18

Размещено на http://www.allbest.ru/

Значение протеомного состава мочи при заболеваниях мочевыводящих путей (обзор литературы)

Захарова Н.Б., Пастушкова Л.Х., Ларина И.М.,

Каширина Д.Н., Лях Р.Н., Попков В.М.

В настоящее время развитие методов персонализированной медицины (ПМ) основано на выборе диагностических, лечебных и профилактических средств, которые были бы оптимальными для пациента, с учетом его генетических особенностей. Для внедрения диагностических подходов персонализированной медицины необходим отбор надежных, интерпретируемых и эффективных биомаркеров и создание на их основе диагностический панелей. Не менее важно и формирование инфраструктуры для тестирования биомаркеров [1,2].

Одним из направлений совершенствования методов персонализированной медицины является клиническая протеомика, задачи которой - поиск биомаркеров различных заболеваний. Прежде всего - это протеомика жидкостей тела человека, крови и мочи [2]. Белки, выявляемые в моче, имеют различное происхождение: одни из них фильтруются из плазмы крови, другие поступают из мочевого тракта. Считается, что белки мочи неплазменного происхождения составляют примерно 50% от всех белков мочи. К ним относятся белки, поступающие из мочеточника, мочевого пузыря, мочеиспускательного канала, добавочных половых желез и почек [3]. Сейчас протеомными методами в моче обнаруживают более 3 тыс. различных белков [4]. Это открывает значительные возможности для поиска биомаркеров, откликающихся на заболевание почек или мочеполового тракта, таких, например, как почечная недостаточность в результате гипертонической и диабетической нефропатии, врожденной обструктивной нефропатии, волчаночном нефрите, уролитиазе и при недержании мочи [5,6,8-17]. Полученные результаты исследования белкового состава мочи подтвердили перспективность использования и диагностическое значение целого ряда мочевых молекулярных маркеров для оценки состояния почечной паренхимы, мочевыводящих путей, заболеваний сердечно-сосудистой системы и др. [10]. В современных руководствах и клинических рекомендациях, как отечественных, так и зарубежных, до настоящего времени в диагностике заболеваний почек насчитывается только несколько маркеров повреждения паренхимы почек: повышение мочевины, креатинина, электролитные нарушения, снижение скорости клубочковой фильтрации, другие изменения в анализах мочи (альбуминурия, протеинурия и др.) [18-22]. Как показывают многочисленные исследования, высокий сывороточный креатинин не всегда специфичен для повреждения почек. Его уровень может изменяться в зависимости от многих не ренальных факторов (возраст, пол, мышечная масса, статус обезвоживания и др.). Показано, что до 50% ренальных функций может быть утрачено еще до повышения уровня креатинина [22]. То есть уровень креатинина не отражает нарушение функции почек до того момента, пока не разовьется патологическое состояние. Поиск надежных, специфичных, доступных лабораторных маркеров, которые могут широко применяться в клинической практике, на ранних стадиях поражения почек представляет собой одно из актуальных направлений исследований.

