Размещено на http://www.allbest.ru/

Проточная цитометрия

ВВЕДЕНИЕ

проточный цитометрия медицина

За прошедшее десятилетие проточная цитометрия становится все более актуальным и востребованным методом. На данный момент она заняла свои позиции не только в научно-исследовательской практике (клеточная кинетика, клеточная энзимология, изучение механизмов действия различных иммуномодуляторов и других биологически активных веществ, клеточная физиология, генетика), но и как «золотой стандарт» клинической иммуноцитологии. В клинической практике проточную цитометрию используют в иммунологии, онкологии, онкогематологии (включая диагностику, оценку эффективности лечения, мониторинг пациентов, входящих в группу риска), трансплантологии, общей гематологии - для диагностического типирования клеток. Постоянно увеличиваются возможности анализа различных параметров клеток, их морфологии, клеточного цикла, функциональные возможности по автоматизации и ускорению анализа. Этому способствует и модификация и совершенствование технических возможностей новой аппаратуры, и повышение их доступности, постоянно совершенствующая реагентная база.

Первый патент на устройство, которое легло в основу проточной цитометрии, использующее принцип сопротивления Коултера было зарегистрировано в США в 1953 году, его автор Wallace H. Coulter. Адсорбционные методы на тот момент были распространены гораздо шире флуоресцентных.

Первый прибор, использующий флуоресценцию, был создан в 1968 году Wolfgang Gцhde из University of Mьnster и почти сразу получил коммерческое использование немецким разработчиком и изготовителем Партеком (Partec) в Геттингене. Новый метод быстро получил свое признание и развитие, и в период 70 х годов появилось несколько инструментов для проточной цитометрии включая Cytofluorograph (1971) от Bio/Physics Systems Inc., PAS 8000 (1973) от Partec, первые FACS оснащают датчиками от Becton Dickinson (1974), ICP 22 (1975) от Partec/Phywe и Epics от Коултера (1977/ 78). Изначально методику называли пульсовой цитофлоуметрией. Только 20 лет спустя в 1988, на Конференции американского Технического Фонда в Пенсаколе, штат Флорида, название было изменено на "проточную цитометрию", и именно этот термин быстро стал популярным.

1. ПРИНЦИП МЕТОДА

Проточная цитометрия - это метод, основанный на измерении светорассеивания и специфической флуоресценции клеток (частиц) при освещении их лазером (ртутной лампой). Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке.

Основа метода заключается в:

1) использовании системы гидродинамической фокусировки либо микрокапилларной системы, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке;

2) облучении клетки лазерным излучением;

3) регистрации сигналов светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки.

Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

За образцы берут кровь, костный мозг, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, асцитическая жидкость, суспензированные клетки тканей (например, опухолей).

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями (флуоресцеина изотиоцианат, фикоэритрин, аллофикоцианин и др.), попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В итоге клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеянное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

Рис 1. Схема оборудования для проведения проточной цитометрии.

2. РЕГИСТРИРУЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ

1. Прямое (малоугловое) светорассеяние.

Детектор прямого светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение лазера, которое рассеивается под углами 2-19 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких.

2. Боковое светорассеяние.

Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа.

3. Регистрация флуоресценции.

Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флюорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной задачей для данного исследования. Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI) флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1).

4. Сортировка клеток.

В проточном цитометре, оборудованном системой для сортировке клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданной частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержится внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку.

3. ДРУГИЕ ФУНКЦИИ

Иммунология

- иммунофенотипирование клеток периферической крови.

- определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей).

- определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа).

- определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов.

- определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина).

- исследование клеточного цикла.

- оценка клеточной цитотоксичности.

Онкология

- количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК).

- анализ стадий клеточного цикла.

- выявление анеуплоидного клона.

- определение пролиферативной активности анеуплоидного клона.

- определение специфических маркеров.

- позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска.

- оценка состояния иммунной системы:

· оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов).

· оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.).

Цитология

- определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток.

- оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флюорогенных субстратов.

- определение экспрессии поверхностных антигенов.

- анализ стадий клеточного цикла.

- измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca²⁺, потенциал наружной клеточной мембраны).

Гематология

- анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови.

- подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам.

- дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов.

- диагностика лимфопролиферативных заболеваний.

- диагностика острых лейкозов.

- оценка минимальной резидуальной болезни.

Фармакология

- измерение экспрессии маркеров.

- измерение активности внутриклеточных ферментов.

- определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне.

В настоящее время проточная цитометрия применяется также и в инфектологии для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных так и грибковых), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Рис 2. Проточный цитофлюориметр СYTOMICS FC 500.

Рис 3. Проточный цитофлюориметр CyAn ADP.

5. ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ

Преимуществ:

- короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду).

- анализ большого количества клеток (до 108 клеток в мл).

- определение субпопуляций клеток.

- измерение параметров редко встречающихся клеток.

- объективное измерение интенсивности флуоресценции.

Преимуществами сортировки клеток на проточном цитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием.

Недостатки: Проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходным материалом. Также, при сортировке на проточном цитометре бывает затруднительным соблюдение абсолютной стерильности, что ограничивает применение данного метода в клинической практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, можно сделать вывод о том, что метод проточной цитометрии является перспективным направлением, имеет множество преимуществ, функций и обладает высокой чувствительностью и скоростью анализа. Разнонаправленность метода позволяет использовать его в различных современных и значимых клинических направлениях и научных исследованиях. В настоящее время создаются всё более универсальные и многофункциональные цитометры, разрабатываются более мощные системы управления, делая данный метод рациональнее и актуальнее в современном мире, и в частности в медицине.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аллергология и иммунология: национальное руководство / Под ред. Хаитова Р.М., Ильиной Н.И. - М.: ГОЭТАР-Медиа, 2009. - 656 с. - (Серия «Национальное руководства»).

2. Клиническая иммунология и аллергология / Под ред. Лолора-младшего Г., Фишера Т., Адельмана Д. Пер. с англ. - М.: Практика, 2000. - 806 с.

4. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. Диагностика заболеваний иммунной системы / Руководство для врачей. - М: ГОЭТАР-Медиа, 2009, - 352 с.

5. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине, М. 2007.

6. Л.В. Ковальчук, Г.А. Игнатьева, Л.В. Ганковская "Иммунология. Практикум".

7. Исаев В.Л., Пинчук В.Г., Исаева Л.М. Современные методы автоматизированных цитологических исследований. - Киев: Наук. думка, 1988. - 218 с.

8. Полетаев А.И. Проточная цитометрия и сортировка в цитологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицине. М., ВИНИТИ, 1989, 87с.

Размещено на Allbest.ru