Селекция продуцентов витаминов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Микроорганизмы содержат много витаминов, которые чаще всего входят в состав ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств данной культуры микроорганизмов и условий культивирования. Некоторые витамины микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из окружающей среды [1].

Проведение исследований в селекции продуцентов витаминов необходимо, прежде всего, для создания систематических и всеобъемлющих данных о сбалансировании пищевых продуктов. Эти данные на сегодняшний день отсутствуют в базах данных национальных пищевых организаций.

В промышленности витамины получают в основном химическим синтезом. Микробиологическим путем получают всего несколько витаминов: В12 (цианокобаламин), В2 (рибофлавин), витамин С и эргостерин [5].

1. Общая характеристика витаминов

Липман писал: «Врачи любят прописывать витамины, и миллионы людей их принимают, однако потребовалась немалая биохимическая изобретательность, чтобы понять, почему они необходимы и каким образом организма использует их» [4].

Основоположник учения о витаминах русский врач Н.И. Лунин (1880 г.). В 1912 году польский врач К. Функ предложил название «витамины» и пришел к выводу, что такие заболевания, как цинга, рахит, пеллагра, бери-бери -- болезни пищевой недостаточности, или авитаминозы. Отдельные виды животных могут самостоятельно синтезировать те или иные витамины. В то же время многие плесневые и дрожжевые грибы и различные бактерии развиваются на искусственных питательных средах только при добавлении к этим средам вытяжек из растительных или животных тканей, содержащих витамины.

Исследована химическая природа всех известных витаминов. Оказалось, что многие из них встречаются группами по 3--5 и более родственных соединений, различающихся деталями строения и степенью физиологической активности. Было синтезировано большое число искусственных аналогов витаминов с целью выяснения роли функциональных групп. Это способствовало пониманию действия витаминов.

В 1956г. принята единая классификация витаминов, которая стала общеупотребительной.

Особенно широко стали применяться витамины после освоения их промышленного синтеза. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофные организмы. Микробиологическим способом можно получить практически все известные витамины. С помощью микроорганизмов целесообразно получать сложные по строению витамины: в-каротин (провитамин А), В2 , В12 и предшественники витамина D. Однако экономически более целесообразно получать витамины выделением из природных источников или с помощью химического синтеза.

В мире существует 40 крупных промышленных производителей витаминов; 18 из них в США, 8 - в Японии, 14 - в Западной Европе Ведущее место в производстве витаминов занимает швейцарский концерн Hoffman L Roche, выпускающий 50-70% всех витаминов [2].

2. Селекция продуцентов рибофлавина

Рисунок 1. Водорастворимый витамин В2 [6].

Витамин В2 (рибофлавин) получил свое название от сахара рибозы, входящего в состав молекулы витамина в виде многоатомного спирта D-рибита [3].

Среди прокариот известными продуцентами флавинов являются микобактерии и ацетобутиловые бактерии. Из актиномицетов - Nocardia eritropolis. Среди мицелиальных грибов - Aspergillus niger и Eremothecium ashbyi [5].

Синтетический рибофлавин (применяемый в медицине) получают в виде кристаллического продукта деструктивным окислением D-глюкозы (из кукурузного крахмала) в D-apaбоновую кислоту и рядом других операций превращают в конечный продукт -- желто-оранжевые кристаллы высокой степени чистоты.

Витамин В2 содержится в клетках различных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов (прежде всего -соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз - ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штаммы, которые образуют на жидких средах 0,5 г и более рибофлавина в 1 л среды. К подобным организмам относятся Ashbyii gossypii, Eremothecium ashbyii и Candida guilliermondii. Учитывая изменчивость активных продуцентов названных видов по способности синтезировать витамин В2, необходим систематический отбор культур в процессе их эксплуатации на производстве. Обычно активные продуценты первых двух видов формируют яркооранжевые колонии на агаризованных средах.

