Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

В современном мире огромное значение уделяется профилактике заболеваний. Но, кроме того, чтобы следовать профилактике, необходим огромный диагностический комплекс. В последние десятилетия медицина стремиться усовершенствовать самые различные анализы крови.

Кровь - самая исследуемая и самая информативная из сред организма: современная лабораторная диагностика показателей крови даёт более 60% информации о пациенте. В первую очередь, любая патология отражается на обменных процессах в организме вообще и на состоянии иммунного (антигенного) статуса в частности.

Иммунная система человека обеспечивает его биологическую индивидуальность и защищает организм человека от чужеродных агентов, антигенов. Она представляет собой комплекс органов и клеток, способных выполнять иммунологические функции. Центральная роль в иммунном ответе всегда принадлежит лейкоцитам, а точнее нейтрофилам. Нейтрофильный ответ - самый первый ответ на бактериальные и многие другие инфекции. Нейтрофильный ответ при острых воспалениях и инфекциях всегда предшествует более специфическому лимфоцитарному.

Целью моей работы является определение параметров в хемилюминесцентной активности нейтрофильных гранулоцитов у практически здоровых людей.

На основании поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Составить обзор литературы по данной проблеме.

2. Отработать метод хемилюминесценции.

1. Нейтрофильные гранулоциты

хемилюминесцентный гранулоцит клетка нейтрофил

Лейкоциты, или белые кровяные клетки, периферической крови позвоночных и человека разнородны по морфологическим признакам и биологической роли. Все лейкоциты подразделяются на две большие группы: зернистые лейкоциты (или гранулоциты) и не зернистые лейкоциты (агранулоциты). Группа зернистых лейкоцитов характеризуется наличием в цитоплазме специфической зернистости и сегментированными ядрами. При окраске смесью кислого (эозин) и основного (азур) красителей по методу Романовского-Гимзы зернистость в одних лейкоцитах обнаруживает сродство к кислым красителям, и такие лейкоциты называются эозинофильными, или ацидофильными, в других -- к основным красителям -- базофильные лейкоциты; зернистость третьих обнаруживает сродство к кислым и основным красителям, такие лейкоциты называются нейтрофилъными, или гетерофильными. Группа незернистых лейкоцитов отличается отсутствием специфической зернистости в цитоплазме и несегментированными ядрами. Они подразделяются на лимфоциты и моноциты, имеющие разные морфологические и функциональные показатели.

Нейтрофильные гранулоциты (granulocytus neutrophilicus) -- нейтрофильные лейкоциты, или нейтрофилы, имеют округлую форму, их диаметр в капле свежей крови около 7--9 мкм. На стекле при изготовлении мазка они несколько распластываются, и их диаметр составляет 10--12 мкм. В крови взрослого человека нейтрофилов содержится больше, чем других лейкоцитов; их относительное количество достигает 65--75% от общего числа лейкоцитов.[4]

Цитоплазма нейтрофилов слабо оксифильна, в ней содержится мелкая зернистость, плохо заметная не только на свежих, но и на фиксированных, окрашенных препаратах. Количество гранул в каждой клетке может быть от 50 до 200. При окраске по методу Романовского-Гимзы зернистость принимает розово-фиолетовый цвет. Зернистостью занята не вся цитоплазма -- поверхностный слой ее в виде узкой каемки остается гомогенным, содержит тонкие филаменты. Этот слой играет главную роль при амебоидном движении клетки, участвуя в образовании псевдоподии.[4]

В зависимости от строения и химического состава различают два основных типа зернистости: специфическую (вторичные гранулы) и азурофильную (первичные гранулы). Специфическая зернистость преобладает и составляет около 80-90% всех гранул. В ней выявляется щелочная фосфатаза, пероксидаза, цитохромоксидаза, мурамидаза, аминопептидаза, а также гликоген, липиды и др. Количество азурофильных гранул составляет 10-20%, они представляют собой лизосомы с характерным набором гидролитических ферментов.[4]