Широкое внедрение в клиническую практику методов иммуноферментного анализа в настоящее время привело к появлению целого ряда исследований, в которых повышенные концентрации в моче интерлейкинов IL-1 в, IL-6, IL-8, рецепторного антагонониста IL-1 (IL-1RA), фактора некроза опухолей (TNF-a), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1) и С-реактивного белка (CRP) в моче, определенные методом иммуноферментного анализа (ИФА), были успешно использованы в качестве показателей активности воспалительного процесса и фиброзной трансформации тубулоинтерстициальной ткани почек при пиелонефритах [19, 20,23,24]. Показано, в частности, что количественный анализ IL-6, IL-8, МСР-1, IL-1RA и CRP в моче больных первичным пиелонефритом позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью диагностировать ранние стадии развития воспаления, а VEGF - определить степень ишемии почечной паренхимы и прогнозировать развитие интерстициального фиброза [21,25]. Также выявлено, что определение концентрации ряда цитокинов и CRP в моче может быть широко использовано в клинико-диагностических лабораториях для оценки выраженности воспалительных процессов в мочевыводящих путях и контроля эффективности нефропротективной терапии [22,26]. Установлено, что для диагностики прогрессирования заболеваний почек может быть использовано определение в моче провоспалительных цитокинов и хемокинов, а для оценки ишемии почечной паренхимы - анализ фактора роста эндотелия сосудов и матриксных металлопротеиназ (ММР) с помощью коммерческих наборов реагентов для ИФА [21,23,26]. Вышеупомянутые белки мочи приобретают важное клиническое значение и рассматриваются в качестве маркеров тяжести, прогрессирования и исхода заболеваний, приводящих к формированию хронической болезни почек. В экспериментальных и клинических исследованиях определен еще ряд лабораторных маркеров, определяемых в сыворотке крови и моче, которые могут отражать степень повреждения почечной ткани и развитие процессов тубулоинтерстициального фиброза до наличия нарушения функции почек, определяемых рутинными методами, указанными в клинических рекомендациях по диагностике и лечению заболеваний почек [24,25, 26,27]. Так, белок, связывающий витамин D, ретинол-связывающий белок, 62-микроглобулин и альфа1-микроглобулин, считаются мочевыми маркерами канальцевой дисфункции и позволяют предположить патологическое отклонение от нормальной канальцевой реабсорбции [28,29]. В последние годы предложен ряд биомаркеров, которые определяются и в крови и моче, и могут быть использованы для оценки повреждения почек на ранних стадиях. Большинство биомаркеров представляют собой соединения и белки, экскретируемые канальцевым аппаратом почки при его повреждении различными агентами (бактериальными и т.д.) [30]. Это - цистатин С/Cystatin C в крови, рассматриваемый как потенциальный ранний биомаркер острого повреждения почек. Однако цистатин C в настоящее время не считается непосредственным маркером почечного тубулярного повреждения, а скорее альтернативным креатинину, более точным тестом для оценки скорости клубочковой фильтрации. Также нейтрофильный желатиназно-ассоциированный липокалин/Neutroрhil geletinase-associ-ated lipocalin (NGAL), определяемый в моче, имеет прямую корреляционную связь с уровнями креатинина, величиной СКФ, активностью ферментов мочи (ЛДГ, ЩФ) [31,32]. Молекула почечного повреждения - 1 (Kidney injury molecule-1, KIM-1) также имеет высокую чувствительность для выявления формирующегося острого повреждения почек. Уровни К1М-1 в моче относятся к наиболее прогностически значимым маркерам неблагоприятного исхода заболевания. Противовоспалительный цитокин (интерлейкин 18,Urinary interleukin-18 (IL-18) считается маркером агрессивного нефротоксического воздействия проводимой терапии [33]. Перечисленные биомаркеры могут быть включены в рекомендации для оценки степени восстановления функции почек, повторных эпизодов острого повреждения почек или ухудшения течения уже имеющейся хронической болезни почек.

Результаты исследования этих биомаркеров при хронических и злокачественных новообразованиях почек и мочевыводящих путей в динамике дают возможность подобрать больному адекватные методы лечения, позволяющие остановить или замедлить прогрессирование заболевания.

МЕТОДЫ ПРОТЕОМНОГО АНАЛИЗА МОЧИ, ОБОРУДОВАНИЕ, ПОСТАНАЛИТИЧЕСКИЙ ЭТАП АНАЛИЗА РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Одной из самых мощных и широко применяемых в целях поиска биомаркеров технологий является масс-спектрометрия, позволяющая получать информацию сразу о сотнях белков. Современные MALDI-TOF и другие масс-спектрометры отличаются высокой производительностью и могут быть оптимизированы к рутинному использованию для подробного анализа пептидов и полимеров.