Методами генной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образующий около 6 г рибофлавина в 1 л среды, включающей мелассу, белково-витаминный концентрат и его гидролизат.

Высокий выход рибофлавина у Е.ashbyii коррелирует с азотом пуринов и другими азотистыми источниками, содержание которых должно быть достаточным. В качестве источников углерода применяют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрожжевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира). Ферментационная среда обычно включает кукурузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщенный жир. Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5- 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов) начинает заметно накапливаться витамин В2, вначале - в мицелии, а затем - в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8%, содержащий 1,5-2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных.

Для Candida guillierniondii важно регулировать содержание железа в питательной среде; оптимальные концентрации колеблются, в среднем, от 0,005 до 0,05 мкг/мл. При этом определенные штаммы дрожжей могут образовывать за 5-7 дней до 0,5 г/л и более витамина. Однако для целей промышленного производства рибофлавина предпочитают использовать более продуктивные виды и штаммы грибов - E.ashbyii и Ashbyii gossypii [2]. Промышленное получение рибофлавина осуществляется химическим, микробиологическим или комбинированным методом: при этом синтезированная микроорганизмами рибоза химически трансформируется в В2 [3].

3. Селекция продуцентов витамина В12

Рисунок 2. Водорастворимый витамин В12 [6].

Витамин В12 - (б-5,6-диметилбензимидазол)-цианкобаламин - это полимер сложного строения, являющийся гематопоэтическим и ростовым фактором для многих животных и микроорганизмов.

Микробиологический синтез является единственным способом получения данного витамина. Способность к синтезу витамина В12 широко распространена среди прокариотических микроорганизмов [3].

Природные продуценты витамина В12 обнаружены среди пропионовокислых бактерий р. Propionibacterium, которые синтезируют от 1 до 8 мг/л этого витамина. С помощью селекционно­генетических методов получен мутант P. shermanii M­82, который дает до 60 мг/л продукта. Продуцент B. rettgerii также используется для микробиологического синтеза В12. Как активные продуценты витамина В12 используются также актиномицеты и родственные микроорганизмы: путем мутаций и ступенчатого отбора получен штамм Nocardia rugosa, накапливающий до 18 мг/л В12. Активные продуценты В12 обнаружены среди представителей Micromonospora. Высокой природной продуктивностью обладают представители метанотрофов Methanosarcina, Methanococcus, среди которых выделен штамм Methanococcus halophilus, обладающий самым высоким среди природных штаммов уровнем продукции - 16 мг на 1 г биомассы. В значительных количествах В12 синтезируют анаэробные бактерии р. Clostridium, что особенно эффективно для технологии. Известны активные продуценты В12 среди Pseudomonas. У P. Denitrificans получен мутант, дающий на оптимизированной среде до 59 мг/л. Штамм запатентован фирмой «Merck» для промышленного получения В12.

Интерес представляют термофильные бациллы B. circulans и B. stearother mophilus, которые дают выход 2-6 мг/л В12.

В России наиболее широкое применение имеют Propionibacterium freudenreichii. Их культивируют на кукурузном экстракте и глюкозе в анаэробных условиях 72 ч для роста культуры. Во 2­й фазе синтеза в ферментер вносят предшественник - специфическое азотистое основание и проводят ферментацию еще 72 ч. Затем экстрагируют В12 [5].

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5-5,0 и температуре 85-90 С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита). Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют коагулянты белка - хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3-4 С из в одноацетонового раствора.

Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью резорцина или фенола, образующих с ним аддукты, которые сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты.

При реализации данного биотехнологического процесса необходимо помнить о высокой светочувствительности витамина В12, поэтому все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или при красном свете). На ацетонобутиловой и спиртовой бардах с добавлением солей кобальта и метанола в нашей стране получают кормовой препарат КМБ 12 - концентрат, содержащий витамин В12 и другие ростовые вещества [2].