Ядра нейтрофилов содержат довольно плотный хроматин, особенно по периферии, в котором трудно различить ядрышки. Зрелые нейтрофилы имеют сегментированное ядро, состоящие из 2-3 долек, связанных очень тонкими перемычками. Они составляют 60-65% лейкоцитов. 3-5% нейтрофилов содержат ядро в виде палочки или подковы. 0-0,5% в периферической крови юных форм нейтрофилов, имеющих бобовидное ядро.[4]

Нейтрофилы обладают высокой подвижностью и фагоцитарной способностью, способны к хемотаксису. Они захватывают бактерии и другие частицы, которые разрушаются (перевариваются) под действием гидролитических ферментов. Живут нейтрофильные гранулоциты до 8 сут. В кровеносном русле они находятся 8-12 ч, а затем выходят в соедини­тельную ткань, где осуществляют свои функции.

1.1 Созревание нейтрофилов

Период пребывания нейтрофилов в периферической крови составляет примерно 6-8 ч, и это, вероятно, объясняет их продукцию с удивительно высокой скоростью - 2.5 биллиона клеток в час. Так же как и другие лейкоциты, нейтрофилы происходят из общей полипотентной стволовой клетки в костном мозгу (рис, 1).[5]

Рисунок 1 - Происхождение нейтрофилов

Длительность цикла дифференцировки нейтрофилов от клетки-предшественника до зрелой клетки составляет в зависимости от степени активности процесса от 7 до 10 дней.[5]

Созревание нейтрофилов в костном мозгу сопряжено с динамикой морфологических изменений клеток: постепенное уменьшение размеров ядра с увеличением доли цитоплазмы, исчезновение ядрышек, конденсация хроматина и концентрация его у оболочки клетки, сегментация ядра, утрата базофилии цитоплазмы, появление специфической нейтрофильной зернистости. Особенности ультраструктуры и цитохимии миелобластов (наличие ядрышек, большое количество рибосом, развитые аппарат Гольджи и система эндоплазматического ретикулума) свидетельствуют о том, что метаболизм этих клеток направлен на поддерживание высоких темпов синтеза нуклеиновых кислот и цитоплазматических белков. На стадии поздних миелобластов и промиелоцитов в аппарате Гольджи и в системе эндоплазматического ретикулума происходит интенсивное образование первичных гранул.[5]

Для процесса созревания нейтрофилов необходимо наличие двух условий: поддержание достаточного количества стволовых клеток и дифференцировка этих клеток в зрелые под воздействием различных факторов роста.

1.2 Движение нейтрофилов

Активное перемещение относится к числу наиболее характерных признаков нейтрофилов. Нейтрофильный гранулоцит двигается гораздо быстрее других лейкоцитов и более чувствителен к действию разнообразных модуляторов миграционной функции. При спонтанной миграции нейтрофил двигается беспорядочно, периодически меняя вектор движения. Клетка выбрасывает псевдоподии, которые необязательно совпадают с осью уже начавшегося перемещения, а потому вызывают изменение миграционного маршрута. Структурной основой миграционной функции служат сократительные белки, подобные, но не идентичные актину и миозину мышечных клеток. Они собраны в микрофиламенты, которые располагаются по клеточной периферии и агрегируют при стимуляции с образованием сократительных волокон - двигательного аппарата нейтрофила.[5]

Хемотаксис отражает способность клетки двигаться в сторону нахождения стимулирующих веществ, именуемых хемоаттрактантов или хемо(цито)токсинами. Направление движения определяется градиентом концентрации хемоаттрактантов. Хемотаксис является предстадией фагоцитоза, поскольку он необходим для сближения нейтрофила с фагоцитируемым объектом.[5]