протеомный состав моча медицина

Высокочувствительные масс-спектрометрические методы способствовали получению новых данных о белковом составе жидкостей тела человека как в норме, так и при патологии. Считается, что наиболее значимые успехи в плане практического применения масс-спектрометры имеют в области исследований протеома мочи [34]. Современные методы разделения белковых смесей и определения отдельных компонентов этих смесей с применением масс-спектрометрии позволили определить в образцах мочи человека до 3500 различных белков [35]. Современная диагностика изменений белкового состава мочи с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии в течение ряда лет успешно применяется сотрудниками лаборатории "Протеомики" Института медико-биологических проблем в исследованиях протеомного состава мочи при действии реальных и моделируемых факторов космического полета. Успешно решен ряд сложных проблем, сдерживающих продвижение исследований в физиологии и клинике. Отработана система пробоподготовки, стандартизирован ее преаналитический этап применительно к такому клиническому биоматериалу, как моча.

Нивелирован целый ряд недостатков программного обеспечения, затрудняющих достоверную интерпретацию результатов. Тщательно разработан весь процесс, требуемый для исследования протеомного состава мочи, включающий:

Преаналитический этап - сбор мочи, методы проведения пробоподготовки. Установлено, что аналитическая воспроизводимость исследования белкового состава мочи масс-спектрометрическими методами не зависит от продолжительности замораживания, образец остается стабильным в течение нескольких лет, даже при хранении при - 20°C. Воспроизводимость поддерживается и в образцах, сохраняемых до 5-6 часов при комнатной температуре, или до трех дней при 400С, за счет небольшого количества про-теаз в данном биологическом материале. Пробоподготовку для дальнейшего анализа протеомного состава мочи осуществляют согласно стандартному протоколу (протокол обработки мочи для скрининга, HUPO-2007, Сеул, Корея) [36].

Аналитический этап - при получении масс-спектров применяют различные хромато-масс-спек-трометрические системы. Например, система может состоять из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и гибридного масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия). В этом случае хроматографическое разделение смеси белков после трипсино-лиза проводят на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ) Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., Санта-Клара, США). Для градиентной хроматографии применяют home-made колонку с использованием капилляра-эммитера (Pico-tip, New Objective Inc., США), описанную Y. Ishihama и др. [37].

Как правило, из каждого образца мочи получают два образца триптической смеси, которую анализируют трижды на масс-спектрометре. Для последующего анализа отбираются лишь те белки, которые были обнаружены в двух или трех повторах. Целесообразность такой "строгости" оспаривается рядом специалистов, работающих с образцами мочи (частные дискуссии). Их аргументация сводится к доводу, что если в образце однажды (в одном из прогонов) был достоверно идентифицирован тот или иной белок, то это свидетельствует о том, что он есть в образце, и скорее надо критиковать те масс-спектрометрические прогоны, в которых он не выявлялся. В качественной протео-мике мочи о динамике изменения протеома судят по частоте встречаемости белков в образцах, считая, что факт обнаружения белка в образце, при сохранении чувствительности LC/MS метода, связан с его концентрацией.

Постаналитический этап - применение комплекса современных биоинформационных технологий, включающих в себя:

1. Поиск и идентификация белков по базе данных IPI-human при помощи программы Mascot;

2. Обработка с помощью уникальной программы, разработанной в лаборатории профессора Е.Н. Николаева [38], результатов Mascot-поиска;

3. Применение комплекса биоинформационных ресурсов для определения места образования, функции выявленных в моче белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют;

4. Анализ ткане-специфичности экспрессии и тканевой локализации белков; определение молекулярных функций, биологических процессов и клеточной локализации; сверхпредставленности биологических процессов, молекулярных функций, связанных с выявленными белками; построение ассоциативных генных сетей между белками.

