Молекулярно-биологические методы диагностики в вирусологической практике

Размещено на http://www.allbest.ru/

Минобрнауки России

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Южный федеральный университет»

Факультет биологических наук

Реферат

По дисциплине: «Вирусология»

На тему: «Молекулярно-биологические методы диагностики в вирусологической практике»

Выполнил: студент II курса, 2 гр.

Герасименко А.А.

Ростов-на-Дону, 2014

План

Введение

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.1 Выделение ДНК (РНК)

1.2 Амплификация специфических фрагментов ДНК

1.3 Детекция продуктов амплификации

2. ПЦР в режиме реального времени

3. ДНК-гибридизация

4. Биочипы

5. Метод обратной генетики

6. Секвенирование вирусных геномов

Введение

В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков.

Наиболее широкое применение получили следующие молекулярно-биологические методы; полимеразная цепная реакция, метод молекулярно-биологической амплификации, гибридизации in situ и другие, позволяющие диагностировать практически всех важных в человеческой патологии вирусов в короткий период времени.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В основе метода ПЦР, как инструмента лабораторной диагностики инфекционных заболеваний лежит обнаружение небольшого фрагмента ДНК возбудителя (несколько сот пар оснований), специфичного только для данного микроорганизма, с использованием полимеразной цепной реакции для накопления искомого фрагмента.

Методика проведения анализа с использованием метода ПЦР включает три этапа:

1. Выделение ДНК (РНК) из клинического образца

2. Амплификация специфических фрагментов ДНК

3. Детекция продуктов амплификации

1.1 Выделение ДНК (РНК)

На данной стадии проведения анализа клиническая проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций, и получение раствора ДНК или РНК, свободной от ингибиторов и готовой для дальнейшей амплификации.

Выбор методики выделения ДНК(РНК) в основном определяется характером обрабатываемого клинического материала.

1.2 Амплификация специфических фрагментов ДНК

На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции.

Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает несколько (20-40) циклов.

Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающих в различных температурных режимах:

1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали). Протекает при 93-95°C в течение 30-40 сек.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65°С. Время отжига -20-60 сек.

3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное достраивание цепей ДНК происходит от 5'-конца к 3'-концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей ДНК служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой) и проходит при температуре 70-72°С. Время протекания синтеза - 20-40 сек.

Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амлификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

1.3 Детекция продуктов амплификации

В большинстве методик на данном этапе проводится разделение смеси продуктов амплификации, полученной на 2-ой стадии, методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. До проведения электрофоретического разделения, к амплификационной смеси добавляется раствор бромистого этидия, образующий с двухцепочечными фрагментами ДНК прочные соединения внедрения. Эти соединения под действием УФ-облучения способны флуоресцировать, что регистрируется в виде оранжево-красных светящихся полос после электрофоретического разделения амплификационной смеси в агарозном геле.

2. ПЦР в режиме реального времени

Метод, который используется для определения концентрации ДНК.

В данном методе реализованы общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что при проведении Real-Time ПЦР одновременно происходят амплификация, детекция и количественное определение специфической последовательности ДНК в образце. Также отличительными чертами данного метода являются отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматические регистрация и интерпретация полученных результатов.

Измерение происходит в реальном времени после каждого цикла амплификации. Можно определять непосредственно количество копий ДНК, либо количество копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов.

Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени применяются следующие наиболее распространенные подходы: 1) использование модифицированных олигонуклеотидов (зондов), которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК [TaqMan-зонды (данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной активности полимеразы; 2) использование флуоресцентных красителей, интеркалирующих в двухцепочечные молекулы ДНК и 3) использование двух зондов с резонансным переносом.

полимеразный амплификация секвенирование вырусный

3. ДНК-гибридизация

· Двухцепочечную ДНК разогревают в соответствующем буфере. Из-за изменения внешних условий водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями становятся термодинамически невыгодными и цепочки расходятся.

· Препарат денатурированных ДНК смешивают с другой денатурированной ДНК.

· Препараты медленно охлаждают, при этом одноцепочечные ДНК гибридизуются друг на друга (образуются водородные связи между комплементарными основаниями), при этом образуется «гибридная» молекула ДНК.

Анализ скорости отжига (= гибридизации) одноцепочечных ДНК позволяет оценивать сходства и различия в последовательностях ДНК между видами или особями одного вида.

