 1, 2 и 3 группы дало следующие результаты: у группы пациенток с аденокарциномой тела матки стадии G1 в возрасте 63-68 лет обнаружено достоверное (p<0,005) увеличение экспрессии генов CYP1A1, CYP1B1, CYP19A, ESR1, ESR2, GPER, STS и SULT1E1 на 1820%, 420%, 737%, 198%, 174%, 54%, 746% и 412% соответственно в опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной, у группы пациенток с аденокарциномой тела матки стадии G2 в возрасте 38-72 года отсутствовали достоверные различия в экспрессии исследованного паттерна генов опухолевой ткани по сравнению с условно нормальной, а у группы пациенток с аденокарциномой тела матки стадии G3 в возрасте 56-63 года наблюдалось достоверное (p<0,005) увеличение экспрессии генов CYP19A на 72%, ESR2 на 98%, GPER на 50%, STS на 130% и SULT1E1 на 110%.

Следует отметить, что все пациентки с аденокарциномой тела матки стадии G1 были старше 55 лет, также как и пациентки с аденокарциномой тела матки стадии G3, у которых наблюдалась менее значительное по модулю увеличение экспрессии генов CYP19A, ESR2, GPER, STS и SULT1E1. Возрастной спектр пациенток группы с аденокарциномой тела матки стадии G2 охватывает более широкий диапазон, что отражается и в особенностях транскрипционного профиля исследованных генов. Так, ранжирование выборки пациенток с аденокарциномой тела матки стадии G2 (n=14) по возрастному критерию показало, что в группе пациенток от 38 до 55 лет наблюдается достоверное (p<0,05) увеличение экспрессии генов CYP1A1, GPER, STS и SULT1E1 на 640%, 240%, 100% и 200% соответственно, а в группе пациенток от 56 до 72 лет наблюдается достоверное увеличение экспрессии только гена ESR1 на 110% (p<0,05) в опухолевой ткани по сравнению с условно здоровой тканью тела матки.

Таким образом, у группы пациенток с аденокарциномой тела матки стадии G1, G2 (до 55 лет) и G3 обнаружено увеличение транскрипционной активности генов ответственных за гидроксилирование эстрадиола в С-2 и С-4 положении (CYP1A1 и CYP1B1), образование эстрогенов из андрогенов (CYP19A), ответственных за регулирование уровня ядерных рецепторов эстрогенов (SULT1E1 - гены сульфотрансферазы), ESR1 и 2 и мембранных рецепторов эстрогенов (GPER), а также ответственных за преобразование стероидов в их активную форму (ген стероидной сульфатазы, STS).

Отличия экспрессии, описанных выше генов, в опухолевой ткани относительно нормальной ткани тела матки вписываются в теорию локального синтеза эстрогенов, согласно которой нарушение регуляции тканеспецифичного промотора гена ароматазы (увеличение экспрессии гена CYP19A) приводит к усилению активности фермента и повышению концентрации эстрогенов. Это совместно с увеличением экспрессии генов CYP1A1 и CYP1B1, и соответственно активностью кодируемых ими ферментов, приводит к метаболической активация эстрадиола (гидроксилированию) с образованием 2- и 4-гидрокси эстрогенов. В ответ на повышение концентрации эстрогенов меняется экспрессия ESR1 и количество ядерных рецепторов ERб, а также повышается экспрессия гена мембранных рецепторов эстрогена (GPER), что, в свою очередь, приводит к усилению пролиферации в тканях-мишенях. Данному эффекту должно препятствовать повышение экспрессии гена сульфотрансфераза SULT1E1, участвующего в инактивации эстрогенов в тканях-мишенях, путем их сульфатирования. Но наблюдаемое в нашем исследовании повышение экспрессии гена стероидной сульфатазы (STS), осуществляющей гидролиз сульфатов ряда стероидов, преобразуя их в активную форму, является противодействующей силой, направленной на снижение эффекта от транскрипционной активности SULT1E. В этой связи интересен тот факт, что на стадии G1 экспрессия гена стероидной сульфатазы STS в 1,9 раза превышает экспрессию гена сульфотрансферазы SULT1E1, на стадии G2 у пациенток старше 55 лет в 2,5 раза, на стадии G3 всего лишь в 1,1 раза. При этом у пациенток с аденокарциномой матки стадии G2 в возрасте до 55 лет экспрессия гена стероидной сульфатазы STS была в 1,5 раза ниже экспрессии гена сульфотрансферазы SULT1E1. Это подчеркивает как возрастные, так и зависимые от стадии дифференцировки опухолевых клеток особенности метаболизма стероидов в тканях тела матки.

Необходимо также отметить ещё один не мало важный факт, касающийся гиперактивации транскрипции гена GPER на стадии дифференцировки опухолевых клеток G1. На данной стадии экспрессия гена GPER, кодирующего мембранный рецептор эстрогенов, превышает в экспрессию генов ядерных рецепторов эстрогена ESR1 и ESR2 в 5 и 3 раза соответственно. На других стадиях этого эффекта не наблюдается (превышает либо ESR1, либо ESR2), а каждая из этих стадий характеризуется своим определенным соотношением экспрессии генов ядерных и мембранных рецепторов эстрогена.

Полученные данные выявили, что важную роль в процессе малигнизации тканей матки играют гены ответственные за гидроксилирование эстрадиола в С-2 положении (CYP1A1), образование эстрогенов из андрогенов (CYP19A), ответственные за регулирование уровня ядерных рецепторов эстрогенов ESR1 и 2 и мембранных рецепторов эстрогенов (GPER), сульфатирование эстрагенов (SULT1E1 - ген эстрогеновой сульфотрансферазы), а также ответственные за преобразование стероидов в их активную форму (ген стероидной сульфатазы, STS).

В ходе проведенных исследований установлено, что транскрипционная активность этих генов в процессе малигнизации тканей тела матки имеет выраженный возраст - ассоциированный характер, а также зависит от стадии развития онкологического процесса (степени дифференцировки клеток опухоли, G).

Так же, на основании полученных данных, можно сделать вывод о том, что:

1) до 55 лет в опухолевой ткани матки (стадии G2) сульфатирование преобладает над гидролизом сульфатов стероидов;

2) по мере снижения уровня дифференцировки клеток опухолевых тканей уменьшается степень преобладания гидролиза сульфатов стероидов над их сульфатированием;

3) после 55 лет по мере снижения уровня дифференцировки клеток опухолевых тканей уменьшается и экспрессия гена ядерного рецептора эстрогена ESR1.

Размещено на Allbest.ru