Функцией зрелых нейтрофильных лейкоцитов является уничтожение, проникших в организм инфекционных агентов. Осуществляя ее они тесно взаимодействуют с макрофагами, Т- и В-лимфоцитами. На важность функционального вклада нейтрофилов и защиту организма от инфекции указывает, например, тяжесть течения инфекционных заболеваний у больных, страдающих сниженной продукцией или качественными нарушениями этих клеток. Нейтрофилы секретируют вещества, обладающие бактерицидными эффектами, способствуют регенерации тканей, удаляя из них поврежденные клетки, а также секретируя стимулирующие регенерацию вещества. Часть нейтрофильных гранул, дают положительную окраску на фермент миелопероксидазу, представлены лизосомами, содержащими многочисленные энзимы: лизоцим, повреждающий стенку бактерий; катионные белки, нарушающие дыхание и рост микроорганизмов; нейтрофильные протеазы и кислые гидролазы, позволяющие нейтрофилам легко переваривать фагоцитированные объекты.[6]

Гранулы нейтрофилов, не окрашивающиеся на миелопероксидазу, содержат лактоферрин, оказывающий бактериостатическое действие, транскобаламины I и III -- переносчики витамина В12 в крови, лизоцим. В гранулах третьего типа содержатся кислые глюкозаминогликаны, участвующие в процессах размножения, роста и регенерации тканей. Гранулы 2-го и 3-го типов -- это секреторные органеллы, выделяющие секрет и вне фагоцитоза, что позволяет отнести нейтрофилы к клеткам, постоянно секретирующим биологически активные вещества.

Нейтрофилы осуществляют свои функции, благодаря способности быстро мигрировать и накапливаться в инфицированном или поврежденном участках организма, фагоцитировать, т.е. захватывать и разрушать в фагоцитарных вакуолях внутри клетки поглощенные бактерии и поврежденные клетки. Их способность к миграции связана с хорошо развитым аппаратом движения. Выбор направления их движения к воспаленным или инфицированным тканям обусловлен появлением в этих тканях вазоактивных и хемотаксических факторов. Вазоактивные факторы повышают проницаемость капилляров, что способствует миграции нейтрофилов в ткань. Хемотаксические факторы взаимодействуют с рецепторами на поверхности гранулоцитов, образуя лигандрецепторный комплекс, определяющий движение нейтрофилов к воспаленному участку. Самым мощным хемотаксическим эффектом обладают лейкотриены, производные метаболизма арахидоновой кислоты в мембране клеток. Они секретируются активированными Т-лимфоцитами и макрофагами после воздействия на них бактериальных веществ. Помимо лейкотриенов эти клетки секретируют другие хемоатрактанты -- эндотоксины. Важными хемотаксическими факторами являются продукты активации комплемента -- фрагменты его молекул С2а и С5а. Некоторые из этих факторов, особенно С, функционируют как опсонины, т.е. вещества, облегчающие фагоцитоз бактерий (от греческого opsonein -- делать съедобным).[7]

Большинство реакций, в которых участвуют нейтрофилы, совершается в тканях. Поэтому адгезивность, характеризующая способность клеток прикрепляться и задерживаться на определенных субстратах, имеет важное значение при оценке функционального потенциала нейтрофильного гранулоцита.

Нейтрофильные гранулоциты способны осуществлять киллинг микроорганизмов с помощью двух принципиально различных механизмов: кислородозависимого и кислороднезависимого.

К кислородзависимому пути относят «респираторный взрыв», который развивается при взаимодействии нейтрофилов с объектами фагоцитоза. Кислородзависимый механизм не является системой жизнеобеспечения нейтрофила, который хорошо переносит гипоксию и нормально выполняет ряд функций (например, поглощение) в условиях анаэробиоза. «Респираторный взрыв» относится к серии метаболических процессов, имеющих место при стимуляции нейтрофилов: увеличение потребления кислорода и усиление окисления глюкозы в пентозофосфатном цикле (ПФП), и как результат этого - продукция активных форм кислорода, обладающих бактерицидным действием и обеспечивающих цитотоксический эффект в отношении опухолевых клеток. Именно на регистрации интенсивности «респираторного взрыва» основаны многие клинико-диагностические методы оценки состояния организма, в частности и хемилюминесцентный анализ.

