Методи дослідження маркерів метаболізму сполучної тканини у сучасній клінічній та експериментальній медицині

Размещено на http://www.allbest.ru/

Анотація

МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ МАРКЕРІВ МЕТАБОЛІЗМУ СПОЛУЧНОЇ ТКАНИНИ У СУЧАСНІЙ КЛІНІЧНІЙ ТА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІЙ МЕДИЦИНІ

Морозенко Д.В., Леонтьєва Ф.С., Інститут патології хребта та суглобів імені професора М.І. Ситенка Національної академії медичних наук України.

У статті розглянуто методики визначення маркерів метаболізму сполучної тканини. В якості матеріалу дослідження використовували сироватку крові та сечу. У крові визначали вміст глікопротеїнів, сіалових кислот, хондроїтинсульфатів та фракції глікозаміногліканів. У сечі визначали вміст оксипроліну та уронових кислот. Всі представлені у статті біохімічні методики можуть бути використані у клінічній та експериментальній медицині для діагностики захворювань різної етіології.

Ключові слова: сполучна тканина, біохімічні маркери, глікопротеїни, сіалові кислоти, хондроїтинсульфати, оксипролін, уронові кислоти.

Вступ

Постановка проблеми. У сучасній медицині маркери метаболізму сполучної тканини використовуються для оцінки ступеня запально-деструктивних процесів в опорно-руховому апараті, діагностики системної сполучнотканинної дисплазії, а також респіраторних, нефроло- гічних, гастроентерологічних та кардіологічних хвороб. Проте саме методики визначення сполучнотканинних маркерів в сучасній літературі висвітлено недостатньо, що не дозволяє широко використовувати їх у сучасних клінічних та експериментальних дослідженнях.

Аналіз останніх досліджень і публікацій. Сполучна тканина входить до складу хрящів, зв'язок, матриксу кісток, виконує роль основи шкіри і слизових оболонок, бере участь у фіксації кровоносних судин, складає основу міжклітинної речовини у паренхіматозних органах - печінці, нирках, легенях [1]. Останні роки низкою авторів проводяться прикладні дослідження ролі біохімічних маркерів метаболізму сполучної тканини у діагностиці та патогенезі остеоартрозу [2]. Важливою є роль цих біохімічних маркерів у діагностиці хвороб дихальної системи - бронхіальної астми [3], хронічної обструктивної хвороби [4]та емфіземи легенів [5]. Науковцями приділяється багато уваги щодо вивчення маркерів метаболізму сполучної тканини при хворобах травноїсистеми - виразковому коліті [6], біліарній атрезії [7], стеатогепатиті [8], а також коморбідній патології - остеоартрозі, артеріальній гіпертензії та ожирінні [9]. Таким чином, кількість наукових праць, присвячених метаболічним порушенням сполучної тканини, постійно зростає, але у жодній із робіт не віддзеркалюються та не аналізуються методики визначення біохімічних сполучнотканинних маркерів у сироватці крові та сечі.

Мета роботи - проаналізувати та викласти методики досліджень маркерів стану сполучної тканини в сироватці крові (глікопротеїни, сіалові кислоти, хондроїтинсульфати, фракції ГАГ) та сечі (оксипролін та уронові кислоти) для використання під час наукових досліджень у сучасній клінічній медицині.

Зміст роботи

Методика визначення глікопротеїнів. Принцип методу полягає у тому, що розчин фруктози (при кип'ятінні глюкоза перетворюються на фруктозу) у присутності амонію молібдату та концентрованої сульфатної кислоти дає синє забарвлення, інтенсивність якого залежить від кількості глікопротеїнів [10]. Для визначення глікопротеїнів необхідні прибори КФК-2 або КФК-3, пробірки, піпетки 1, 2 та 5 мл, мірні колби на 500 та 100 мл. У якості реактивів використовуються три хлорацетатна (ТХА) 20 % кислота (для осадження білків), а також робоча суміш - до 87 мл дистильованої води додають 3 мл концентрованої сульфатної кислоти, обережно перемішують та доливають 15 мл 10 % розчину молібденовокислого амонію.

