Биологические технологии

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Биотехнология

Биотехноломгия -- интеграция естественных и инженерных наук, позволяющая наиболее полно реализовать возможности живых организмов или их производные для создания и модификации продуктов или процессов различного назначения.

В настоящее время иммунологию, как междисциплинарная медицинская наука, изучающая строение, эволюцию и функционирование иммунной системы различных организмов (человека, животных, растений), механизмы и способы защитных реакций, направленных на сохранение их структурной и фунциональной целостности и биологической индивидуальности, разделяют на общую и частную (прикладную) иммунологию. Общая, или фундаментальная, иммунология подразделяется на молекулярную иммунологию, клеточную иммунологию, иммуногенетику, иммунотолерантность, иммунохимию, иммунокиберпетнку, эволюционную иммунологию, физикохимическую иммунологию. Она изучает структуру и функцию молекул, клеток и органов иммунной системы, ее функционирование как единой гомеостатической самоуправляемой системы, а также ее связи с другими системами -- нервной, эндокринной и т.д. Важными направлениями частной иммунологии являются иммунопрофилактика, инфекционная иммунология, иммунопатология, иммунобиотехнология, трансплантационная иммунология, иммунология репродукции, клиническая, ветеринарная, экологическая и трансгенная иммунология, иммуногенотерапия.

Иммунобиотехнология - сфера биотехнологии, основанная на иммунологии. Сюда относится индустрия диагностических тест-систем (диагностикумов) для широкого обследования распространенности инфекций, изготовление вакцин и, конечно, получение поликлональных и моноклональных антител. Такие белки как лимфокины, к которым относятся интерфероны, интерлейкины, фактор, стимулирующий колониеобразование гранулоцитов и макрофагов, фактор некроза опухолей и некоторые другие секретируются клетками иммунной системы в ответ на появление внешнего антигена. Их используют в качестве противовирусных и противоопухолевых препаратов. Производство некоторых лимфокинов отлажено и в бактериальной системе, но иногда клетки животных более приемлемы для этой цели, особенно для тех белков, которые содержат углеводный компонент. [6]

Гибридомы

В 1975 году была описана методика, позволяющая получать клеточные линии (гибридомы), секретирующие отдельные разновидности антител (моноклональные антитела) с желаемой антигенной специфичностью. Это открытие определило бурный прогресс в использовании антител как для исследовательских, так и для практических целей, и в настоящее время "гибридомная технология" является одним из основных направлений в биотехнологии.

Гибридомма -- гибридная клеточная линия, полученная в результате слияния клеток двух видов: способных к образованию антител B-лимфоцитов, полученных из селезёнки иммунизированного животного (чаще всего мыши), и раковых клеток миеломы. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после слияния и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена может поддерживаться долгое время. В 1984 г. за открытие принципа получения моноклональных антител Мильштейн, Кёлер и Ерне получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине. [1]

Описание метода

Лабораторные животные (млекопитающие, например, мыши) подвергаются иммунизации, обычно, путем нескольких инъекций антигена в течение 1-2 месяцев. Затем из селезенки получают клетки, из которых выделяют лимфоциты. Их сливают с клетками миеломы, которую выбирают так, чтобы она сама по себе не производила антитела и не имела гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (ГГФТ), что делает ее чувствительной к селектирующему агенту НАТ. Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай.

После слияния клетки в течение 10-14 дней поддерживают в среде, содержащей НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Аминоптерин блокирует синтез нуклеотидов, поэтому клетки материнской миеломы погибают. В отличие от миеломы, гибридные клетки и В-лимфоциты, имеющие ген ГГФТ, выживают за счет использования гипоксантина как источника пуринов, но продолжительность жизни обычных лимфоцитов ограничена, и через несколько недель в культуре остаются только клетки гибридомы. Поскольку не все из них образованы путем слияния миеломы с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки делят на линии, которые поддерживают в отдельных ячейках 96-луночных плашек. Далее в среде над клетками определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. При достаточно хорошем разведении клеточной суспензии в одну лунку попадает не более одной гибридной клетки, но для гарантированного качества и стабильности культуры отобранные клеточные линии могут быть еще раз клонированы с тем, чтобы антитела производились потомками одной гибридной клетки, то есть были моноклональными.