2. Хемилюминесцентный анализ оценки активности нейтрофильных гранулоцитов

Одним из наиболее перспективных методов, позволяющих оценить функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ.

Хемилюминесцентный анализ позволяет получать информацию о нативном состоянии и функциональной активности клеток. Установлена возможность непосредственного исследования клеточного ответа при воздействии физиологических и патологических агентов. Доказан высокий уровень корреляции между уровнем хемилюминесценции фагоцитов и киллингом. [8]

В связи с этим, определение хемилюминесценции нейтрофилов может использоваться как один из критериев их способности к завершенному фагоцитозу. Уровень хемилюминесценции нейтрофилов характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие (супероксидный анион-радикал, перекись водорода, гидроксильный радикал, синглетный кислород и др.). [8]

Метод регистрации ХЛ клеток крови позволяет проводить изучение и отбор иммуномодулирующих фармакологических препаратов на основании сравнения люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции до и после введения в пробу с лейкоцитарной взвесью исследуемых препаратов. [8]

Хемилюминесцентный тест является высокочувствительным и безопасным методом диагностики непереносимости лекарственных средств. В случае непереносимости инкубация цельной крови с раствором этих препаратов в терапевтических концентрациях сопровождается достоверным снижением генерации активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными неспецифическими активаторами. Снижение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови при непереносимости лекарственного препарата отмечается независимо от химических свойств и принадлежности медикаментов к фармакологическим группам.

2.1 Основные стадии хемилюминесцентного анализа

Явление хемилюминесценции - свечения, сопровождающего химические реакции, - все более широко используется в практических целях, поскольку позволяет создать ультра чувствительные и специфические методы анализа различных биологических субстратов. Хемилюминесценция (ХЛ) обусловлена, реакциями экзотермического типа и протекает, как правило, в три стадии: [9]

1. Восстановление одного из участников реакции (присоединение электрона) и окисление второго (отрыв электрона), что приводит к запасанию химической энергии в системе, которая позднее выделится в виде фотона. [9]

2. Перенос электрона (окислительно-восстановительная реакция) на один из более высоких энергетических уровней и образование продукта реакции в электронно- возбужденном состоянии. [9]

3. Высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция). Обычно химические реакции, сопровождающиеся свечением, протекают через целый ряд промежуточных стадий, но основные этапы образования и испускания энергии сходны. [9]

Хемилюминесцентный метод позволяет регистрировать короткоживущие свободные радикалы, которые можно разделить на четыре группы: а) свободные радикалы (CР) активных форм кислорода, б) СР липидов, в) СР, осуществляющие ферментативное дыхание в митохондриях, г) СР естественных антиоксидантов.

2.2 Свободные радикалы хемилюминесценции клеток

Живые клетки - фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги) сами образуют активные формы кислорода при их стимулировании. При этом наблюдается хемилюминесценция, особенно яркая в присутствии люминола (или люцигенина). В качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же "хемилюминесцентные ответы" можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название "стимулов". Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола - ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т.е. выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается про возникновение в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются. [11]

Уровень хемилюминесценции при фагоцитозе характеризует интенсивность "респираторного взрыва" в клетках с продукцией активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие. Первичными метаболитами активированного кислорода являются супероксидный анион-радикал (О2*), перекись водорода (Н2О2), гидроксильный радикал (ОН*), синглетный кислород (1О2). В качестве основных вторичных метаболитов необходимо отметить гипохлорную кислоту (HOCl), хлорамины и продукты перекисного окисления липидов. Взаимопревращения первичных и вторичных оксидантов с мощным энергетическим потенциалом создают динамический спектр молекул, которые прямо или косвенно вовлекаются в реакции фагоцитов. При этом, взаимодействие высокоэнергетических оксидантов с люминесцирующими посредниками (люминол, люцигенин и др.) приводит к переходу последних в электронно-возбужденное состояние, выход из которого сопровождается испусканием кванта света. Регистрация светоизлучения хемилюминесцентной реакции производится на хемилюминометрах отечественного или зарубежного производства.