Для нужд животноводства В12 получают с использованием смешанной культуры, содержащей бактерии Methanosarcina barkeri, Methanobacterium formicum. Содержание В12 в культуре достигает 6,5 мг/г сухой биомассы [5].

Концентрат витамина B12 предназначен для обогащения кормов животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином B12 используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке [2].

Мировая продукция витамина В12 составляет 9-11 тыс. кг в год. Из них около половины используется на медицинские цели, остальное количество - в животноводстве как кормовые добавки [5].

4. Селекция продуцентов эргостерина

Рисунок 3. Жирорастворимый витамин D2 [1].

Эргостерин (эргоста-5,7,22-триен-3в-ол) является исходным продуктом производства витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Витамин D2 (эргокальциферол) образуется при облучении ультрафиолетом эргостерина, который в значительных количествах синтезируют бурые водоросли, дрожжи и плесневые грибы [3].

Saccharomyces carlbergensis дает до 4,3 мг/л, S. ellipsoideus - 1,5 мг/л, Rhodotorula glutinis - 1 мг/л, Candida utilis - 0,5 мг/л продукта. Наиболее широко в производстве используют дрожжи Saccharomyces carlbergensis, а также S. Cerevisiae [5].

В промышленности эргостерин получают, используя дрожжи Sacch. cerevisiae, Sacch. carlsbergensis, а также мицелиальные грибы. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.

Дрожжи, а также грибы рода Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D 2 или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи.

Максимум поглощения эргостерина отмечен при 280 нм. Именно это излучение возбуждает отдельные связи колец А и В в молекуле эргостерина и вызывает его превращение в витамин D2. Облучение производят ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280-300 нм (сухие дрожжи) или в тонком слое 5 %-ной суспензии дрожжей. При более коротковолновом и длинноволновом излучении повышается выход других соединений стериновой природы.

На выход витамина D2 (и образование других соединений) оказывают влияние длительность облучения, температура, наличие примесей.

Витамин используется для лечения и профилактики рахита человека и животных [2].

Для получения кристаллического витамина D 2 дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу раствором соляной кислоты при 110 °С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 75-78 °С и после охлаждения до 10-15 С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В. Витамин D 2 получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, размельчают и дважды обрабатывают при 78 °С трехкратным объемом спирта.

Спиртовые экстракты сгущают до 70 %-ного содержания сухих веществ. Таким образом получают липидный концентрат. Его омыляют раствором NaOH, а стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0°. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69 %-ным спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют.

Для получения масляного концентрата раствор витамина после фильтрации разбавляют маслом до стандартного уровня. Источником получения эргостерина может служить мицелий грибов, остающийся как отход антибиотической промышленности и производства лимонной кислоты.

5. Селекция продуцентов каротиноидов

Каротиноиды - обширная группа природных пигментов, которые синтезируют хемо­ и фототрофами : прокариотами, мицелиальными грибами и дрожжами, водорослями и высшими растениями. Каротиноиды, синтезируемые микроорганизмами, существуют в клетке в свободной форме, а также в виде гликозидов, в виде эфиров жирных кислот и как каротино­белковые комплексы. Ценность этих соединений в том, что это источник витамина А. До настоящего времени не созданы истинные продуценты каротиноидов, а каротиноиды микроорганизмов выделяют из микроорганизмов преимущественно путем экстракции.

Биологически наиболее активным является провитамин А - в-каротин.

Рисунок 4. в-каротин

Каротиноиды содержат клетки бактерий (микобактерии, микрококки), дрожжи (Rhodotorula, Sporobolomyces), дрожжей (Blakeslea trispora). Особенно богата в-каротином биомасса Bl. Trispora, содержащая до 10-15 мг в-каротина на 1 г биомассы.

Культура дрожжей Blakeslea trispora образует (+) - и () - формы (гетероталлизм).

Посевной материал для каждой культуры готовят отдельно, а основную ферментацию ведут в одном аппарате. Для выращивания используют методы: поверхностной и глубинной культуры.