Клонированную культуру гибридомы затем пересевают из лунки 96-луночной плашки в сосуды большей емкости для размножения, хранения в жидком азоте и получения большего количества антител для дальнейших исследований. Из культуральной среды можно получить от 1 до 60 µg/ml моноклональных антител. Большее количество можно получить путем введения клеточной суспензии в брюшную полость мышей, где гибридома размножается подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости). [3]

На современном этапе созданы десятки тысяч высокоаффинных антител, связывающихся с белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами, а также низкомолекулярными антигенами. На их основе получены коньюгаты с различными функциональными соединениями, токсинами, ферментами, магнитными частицами, радиоактивными и рентгеноконтрастными атомами и т.п. Эти коньюгаты находят широчайшее применение в научных исследованиях, медицине, ветеринарии. Описаны примеры получения с помощью указанной технологии антител, обладающих каталитической активностью, так называемых абзимов (abzyme от англ. antibody и enzyme).

Клетки миеломы применяются для получения гибридом - линий клеток, производящих моноклональные антитела определенной специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции. [1]

Моноклональные антитела

Антитела давно и широко используются для нейтрализации бактериальных токсинов (дифтерийного, столбнячного), змеиных ядов (кобры, гадюк) вирусов, попавших в кровь (особенно эффективно вируса кори), и для идентификации индивидуальных белков (и других антигенов), находящихся в клетке или сложнейших тканевых экстрактах. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, возникающие в крови в ответ на введение антигена, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Такие антитела бывают нужны как для изучения их собственной природы, так и для практического использования, например для ставки в опухоли токсических веществ.

Очевидно, что путем иммунизации, то есть введением животному индивидуального антигена или только одной его детерминантной группы, это сделать, как правило, невозможно. В организме в процессе созревания антителообразующих клеток (АОК) образуется большое количество -- миллионы генетически однородных семейств клеток -- клонов, каждый из которых специализируется на синтезе только одного варианта антител, и в этом причина большого разнообразия антител, индуцируемых даже одним антигеном. Таких клонов много больше, чем требуется антител для распознавания любого, случайно взятого антигена. Антиген, попадая в организм, стимулирует размножение тех клонов, которые продуцируют антитела к его детерминантам. [2]

Казалось бы, выход прост: надо вырастить отдельные клоны антителообразующих клеток в пробирке - в культуре тканей - и они будут продуцировать моноклональные антитела, то есть антитела одной строго определенной специфичности, продукт одного клона. Но и это оказалось невозможным: нормальные клетки смертны, вскоре после высаживания в культуру они погибают. Дело не доходит до образования клонов АОК. Добавление в культуру факторов роста несколько продлевает их жизнь, но тоже не решает проблемы.

Терапия моноклональными антителами - является наиболее широко распространенной формой иммунотерапии рака в сегодняшнее время. Этот вид лечения считается одной из форм пассивной иммунотерапии, так как данные антитела производятся не в организме человека, а с помощью биотехнологии. Эта терапия мобилизует иммунную систему самого больного только на последующих этапах лечения. [9]

Моноклональные антитела терапия использует антитела, которые производятся в лаборатории, а не по собственной иммунной системы человека. Первые моноклональные антитела, были проведены в лабораторных условиях путем слияния клетки миеломы (типа рак костного мозга) от мыши с мышиной B-клеткой, что позволило получить антитела одного клона. Получившуюся клетку, называют гибридом, ее можно сравнить с долговечной фабрикой по производству антител. Поскольку антитела синтезируют идентичные клоны гибридом, то они называются моноклональными антителами (МоАТ). [1]

Первый МоАТ были сделаны исключительно из клетки мыши. Одна из проблем при этом является то, что иммунная система человека видеть эти антитела в качестве чужеродного антигена (потому что они из разных видов), и может инициировать иммунный ответ против них (реакции аллергического типа) - это в краткосрочной перспективе. В долгосрочной перспективе это означает, что антитела могут работать только при введении в первый раз, а в последующие разы введения иммунная система уничтожит их, прежде чем они могут быть полезными. Со временем, исследователи научились заменить некоторые части этих мышей антител с белками человека частей. В зависимости от того, сколько в МоАТ человеческого белка, выделяют так называемые химерные или гуманизированный антитела. Новые МоАТ теперь в полной мере человеческие, что означает, что они могут быть еще более безопасным и могут быть более эффективным, чем старые МоАТ.