В целом, о каком бы разнообразии конечных и промежуточных эффекторов не шла бы речь, в основе реактивной хемилюминесценции лежит прямое или опосредованное вовлечение кислорода в образование высоко реактогенных молекул, излучающих свет. Главное содержание таких реакций - мобилизация кислорода активированными клетками - сближает хемилюминесценцию с реакцией восстановления нитросинего тетразолия (НСТ). Следовательно, отмечая объективные преимущества хемилюминесцентного анализа, необходимо помнить о базисной информации накопленной при использовании в клинической практике НСТ-теста.

2.3 Применение хемилюминесцентного анализа

В патогенезе многих болезней и патологических процессов играет важную роль оксидативный стресс. Метод ХЛ оказывается полезным при изучении таких патологий, поскольку дает возможность измерять уровень свободных радикалов (АФК, NO), оценивать параметры антиоксидантной защиты и влияние антиоксидантов. Хемилюминесценцию успешно применяют при изучении иммунных нарушений, нарушений метаболизма, дисфункции эндотелия, ишемии/реперфузии миокарда и мозга, онкологических и воспалительных заболеваний, а также многих других болезней, патогенез которых связан с оксидативным стрессом. [12]

Свободные радикалы - важные участники регуляторных процессов в живых клетках, но одновременно - причина повреждения клеточных структур и триггер, запускающий каскад реакций самоуничтожения. Их ведущая роль в развитии практически всех болезней пожилого возраста и старении организма общепризнана и является объектом многочисленных исследований. Однако средняя по времени (стационарная) концентрация этих активных частиц в живой клетке очень мала, и их прямое обнаружение обычными биохимическими методами практически невозможно. Метод хемилюминесценции основан не на анализе веществ, а на измерении скорости реакций, сопровождающихся свечением, а именно такие реакции характерны для свободных радикалов. [12]

Наиболее известные хемилюминесцентные реакции в биохимических системах - собственное (сверхслабое) свечение при цепном окислении липидов, реакции люминола с АФК (гидроксильным радикалом и супероксидом) и органическими радикалами, реакции люцигенина и ряда производных люциферинов с супероксидным радикалом. Все они включают в себя на определенном этапе взаимодействие двух радикалов, которое позволяет образовавшейся молекуле накопить такое количество энергии, что ее оказывается достаточно для излучения фотона конечных продуктов. [12]

Метод ХЛ стал одним из основных методов изучения свободнорадикальных процессов в научных и клинических исследованиях.

3. Объект исследования

Во время проведения анализов мы использовали кровь потенциально здоровых людей. Кровь взята из локтевой вены на голодный желудок. Медицинское учреждение, в котором брали кровь - Красноярский Краевой Центр Крови №1.

3.1 Хемилюминесцентный анализ

В методе хемилюминесцентного анализа используют такие реактивы как:

· Раствор Хенкса

· Уксусная кислота

· Люминол или люцигенин в концентрации 100 мкг/мл

· Зимозан или бактериальная суспензия Staphylococcus epidermidis или Staphylococcus aureus в концентрации (0,4 ОП)

· Физиологический раствор.