Хід визначення: до центрифужної пробірки вносять по 0,2 мл сироватки крові, 0,4 мл сульфатної кислоти, 1 мл 20 % ТХА. Суміш ретельно перемішують, закривають, кип'ятять на водяній бані точно 20 хвилин, після чого охолоджують і центрифугують. 1 мл центрифугату перемішують із 3,5 мл робочої суміші і кип'ятять на водяній бані 20 хвилин. Після охолодження проби колориметрують на КФК-2 або КФК-3 у кюветі з товщиною шару 10 мм при червоному світлофільтрі. Контролем є проба, оброблена так само, як і дослідна, але замість сироватки крові беруть 0,2 мл дистильованої води. Показником вмісту глікопротеїнів є значення екстинції в умовних одиницях. Для переведення одиниць у г/л потрібно помножити на коефіцієнт 1,6. У людини вміст глікопротеїнів у сироватці крові в нормі становить 0,25-0,45 ум. од. (0,40-0,72 г/л).

Методика визначення сіалових кислот (метод Гесса). Принцип методу полягає у тому, що у результаті гідролізу безбілкового фільтрату сироватки крові зі складу сіалоглікопротеїнів виділяються сіалові кислоти, які з розчином сульфатної кислоти в льодяній оцтовій кислоті у киплячій водяній бані дають кольорову реакцію [11].

Для виконання дослідження проводять приготування робочих розчинів: 1) Оцтово-сульфатний реактив: до 95 мл крижаної оцтової кислоти добавляють невеликими порціями за ретельного перемішування 5 мл концентрованої сульфатної кислоти. Реактив готують на крижаній бані. Він стабільний упродовж одного місяця; 2) Розчин трихлорацетата (ТХА) - 10 мл ТХА на 100 мл дистильованої води.

Хід визначення: створюють дослідну пробу - додають 1 мл сироватки крові та 1 мл розчину ТХА, поміщають її до кип'ячої водяної бані на 5 хвилин, потім охолоджують на льодяній бані 5 хвилин і центрифугують 5 хвилин (2000-3000 обертів за хвилину). Далі 0,4 мл центрифугату змішують з 5 мл оцтово-сульфатного реактиву, у якості холостої (контрольної) проби використовують оцтово-сульфатний реактив. Пробірки з дослідною та холостою пробами закривають скляними пробками і ставлять до кип'ячої водяної бані на 30 хвилин. Потім проби охолоджують до кімнатної температури і коло- риметрують в кюветах з товщиною шару 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-600 нм) проти холостої проби. Отриману екстинцію помножують на коефіцієнт 1000, отримуючи результат в умовних одиницях (одиницях Гесса).

Для переведення із одиниць Гесса у ммоль/л результат дослідження помножують на коефіцієнт 0,0115. У людини в нормі вміст сі- алових кислот у сироватці крові становить 1,61-2,30 ммоль/л (140,0-200,0 Од. Гесса).

Методика визначення хондроїтинсульфатів (метод Nemeth-Csoka в модифікації Л.І. Слуць- кого). Принцип методу полягає в тому, що хондро- їтинсульфати викликають помутніння сироватки крові у присутності риванолу, яке пропорційне їх концентрації [11]. У якості реактивів використовують ацетатний буфер (рН = 5,5), цитратний буфер (рН = 5,5), суміш буферів № 1 та № 2, розчин риванолу 0,1 моль/л.

Приготування реактивів проводять наступним способом: 1) ацетатний буфер (рН = 5,5, а+б):

а) 0,6 мл ацетатної кислоти + 100 мл дистильованої води; б) 1,36 натрію ацетату (Ч) + 100 мл дистильованої води. 10 мл реактиву (а) + 90 мл реактиву (б) = 100 мл буфера (рН=5,5); 2) ци- тратний буфер (рН=5,5, а+б): а) 2,1 мл лимонної кислоти + 20 мл одно-молярного гідроксиду натрію довести дистильованою водою до 100 мл;