Для определения места образования в организме и биологической функции выявленных белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют, применяют следующие био-информационные ресурсы: UniPro-tKB [http://www.uniprot.org/], TiGER [http://-bioinfo. wilmer. jhu.edu/tiger/], Gene Ontology [http://geneontology.org/]. Для определения сверхпредставленных биологических процессов используют программу BiNGO со следующими параметрами: статистический критерий - гипергеометрический критерий; поправка на множественное сравнение Бенжамина Хохберга; уровень значимости: 0,05; референсная выборка - полная аннотация, как референсная выборка; файл онтологии - Custom, Gene Ontology (format-version: 1.2 data-version: 201308-21); организм/аннотация: GO Annotation_Human (Submission Date: 8/5/2013).

ТРУДНОСТИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВОГО СОСТАВА МОЧИ ЧЕЛОВЕКА ПРОТЕОМНЫМИ МЕТОДАМИ

Существуют объективные и до сих пор не преодоленные трудности в интерпретации результатов исследования протеома мочи, в определенной степени сдерживающие широкое использование технологий протеомики в клинической области. Их можно условно разделить на следующие категории.

1. Высокая индивидуальная ("продольная") вариабельность протеома мочи. При сопоставлении белкового состава образцов мочи одного и того же человека (здорового или пациента в процессе диагностики, или мониторинга терапии) необходимо увидеть значимые изменения в составе и по ним сделать заключение того или иного характера. При этом нельзя не принимать во внимание, что белковый состав мочи, главным образом, зависит от:

· белкового состава крови (вариабельность которого, при изучении методами протеомики на основе масс-спектрометрии, составляет около 25% [38]. По данным О.М. Трифоновой индивидуальная вариабельность белкового состава крови здоровых добровольцев в контролируемых условиях, исследованная на протяжении 3 недель, составила 22±13% [39].

· вариабельность белкового состава мочи зависит также от актуальной функции почки, как эффекторного органа поддержания водно электролитного гомеостаза внутренней среды организма. Этот аспект практически не исследован, за исключением небольшого числа работ, выполненных с участием здоровых добровольцев или пациентов разных нозологических групп.

Сообщается, что "продольная" вариабельность белкового состава мочи при масс-спектрометрическом исследовании составляет 45%, или достигает 58% [40, 41]. По нашим данным, полученным при исследовании здоровых добровольцев в контролируемых условиях потребления основных нутриентов, жидкости, двигательной активности, состава атмосферы в замкнутом объекте - даже численный состав белков в моче может сильно варьировать при сравнении двух последовательных недель наблюдения (рис.1) [42]. При исследовании проб мочи 30,7% из числа выявляемых прямым профилированием пиков у здорового человека имеют "продольную" вариабельность, вдвое превышающую аналитическую на протяжении времени обследования в 3 месяца [43].

Рис. 1. Изменения белкового состава мочи, собранной еженедельно (при сравнении двух последовательных недель)

ТРУДНОСТИ ИНТЕРПРЕТАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПРОТЕОМИКИ МОЧИ

Получение количественных данных об экскреции различных белков почкой методами протеомики на основе масс-спектрометрии сейчас абсолютно реально. Разработано множество методических подходов, дающих воспроизводимые и точные, в том числе количественные, данные по протеому мочи человека [44,45,46]. Тем не менее, эти прорывы в приборостроении, разработке различных методов намного опередили возможности использования их результатов медиками в диагностических и других целях.

Еще два десятилетия назад были получены результаты исследований, которые говорили о возможности увеличения экскреции белка, зависящей от некоторых непатологических факторов, таких как интенсивная физическая нагрузка, ортостаз, лихорадка, эмоциональный стресс. Увеличение экскреции некоторых белков почкой может наступать и при изменении скорости мочеотделения. Тем не менее, факторы регуляции уровня экскреции белка почкой не описаны. Остаются открытыми вопросы о пределах вариабельности и механизмах влияния процессов, лежащих в основе мочеобразования, на уровень экскреции белка в норме. Это обстоятельство не дает возможности установить референсные интервалы для экскреции различных белков с мочой. Выяснение условий развития физиологической протеинурии представляет безусловный интерес, как для нормальной физиологии, так и для практической медицины.