Метод хемолюминесцентного анализа основан на регистрации квантового потока, образующегося при переходе вещества из электронно-возбужденного в основное состояние. Наибольшее значение этот метод приобрел в исследовании воспалительных процессов, сопровождающихся образованием клетками активных форм кислорода (супероксидного анион-радикала, гидропероксидного и гидроксильного радикалов, пероксида водорода, синглетного кислорода). Вследствие низкой интенсивности собственного свечения исследуемых образцов при хемилюминесцентном исследовании используются вещества, в частности люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4 фталазидинедион), способные многократно усиливать световой поток, который затем регистрируется датчиком и отображается в виде графика. По оси Х откладывается время, по оси Y - интенсивность излучения, характеризующая число квантов света, попадающих на единицу поверхности датчика. Кривая ХЛ исследуемых клеток характеризуется уровнем спонтанной (ХЛсп) и активированной (ХЛакт) люминесценции (рис. 2). Для активации клетки использовался зимозан. [13]

Рисунок 2 - График ХЛ фагоцитирующих клеток. Стрелкой на шкале времени показан момент активациии клеток зимозаном

«1. Лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 500g. Супернатан сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл Хенкса и получают взвесь.

2. Для подсчета клеток в планшет добавляют 40 мкл уксусной кислоты и 10 мкл лейковзвеси и подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева в 5 больших квадратах по диагонали. Количество клеток определяют по формуле (Х1*11*1000)/0,02=(Х2/2000000)-1 количество Хенкса необходимое добавить к 1 мл лейкоцитарной суспензии, где Х1 - суммарное количество клеток в 5 квадратах, Х2- количество нейтрофилов в1 мл суспензии (необходимое количество клеток 2*10 в 6 степени).

3.Для проведения хемилюминесцентного анализа используют следующие реактивы: донорскую сыворотку (группа крови АВ резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол или люцигенин в концентрации 100 мкг/мл.

· Готовят пробу: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола или люцигенина и 40 мкл зимозана или бактериальной суспензии Staphylococcus epidermidis или Staphylococcus aureus в концентрации (0,4 ОП).

· Бактериальную взвесь делают из суточной бактериальной культуры, которую разводят в 3 мл физиологического раствора.

· Концентрацию клеток измеряют на приборе КФК-2 при л=590 им относительно физ.раствора, затем доводят физиологическим раствором концентрацию бактериальной суспензии до 0,4 ОП.

4.Хемилюминесцентный анализ проводят в 8 кюветах (в первых 4 используем люминол; во вторые 4 добавляем люцигенин). Спонтанная хемилюминесценция осуществляется без добавления индуктора, во вторую кювету добавляют зимозан, в третью бактериальную суспензию Staphylococcus epidermidis, в четвертую Staphylococcus aureus при помощи хемилюминесцентного анализатора, например, «CL.3604» в течение 90 мин. Регистрация результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляется через компьютер. Получают кривую хемилюминесценция. Определяют величину Tmax Imax Smax для каждого показателя (спонтанная хемилюминесценция, зимозан-зависимая хемилюминесценция и стафилококк-зависимая хемилюминесценция)».

О функциональном состоянии нейтрофилов судили по величине спонтанной ХЛ, активированной ХЛ и хемилюминесцентному индексу - Ихл, отражающему резервные возможности клеток:

где ХЛсп - максимальный показатель спонтанного теста, ХЛакт - максимальный показатель стимулированного теста хемилюминесценции. [13]

В ФБГУ НИИ МПС СО РАМН ведется набор контрольной группы. Поэтому в результатах своей работы я представляю такой набор. Для составления контрольной группы было проведен метод хемилюминесцентной активности нейтрофилов крови 15 практически здоровых людей. Были получены следующие данные:

Таблица 1 - Хемилюминесцентная активность нейтрофилов

Таблица 2 - Хемилюминесцентная активность нейтрофилов Продолжение

Результаты ХЛ анализа характеризовали по следующим параметрам: по времени выхода на максимум интенсивности (Tmax), по максимальному значению интенсивности ХЛ (Imax) и площади под кривой интенсивности ХЛ (S). Усиление ХЛ, индуцированной зимозаном, оценивали соотношением площади индуцированной (S2) к площади спонтанной (S1) и определяли как индекс активации.

Заключение

1. Проанализирована научная литература.

2. Был освоен метод хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов.

3. Получены данные хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов у практически здоровых людей.

Размещено на Allbest.ru