б) одно-молярний гідроксид натрію. 72,3 мл реактиву (а) + 27,7 мл реактиву (б) = 10 мл буфера (рН = 5,5); 3) суміш буферів 50 мл № 1 та 50 мл № 2 = 100 мл робочої суміші + 0,39 г натрію хлориду; 4) етакридину лактат розчин 0,1 моль/л (0,1 М = 3,43 чистого для аналізу на 100 мл дистильованої води, профільтрувати. біохімічна маркер метаболізм сполучна

Для визначення вмісту хондроїтинсульфатів у сироватці крові до пробірки вносять 5 мл робочої суміші та 0,1 мл сироватки крові. Потім додають 0,1 мл етакридинулактату. Вимірювання оптичної густини проводять через 5 хвилин у кюветі з товщиною робочого шару 10 мм проти контролю при зеленому світлофільтрі, довжина хвилі - 540 нм. Контрольну пробу обробляють так само, як і дослідну, але заміст сироватки крові додають 0,1 мл дистильованої води. Розрахунки здійснюють за калібрувальною кривою, результат виражають у г/л. Вміст хондроїтинсульфатів у сироватці крові людини в нормі не перевищує 0,100 г/л.

Методика визначення глікозаміногліканів (ГАГ). Принцип методу полягає у осадженні ГАГ етанолом і поетапному вимірюванню фракцій солями натрію хлориду різної концентрації [12]. Кров для дослідження беруть після 12-годинної голодної дієти в суху чисту пробірку натще, що є важливою умовою, оскільки метод базується на нефелометрії (визначення мутності розчину), а хільоз суттєво завищує результати. Сироватку отримують методом центрифугування за 1000 об./хв протягом 10 хвилин. Для дослідження використовують розчин резохіну з масовою часткою 0,5 % (осаджувач) та одно-молярний розчин натрію хлориду.

Для проведення дослідження використовують 2 пробірки: дослідну та контрольну. В дослідну вносять 0,05 мл сироватки крові, 3,35 мл дистильованої води та 1 мл розчину резохіну з масовою часткою 0,05 %. В контрольну пробірку вносять також 0,05 мл сироватки крові та 2,25 мл дистильованої води. Обидві пробірки струшують і витримують за температури 20±3^оС протягом 30 хвилин. Через 30 хвилин вимірюють інтенсивність помутніння в дослідній та контрольній пробірках на фотоелектроколориметрі з властивостями нефелометра, що дозволяє визначати мутність розчину, за довжини хвилі 400 нм у кюветі з товщиною робочого шару 5 мм. Вміст загальних ГАГ у сироватці крові визначають за формулою: Ді - Кі = Р_заг. х 100 = загальні ГАГ (в умовних одиницях), де Д ₁ - інтенсивність помутніння у дослідній пробірці; К ₁ - інтенсивність помутніння у контрольній пробірці; Р_заг. - різниця інтенсивності помутніння; 100 - коефіцієнт переведення в умовні одиниці.

Для визначення вмісту хондроїтин-6- сульфатів (І фракції) в дослідну та контрольну пробірки додають по 0,05 мл розчину натрію хлориду з молярною часткою 1,0 моль/л. Пробірки струшують і витримують за температури 20±3°С протягом 10 хвилин, після чого вимірюють інтенсивність помутніння в дослідній та контрольній пробірках на фотоелектроколориметрі за довжини хвилі 400 нм у кюветі з товщиною робочого шару 5 мм. Обчислюють різницю в показниках досліду та контролю за формулою:

Д 2 - К 2 = Р 2 (Р 2 - Рі) х 100 = І фракція ГАГ (в умовних одиницях),

де Д ₂ - інтенсивність помутніння у дослідній пробірці; К ₂ - інтенсивність помутніння у контрольній пробірці; Р ₂ - різниця інтенсивності помутніння; 100 - коефіцієнт переведення в умовні одиниці.