Метод глубинного культивирования. Среду готовят на доступных источниках углерода (углеводы, кислоты), часто из мелассных или зерновых заторов; концентрация в среде - 7-8%. В качестве источника азота используют минеральные соли или органические вещества. Добавляют 4-5% растительного масла богатого олеиновой и линоленовой кислотами, также 0,1% в-ионона. Выращивание посевного материала около 48 ч, основная фермантация длится - 5-6 сут. при температуре 28 С, pH - 6,2-6,7. Во время ферментации среда аэрируется. Интенсивные синтез каротиноидов начинается после использования азота питательной среды. Образование каротиноидов стимулируют - жирные кислоты, в-ионон, экстракты цитрусовых, помидоров, моркови, дрожжей, а также керосин. Во время ферментации необходимо добавить в питательную среду ПАВ (0,1%) для предотвращения образования жировых конгломератов. После ферментации мицелий фильтруют и сушат в вакууме при температуре 50-55 с. каротин извлекают их сухого размельченного мицелия экстракцией эфиром или растительными маслами. Для получения кристаллического каротина биомассу в течение 1-1,5 ч обрабатывают в экстракторе четырехкратным объемом бензола. В присутствии углекислоты бензол отгоняют. Полученный концентрат каротина омыляют 10% раствором гидроокиси калия в течение 20 мин при температуре 50 с. Коагулят, содержащий каротин, фильтруют, осадок промывают спиртом. Из полученной массы каротин экстрагируют эфиром при комнатной температуре, затем фильтруют, из фильтрата в вакуум-аппарате эфир отгоняют и получают насыщенный раствор каротина. Кристаллизацию ведут вначале при комнатной температуре, затем при 5 с. Выпавшие кристаллы фильтруют, промывают спиртом и сушат в вакуумных сушилках. Кристаллы каротина должны быть однородными, фиолетово-красного цвета с металлическим отливом. Содержание каротина в препарате не должно быть нижу 90%, температура плавления кристаллов не ниже 160 с [1].

Каратиноиды выполняют в клетке роль антиоксидантов и защищают ее от явления перекисного окисления. Кроме того, каратиноиды являются фотоловушками, собирающими световую энергию.

Промышленное получение каротиноидов.

Традиционные методы получения каратиноидов сводятся к гомогенизации биомассы и экстракции каратиноидов полярными растворителями (ацетон, метанол).

Каратиноиды получают путем разделения методом тонкослойной хроматографии на силикагеле, а также химическим синтезом. Традиционными продуцентами микробного синтеза каратиноидов являются бактерии, мицелиальные грибы и дрожжи. Из фототрофных бактерий можно отметить Chloroflexus и некоторые виды Rhodopseudomonas. Эта группа бактерий интересна тем, что у них в зависимости от интенсивности освещения можно регулировать выход каратиноидов. В Японии биомассу этих бактерий используют для окрашивания желтка яиц в качестве добавки в рацион. Каратиноиды получают в значительных количествах из некоторых водорослей, например из Chlorella sp. Cреди хемотрофов продуцентами каратиноидов являются дрожжи Rhodotorula gracilis, R. rubra, R. diobovatum, а также актиномицеты - Act. chrestomycetes, Act. chysomallus, микобактерии - Mycobacterium phei, M. carotenum, мицелиальные грибы семейств - из семейств Mucoraceae, Dacrymycetaceae.

Продуцентами в­каротина традиционно являются мукоровые грибы Blakeaslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании смешанные культуры дают выход до 3-4 г/л среды. Для получения в­каротина на основе Blakeslea trispora используют сложные по составу среды: кукурузно­соевый крахмал, дополненный маслами, поверхностно­активными веществами и стимуляторами. Процесс микробного синтеза протекает в несколько этапов. Сначала отдельно выращивают разнополые штаммы гриба, затем их смешивают, вносят стимуляторы каротинообразования (б­пирролидон, сукцинамид и т. д.). Причем различные типы каратиноидов: б, в, г, ликопоин образуются при стимулирующем действии различных веществ. Поэтому использование B. trispora в качестве продуцента обусловлено не только активностью синтеза каратиноидов, но и возможностью регуляции самого продукта.