4. Биочипы

Точнее всего биочипы описывает английское название DNA-microarrays, т.е. это организованное размещение молекул ДНК на специальном носителе в специальных ячейках. Профессионалы называют этот носитель «платформой». Платформа -- это чаще всего пластинка из стекла или пластика (иногда используют и другие материалы, например кремний), на которую наносится ДНК, способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе.

Характерные размеры ячеек современных микрочипов лежат в пределах ~50-200 микрон, общее число ячеек на чипе составляет 103-105, а линейные размеры чипа ~1см.

Смысл метода. Иммобилизируемая ДНК наносится на поверхность через игольчатые растры (пины) механического робота или с помощью технологии струйного принтера. Контроль качества нанесения осуществляется с помощью специализированной оптики и компьютерного анализа изображения. На биочипе, в дальнейшем, гибридизуют молекулы ДНК, меченые красителем. Гибридизуемая ДНК в растворе метится с помощью флуоресцентной или радиоактивной метки. Интенсивность флуоресценции в ячейках измеряют с помощью сканера или люминесцентного микроскопа, передающего сигнал на прибор с зарядовой связью. Данные о характере гибридизации также можно получить также с помощью масс-спектрометрии, атомной силовой микроскопии и др.

Принцип работы. В основе принципа работы всех типов биочипов с иммобилизированной ДНК лежит точное соответствие между комплементарными ДНК по правилу Уотсона-Крика, А-Т, Г-Ц. Если соответствие между нуклеотидами иммобилизированной и гибридизуемой ДНК точно удовлетворяет условиям комплементарности, то образующиеся дуплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при конечных температурах их будет больше, чем несовершенных дуплексов с нарушением условий комплементарности, и соответственно совершенным дуплексам будет отвечать более сильный сигнал флуоресценции. В выявлении и сопоставлении наиболее ярко светящихся ячеек и заключается работа прибора-анализатора биочипов.

5. Метод обратной генетики

Метод обратной генетики - это инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности.

Принцип. Внесение мутаций в РНК-геномы вирусов, в ходе чего РНК переводится в форму кДНК, а потом получается измененная РНК. Схематически: РНК-геном - кДНК - измененная кДНК - измененный РНК-геном - измененный вирус. Такой вирус отличается от исходного вируса не случайными, а целенаправленно внесенными мутациями. С практической точки зрения возможность манипуляции вирусной генетической информацией может быть использована для: 1) изучения генетики вирусов и роли каждого гена, каждого генного участка, каждого фактора, влияющего на функции генов; 2) создания новых полезных штаммов, например вакцинных штаммов и на их основе - вакцин.

6. Секвенирование вирусных геномов

Данные о нуклеотидной последовательности генома являются наиболее полной молекулярно-биологической характеристикой вируса и позволяют точно идентифицировать исследуемый штамм, проанализировать степень родства с другими вирусами, а также отличить от практически идентичных вариантов того же вируса. Таким образом, имея данные о полной нуклеотидной последовательности генома вируса, исследователь способен определить его абсолютную идентичность или отличия, даже минимальные, от других вирусов, а в некоторых случаях и воссоздать исходный вирус.

Принцип состоит в использовании двух основных положений:

А) Если к ДНК-матрице добавить специфичный праймер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, ДНК-полимеразу и проводить реакцию в подходящих солевых и температурных условиях, то все синтезирующиеся цепи ДНК будут начинаться с одинаковой стартовой точки.

Б) Если в такую смесь добавить какой-либо (из 4 возможных) дидезоксирибонуклеотид, например ддАТФ, то все растущие цепи будут специфически терминироваться после его внесения. В результате продукты реакции будут представлять собой набор одноцепочечных ДНК, начинающихся от одной точки и заканчивающиеся на ддАТФ. Для идентификации данных, полученных таким способом, необходимо электрофоретическое разделение этих смесей фрагментов в условиях позволяющих отличать сигналы индивидуальных фрагментов, различающихся по длине на нуклеотидных остаток.

Пилотной задачей проекта всегда является получение хотя бы небольшой достоверной нуклеотидной последовательности изолята, для которого планируется определение полной последовательности генома. Это позволяет подтвердить правильность отношения вируса к данной группе, найти максимально гомологичную родственную последовательность в базе данных (использовать ее в дальнейшем для сравнения и выбора праймеров) и подобрать хотя бы один праймер для дальнейшей работы, в котором можно быть полностью уверенным.

Размещено на Allbest.ru