Существует новый подход, состоящий в использовании фрагментов антител вместо их целых частей. Меньшие куски могут иметь больше возможностей для достижения опухоли, и могут быть более эффективными. За последние 10 лет или около того, был одобрен ряд МоАТ для лечения некоторых видов рака.

Клинические испытания терапии моноклональными антителами, показывает эффективность практически при всех видах рака. Так как исследования показали большое количество антигенов, которые связаны с раком, то существует возможность создания набора моноклональных антител против множества разновидностей рака. [3]

Производство моноклональных антител.

Рис. A. Получение моноклональных антител.

Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом -- белком, бактериальной или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК), и из них готовили взвесь клеток. К ней добавляли в избытке клетки мутантной плазмоцитомы и полиэтиленгликоль (ПЭГ). После короткой инкубации, требующейся для слияния клеток, их отмывали от ПЭГа и помещали в среду, содержащую Г, Т и А (ГАТ-среда). Теперь в системе находились гибриды АОК и АОК, АОК и плазмоцитомы, а также оставшиеся свободными АОК и клетки плазмоцитомы. Из них нужно было отобрать только гибриды АОК и плазмоцитомы. После недолгого (несколько дней) культивирования одиночные АОК, а также гибриды АОК и АОК погибали, так как нормальные клетки смертны и быстро погибают в культуре. Плазмоцитомные клетки и их гибриды также погибали, так как А блокировал основной путь синтеза предшественников нуклеиновых кислот, а Г и Т их не спасали. Выживали, следовательно, только гибриды АОК и плазматических клеток, так как бессмертие они унаследовали от плазмоцитомы, а резервный путь - от нормальной клетки. Такие гибриды, гибридомы, сохраняли способность синтезировать и секретировать антитела.

Следующий этап после получения гибридом -- клонирование и отбор нужных клонов. Выжившие в ГАТ клетки рассевали в специальные пластиковые планшеты, содержащие обычно 96 лунок емкостью примерно по 0,2 см3. В каждую лунку помещали в среднем по 10 гибридомных клеток, которые культивировали в присутствии "кормящих" клеток, не имеющих отношения к гибридомам, но способствующих их росту. После нескольких дней культивирования содержимое каждой лунки проверяли на присутствие антител нужной специфичности. Для этого использовали микрометоды выявления антител к соответствующему антигену. Клетки из лунок, содержащих нужные антитела, клонировали, то есть повторно рассевали по таким же лункам, но из расчета 1 клетка на лунку, вновь культивировали и проверяли на присутствие нужных антител. Процедуру повторяли 1-2 раза. Таким образом, отбирали клоны, продуцирующие антитела только одной нужной специфичности, то есть моноклональные антитела. Полученные клоны можно заморозить при -70°С и хранить до того, пока они не потребуются. Их можно культивировать и накапливать антитела в культуральной среде, а можно привить мышам (так как гибридомы - это опухолевые клетки), где они будут расти и накапливать колоссальные количества моноклональных антител. От одной мышки можно получить антител не меньше, чем от кролика. Эти антитела не содержат посторонних антител и настолько однородны физико-химически, что могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клетки соединительной ткани (фибробласта) моноклональным антителом к тубулину - белку микротрубочек, образующих скелет клетки.

ПРИМЕНЕНИЕ

Области применения моноклональных антител:

идентификация субпопуляций лимфоцитов человека

истощение клеточных популяций

выделение клеток

установление функций молекул клеточной поверхности

определение группы крови - диагностика опухолей

локализация опухолей

иммунорадиометрический анализ

анализ сложных смесей антигенов

анализ эмбрионального развития

моноклональные мутантные антитела

квадромы

анализ иммунного ответа

- искусственные ферменты. [8]

Обычные поликлональные антитела давно и широко применяются для определения биологически активных веществ - белков крови и других биологических жидкостей, гормонов, ростовых факторов, клеточных рецепторов, медиаторов воспаления и иммунитета, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов и т.п. Моноклональные антитела из-за высочайшей специфичности, стандартности и технологичности получения успешно вытесняют и заменяют иммунные сыворотки.