Регуляция синтеза каратиноидов зависит:

1) от источника углерода. Если вводить в среду целлобиозу, то синтез каратиноидов этим штаммом возрастает в 7 раз;

2) внесения в среду отходов целлюлозного производства, что повышает также выход в­глюкозидазы.

На основе мутантов дрожжей Rhodosporidium diobovatum получают каротиносодержащий препарат, включаемый как белково­каратиноидная добавка в рацион скота. В настоящее время разработан способ получения каротиносодержащего препарата на основе мутантов Mycobacterium rubrum. Препарат комплексный и содержит б, в, г­каротины, ликопин и ксантофиллы. Для производства ксантофиллов используют гриб Dacrymyces deliquesсens. Выход каратиноидов на глюкозосодержащей среде с глицерином и кукурузным экстрактом составляет 40 мг/л.

витамин продуцент каротиноид микроорганизм

Заключение

Витамины - важные органические соединения, которые организм животных самостоятельно синтезировать, не способен, хотя и нуждается в очень малых количествах для осуществления метаболизма. Получение витаминов относится к тонкому органическому многостадийному синтезу.

Продуценты витаминов используются для получения лекарственных препаратов в медицине, в сельском хозяйстве, рациональном природопользовании.

Витамин В2 (рибофлавин) в значительных количествах синтезируется растениями, дрожжами, грибами и бактериями. Продуцентами витамина являются бактерии (Brevibacterium ammoniagenes, Micrococcus glutamaticus), дрожжи (Candida guilliermondii, C. flaveri), микроскопические (Ashbya gossypii) и плесневые грибы (Aspergillus niger). Промышленное получение рибофлавина осуществляется химическим, микробиологическим или комбинированным методом

Активно продуцируют витамин В12 Propionibacterium, а также Pseudomonas и смешанные культуры метанообразующих бактерий.

Эргостерин - исходный продукт производства витамина D2 и кормовых препаратов дрожжей, обогащенных этим витамином. Для получения кристаллического в-каротина в промышленном масштабе используется низший гриб Blakeslea trispora. Грибы содержат белок, сходный по аминокислотному составу с животным, богаты витаминами, коферментами. Грибы выгодно отличаются низкой калорийностью и наличием пищевых волокон, что является одним из оснований их использования в качестве кормовых добавок. Грибы технологичны: нетребовательны к субстрату, обладают довольно высокой скоростью роста. Однако они требуют для своего роста и накопления биомассы внесения в среду ряда микроэлементов, в частности цинка

Список использованных источников

1. Бекер М.Е. Введение в биотехнологию / М.Е. Бекер. - И: Пищевая промышленность, 1978. - 228 с.

2. Новиков Д.А. Выделение и очистка продуктов биотехнологии: метод. пособ. / Д.А. Новиков. - Минск: БГУ, 2014. - 256 с.

3. Рыбаков С.С. Курс лекций по основам биотехнологии. В 2 ч. Ч. 2. Применение биотехнологии / С.С. Рыбаков. - Из-во: Владимирский государственный университет, 2010. - 127 с.

4. Страйер Л. Биохимия: В 3-х т. Т 2. Пер. с англ. / Л. Страйер. - М: Мир, 1985. - 312 с.

5. Храмцова Е.А. Селекция продуцентов: курс лекций / Е.А. Храмцова, Н.П. Максимова. - Минск : БГУ, 2011. - 132 с.

6. Koolman J. Color Atlas of Biochemistry / J. Koolman, K.H. Roehm. - New York: Thieme, 2005. - 467 c.

Размещено на Allbest.ru