Для визначення вмісту хондроїтин-4- сульфатів (II фракції) у дослідну та контрольну пробірки додають по 0,05 мл розчину натрію хлориду з молярною часткою 1,0 моль/л. Пробірки струшують і витримують за температури 20±3°С протягом 10 хвилин, після чого вимірюють інтенсивність помутніння в дослідній та контрольній пробірках на фотоелектроколориметрі за довжини хвилі 400 нм в кюветі з товщиною робочого шару 5 мм. Обчислюють різницю в показниках досліду та контролю за формулою:

Д 3 - К 3 = Р 3 (Р 2 - Р 3) х 100 = ІІ фракція ГАГ (в умовних одиницях),

де Д 3 - інтенсивність помутніння у дослідній пробірці; К 3 - інтенсивність помутніння у контрольній пробірці; Р 3 - різниця інтенсивності помутніння; 100 - коефіцієнт переведення в умовні одиниці.

Для визначення вмісту гепарансульфату (III фракції) в дослідну та контрольну пробірки додають по 0,05 мл розчину натрію хлориду з молярною часткою 1,0 моль/л. Пробірки струшують і витримують за температури 20±3°С протягом 10 хвилин, після чого вимірюють інтенсивність помутніння в дослідній та контрольній пробірках на фотоелектроколориметрі за довжини хвилі 400 нм в кюветі з товщиною робочого шару 5 мм. Обчислюють різницю в показниках досліду та контролю та за калібрувальною кривою визначають концентрацію гепарансульфату.

Для оцінки результатів досліджень фракційного складу ГАГ у г/л будують три калібрувальних графіки з використанням стандартних розчинів з різним умістом (0,01 г/л; 0,05 г/л; 0,10 г/л; 0,15 г/л; 0,20 г/л) хондроїтин- 6-сульфату, хондроїтин-4-сульфату та гепаран- сульфату. Побудову кожного з трьох графіків дослідження проводять у 5 дослідних пробірках і контрольній, в які замість сироватки крові вносять стандартні розчини з різним вмістом (0,01 г/л; 0,05 г/л; 0,10 г/л; 0,15 г/л; 0,20 г/л) хондроїтин-6-сульфату - для побудови першого графіка; хондроїтин-4-сульфатів - другого та ге- парансульфату - для побудови третього графіка. Розрахунок вмісту окремих фракцій і сумарного вмісту ГАГ в сироватці крові здійснюють у г/л. Сумарний вміст ГАГ розраховують складанням величин вмісту всіх їхніх фракцій.

При вираженні показника в умовних одиницях у людини вміст загальних ГАГ в сироватці крові становить 11,1-13,1 ум. од., І фракція - 5,4-6,3 ум. од., ІІ фракція - 3,5-4,3 ум. од., ІІІ фракція - 2,5-3,1 ум. од. При вираженні показників у г/л вміст загальних ГАГ у сироватці крові людини становить 0,107-0,143 г/л, І фракція - 0,052-0,068 г/л, ІІ фракція - 0,034-0,046 г/л, ІІІ фракція - 0,021-0,029 г/л.

Методика визначення оксипроліну в сечі. Принцип методу полягає у тому, що хлорамін окислює ДАБА (диметиламінобензальдегід) під час нагрівання з утворенням червоного забарвлення [13]. Наявність оксипроліну кількісно змінює це забарвлення через конкурентність його окиснення хлораміном. Для визначення оксипроліну використовують сечу. Для дослідження не можна використовувати сечу кольору "м'ясних помиїв".