Это затруднение использования количественных протеомных данных имеет и другой аспект. Как отмечалось выше, почка является исполнительным органом физиологической системы, которая поддерживает важнейшие гомеостатические константы внеклеточной жидкости организма. Формирование мочи того или иного состава в каждый конкретный момент времени определяется насущными актуальными задачами, входящими в эту функцию почки. Достаточно часто, например, при изменении уровня поступления жидкости в организм (увеличение или уменьшение в силу разных причин объема выпиваемой жидкости), или во время длительного перерыва в питье (ночной сон), а также в других обычных условиях жизни - почка усиливает выведение воды, или задерживает воду, реабсорбируя ее назад, в организм. Эти реакции по разбавлению или концентрированию мочи, а также изменению ее электролитного состава (концентраций Na, K, Ca, Cl) не могут не влиять на содержание в моче различных белков. Эти предположения находят экспериментальное подтверждение.

Так, А.В. Кутиной в экспериментах со здоровыми добровольцами во время введения водной нагрузки показано, что скорость экскреции альбумина остается в пределах нормальных значений - до 20 мкг/мин, а суммарная экскреция белков растет [47]. Это свидетельствует о выраженной селективности деятельности канальцев. Т.е. экскреция альбумина за 2 ч после приема воды возросла в меньшей степени, чем суммарная экскреция белков, что приводит к тому, что доля альбуминов в экскретируемом общем белке снижается с 4,4% до 1,5%. Следовательно, либо прирост выделения белков зависит от неодинакового увеличения фильтрации различных белков в клубочках, либо у человека достаточно велико значение максимальной реабсорбции альбуминов в проксимальном канальце по сравнению с другими белками, и поэтому альбумины в большей степени реабсорбируются, чтобы быть сохранными для нужд организма. По-видимому, при водной нагрузке и увеличении диуреза растет выделение белков почкой и меняется соотношение различных белков в моче по сравнению с исходным периодом [47]. Сравнительное исследование экскреции белка почкой при разных типах диуреза у животных (Rattus norvegicus var. albino, Rana temporaria) и человека свидетельствует, что полиурия сопровождается увеличением выведения с мочой белков, которое, вероятно, зависит от участия V1-рецепторов, изменения продукции N0, но не ангиотензина II [48].

Таким образом, учет скорости мочеотделения при клинической оценке протеинурии остается актуальной задачей. Но, кроме того, современные математические модели, разработанные на основе экспериментальных данных, полученных в опытах in vivo на изолированных перфузируемых почках, выделенных нефронах и т.д., показывают, что как проницаемость гломерулярного фильтра для белков, так и скорость реабсорбции белков в проксимальном канальце, весьма чувствительны к изменениям скорости гломерулярной фильтрации (СГФ) и внутриклубочкового давления. Следовательно, все факторы и условия, включая действие фармакологических агентов, оказывающих влияние на СГФ и давление внутри клубочка, будут влиять на скорость экскреции белков почкой и на состав выводимых белков. Эти данные указывают, что необходима не только разработка требований по стандартизации условий сбора образцов мочи для количественного протеомного исследования с целью "продольного" или группового сравнения, но и стратификация этих требований для различных актуальных условий деятельности почки пациента [49].

В целом, исследования протеомного состава мочи, по нашему мнению, должны считаться перспективными с точки зрения возможности выявления новых, надежных и специфических маркеров в моче пациентов с хроническими заболеваниями почек в начальных стадиях доклинического повреждения почек. Впоследствии, для определения данной группы мочевых молекулярных маркеров могут быть разработаны отечественные экспресс-методы (point of care)"у постели больного". То есть результатом поисковых, на данном этапе, исследований станет разработка новых технологий бесприбор-ной диагностики начальных стадий поражения почек и мочевыводящих путей или отечественных мочевых полосок. В будущем данная отечественная бесприборная диагностика может стать методом диагностики заболеваний почек, доступным для любого человека, в том числе заменяющим нефробиопсию.

Литература