Проводять приготування робочих розчинів: 7-нормальна хлоридна кислота, 1,75 нормальний натрію гідроксид, 50 мг % розчин оксипроліну (перед роботою його розводять у 100 разів ізопропіловим спиртом), хлорамін Б готують перед роботою: 70 мг хлораміну Б розчиняють в 1 мл дистильованої води і додають 4 мл буфера, буфер - 3,7 г натрію ацетату + 4,54 г натрію цитрату + 0,55 г цитрату + 38,5 мл ізопропілового спирту, доводять до 100 мл дистильованою водою; рН одержаного буфера - 6,3; ДАБА готують перед роботою: 700 мг ДАБА розчинити в 1,6 мл 7-нормальної хло- ридної кислоти. Для визначення вмісту оксипроліну в сечі 1 мл сечі наливають в ампулу об'ємом 5 мл, до неї додають 3 мл 7 Н хлоридної кислоти. Ампулу запаюють на полум'ї газового пальника і ставлять на 8 годин у сушильну шафу за температури 100°С для гідролізу. Після гідролізу вміст ампули переносять у центрифужну пробірку і центрифугують. До 1 мл центрифугату додають 3 мл 1,75 н розчину натрію гідроксиду і нейтралізують до рН=7. Потім у три пробірки наливають по 0,5 мл нейтралізату. До нейтралізату першої (пробірка № 1) і другої (пробірка № 2) пробірок додають по 1 мл ізопропілового спирту, а в третю пробірку (пробірка № 3) наливають 1 мл стандарту. Потім у першу і третю пробірки наливають по 1 мл розчину хлораміну Б. Через 4 хвилини в усі пробірки додають по 1 мл розчину ДАБА, після чого в другу пробірку (пробірка № 2) додають 0,5 мл розчину хлораміну Б. Потім усі пробірки ставлять на водяну баню при 60°С точно на 20 хв. Пробірки охолоджують і через 20 хвилин вимірюють інтенсивність забарвлення на фотоелектроколориметрі з зеленим світлофільтром (540 нм) у кюветі 5 мм проти дистильованої води. Оцінка результатів: вимірюють оптичну густину в стандартній і дослідних пробірках на фотоелектроколориметрі. Розрахунок проводять за формулою:

[(Е!-Е ₂) / (Е ₃-Е^]х 5х 32 = вміст оксипроліну в сечі (мг/л),

де Еі - екстинція пробірки № 1; Е ₂ - екстинція пробірки № 2; Е ₃ - екстинція пробірки № 3; 5 - стандарт оксипроліну в мг/л; 32 - розведення. Рівень екскреції оксипроліну із сечею людини в нормі становить 11,0-39,0 мг/добу.

Методика визначення уронових кислот в сечі. Принцип методу полягає у визначенні вмісту уронових кислот в сечі за реакцією із кар- базолом та вираження їх концентрації в мг/л. Визначення вмісту уронових кислот за інтенсивністю забарвлення з карбазолом за реакцією [14]. Для визначення уронових кислот використовують сечу. Для дослідження не можна використовувати сечу кольору "м'ясних помиїв". Для дослідження використовують: борат (9,5 г тетраборату натрію розчиняють в 1 л сульфатної кислоти концентрованої), розчин карбазолу з масовою часткою 1,25 г/л на абсолютному спирті, розчин натрію гідроксиду (МаОН) з молярною часткою 0,2 моль/л, розчин спирту етилового у воді з масовою часткою 780 г/л (96 %), розчин це- тавлону з масовою часткою 125 г/л.

Для визначення вмісту уронових кислот в сечі 30,0 мл добової сечі переносять у пластикову пробірку на 50 мл, додають 1,0 мл 12,5 % розчину цетавлону, потім поміщають на 6-8 годин у холодильник за температури 6±4°С, після цього згусток, що утворився, відокремлюють центрифугуванням за 3 тисяч обертів за хвилину, триразово промивають 30 мл 96° етилового спирту і розчиняють у 10,0 мл 0,1 н розчину натрію гідроксиду. До 1,0 мл розчиненого осаду додають 5 мл борату і кип'ятять 10 хвилин на водяній бані. Потім пробірку охолоджують на льоду, додають 0,2 мл розчину карбазолу, і знову ставлять у киплячу водяну баню на 15 хв. Проби охолоджують і міряють інтенсивність забарвлення на фотоколориметрі (540 нм) у кюветі на 10 мм (колориметрують проти контролю). Контроль обробляють одночасно з дослідом, але замість розчиненого осаду додають 1 мл 0,1 N розчину МаОН. Оцінку результатів проводять за калібрувальним графіком, який будують із пробами за концентрацією глюкуронової кислоти 1,0, 2,0; 3,0; 4,0 та 5,0 мг/л. Рівень екскреції уронових кислот із сечею людини в нормі становить 3,5-5,5 мг/добу.

Висновки і перспективи подальших досліджень. Приведені у статті методики досліджень можуть бути застосовані у сучасних медичних та експериментально-біологічних дослідженнях для визначення основних маркерів метаболізму сполучної тканини в сироватці крові (глікопротеїнів, сіалових кислот, хондроїтинсульфатів, фракцій ГАГ) та сечі (оксипроліну та уронових кислот). Отримані результати можуть бути успішно використані науковцями під час проведення досліджень у різних сферах медицини, в тому числі, ортопедії та травматології, нефрології, кардіології, ревматології, пульмонології, акушерстві та гінекології, гастроентерології.

Список літератури

1. Морозенко Д.В. Біохімічні показники метаболізму сполучної тканини у діагностиці захворювань дрібних домашніх тварин: монографія / Д.В. Морозенко. - Харків, 2011. - 120 с.

2. Биохимические маркеры в диагностике остеоартроза / Ф.С. Леонтьева, Д.В. Морозенко, К.В. Маколинец // Международный медицинский журнал. - 2013. - № 2. - С. 76-78.

3. Абдуллаева Д.Т. Клинико-биохимические изменения у детей с бронхиальной астмой на фоне дисплазии соединительной ткани / Д.Т. Абдуллаева, Н.Р. Сотиболдиева // Врач-аспирант. - 2010. - № 1 (38). - С. 84-88.

4. Вахрушев Я.М. Оценка метаболизма основного вещества соединительной ткани при хронической обструктивной болезни легких / Я.М. Вахрушев, Г.И. Ермаков, П.Н. Шараев // Терапевтический архив. - 2006. - Т. 78, № 3. - С. 13-17.

5. Smits N.C. Heparan sulfates in the lung: structure, diversity, and role in pulmonary emphysema / N.C. Smits, N.W. Shworak, P.N. Dekhuijzen // Anat. Rec. (Hoboken). - 2010. - № 293 (6). - P. 955-956.

6. Маркеры метаболизма соединительной ткани и серотонинсекретирующие клетки в диагностике и оценке динамики неспецифического язвенного колита / [Громов, А.Г. Чиж, Е.А. Исламова и др.]// Современные наукоемкие технологии. - 2007. - № 7. - С. 32-35.

7. Ukarapol N. Hyaluronic acid: additional biochemical marker in the diagnosis of biliary atresia / N. Ukarapol, L. Wongsawasdi, S. Ong-Chai // Pediatr. Int. - 2007. - № 49 (5). - P. 608-611.

8. Харченко В.В. Стан системи сполучної тканини у хворих на неалкогольний стеатогепатит у поєднанні із гіпертонічною хворобою / В.В. Харченко // Український терапевтичний журнал. - 2011. - № 2. - С. 5-10.

9. Корж И.В. Биохимические маркеры метаболизма соединительной ткани у больных остеоартрозом с артериальной гипертензией и ожирением / И.В. Корж // Научный ведомости Белгородского государственного университета: серия "Медицина. Фармация". - 2013. - № 11 (154), Вып. 22. - С. 37-40.

10. Клінічна біохімія / О.П. Тимошенко, Л.М. Вороніна, В.М. Кравченко [та ін.]. - Харків: НфаУ; Золоті сторінки, 2003. - 239 с.

11. Ветеринарна клінічна біохімія / М.І. Карташов, О.П. Тимошенко, Д.В. Кібкало [та ін.]; За ред М. І. Карташова та О.П. Тимошенко. - Харків: Еспада, 2010. - 400 с.

12. Патент на корисну модель 29198 Україна. МПК (2006) G01N 33/48. Спосіб визначення фракцій сульфатова- них гексозаміногліканів / Леонтьєва Ф.С., Філіпенко В.А., Тимошенко О.П. та ін.; заявник і патентовласник ДУ "Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМН України"; Харківська державна зооветеринарна академія - № U 200708505. заявл. 24.07.2007. - опубл. 10.01.2008. - Бюл. № 1. - 4 с.

13. Деклараційний патент 37271 Україна, МПК G01N33/487. Спосіб визначення концентрації оксипроліну в сечі / М.І. Карташов, Ф.С. Леонтьєва, О.П. Тимошенко [та ін.]; Харківська державна зооветеринарна академія. - № 200806810; заявл. 19.05.08; опубл. 25.11.08, бюл. № 22. - 4 с.

14. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотницкая и др. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

Размещено на Allbest.ru