Далее гибридомы создают уникальные возможности в аналитических целях: их можно применять как "иммунологический микроскоп" с чрезвычайно высоким разрешением. Так, например, если нужно сравнить две клеточные линии, отличающиеся одним или немногими антигенами, и надо выявить такие антигены, то метод гибридом предоставляет для этого исключительные возможности. Проиммунизировав мышей одной из линий и получив сотни гибридом, продуцирующих антитела к антигенам этой линии, можно найти одну или две с антителами только к данной линии. Размножив такую гибридому в пробирке или вырастив ее на мышах, можно получить огромное количество антител к уникальному антигену (или детерминантной группе), затерянному среди других компонентов клетки подобно иголке в стоге сена. Это будет продукт одного клона. В крови иммунизированного животного среди множества других антител он никак не проявится из-за чисто количественных отношений. Благодаря же гибридомам его можно не только обнаружить, но и вывести в линию и получить любое количество соответствующих антител. С помощью гибридом можно обнаружить антигены, характерные для опухолей определенных тканей, получить к ним антитела и использовать их для диагностики и типирования опухолей.

Последовательные срезы через желудок (жел) и пищевод (пищ) мыши, окрашенные двумя моноклональными антителами: 1 - первое моноклональное антитело реагирует с эпителием пищевода и слабее с эпителием желудка; 2 - второе моноклональное антитело реагирует только с эпителием желудка.

Такие моноклональные антитела нашли широкое применение в онкологической клинике. Наконец, во всем мире ведутся активные исследования по использованию моноклональиых антител в качестве специфических переносчиков токсических веществ в опухолевые клетки. Пока же с помощью моноклональных антител в опухоль и ее метастазы доставляются радиоактивные вещества, позволяющие обнаружить небольшие узелки опухоли по локализации в них радиоактивности.

Гибридомы сыграли и продолжают играть огромную роль в фундаментальной и прикладной иммунологии. Они созданы на основе клонально-селекционной теории иммунитета и явились самым ярким и окончательным доказательством этой теории. Гибридомы сделали реальностью предполагаемые клоны антителообразующих клеток и позволили даже обнаружить их существование в организме до введения соответствующего антигена. Гибридомы революционизировали иммунологическую промышленность и создали в ней совершенно новые области. Благодаря гибридомам возникли методы диагностики многих заболеваний и появились новые пути для изучения злокачественных опухолей. И хотя гибридомы скорее относят к гениальным изобретениям, а не к открытиям, они были отмечены в 1984 году Нобелевской премией, высшей научной наградой, присуждаемой за выдающиеся открытия. (Келер и Мильштейн)

К настоящему времени получено громадное количество гибридом-продуцентов моноклональных антител к различным, в том числе к опухоле-ассоциированным антигенам. Наиболее популярными препаратами МКА в настоящее время являются Мабтера и Герцептин (Швейцария). Первый применяется для лечения некоторых злокачественных заболеваний крови человека, второй - при раке молочной железы. Эти антитела специфически связываются с антигеном злокачественных клеток, вызывая их гибель в результате каскада иммунологических реакций. Первые клинические результаты применения Мабтера показали, что у 50% пациентов с большими опухолями и рецидивами при неблагоприятном прогнозе заболевания наступает стабилизация процесса. Герцептин сравнительно недавно вошел в арсенал терапевтических средств, применяемых в онкологии, но уже зарекомендовал себя как эффективный препарат при раке молочной железы, устойчивом к обычному лечению. Использование Герцептина у больных раком молочной железы вместе с химиопрепаратами позволяет повысить эффективность лечения особенно в тех случаях, когда заболевание не поддается обычной химиотерапии. Интенсивные работы по получению новых моноклональных антител и разработке на их основе лекарственных и диагностических средств ведутся и в нашей стране. Перспективным является еще одно направление. Это - использование моноклональных антител для создания иммуномагнитного фильтра, "сорбента". Сущность метода состоит в том, что привязанные к ферромагнитным микрочастицам моноклональные антитела, находясь в магнитном поле, могут высоко специфично извлекать клетки, например, из костного мозга или из опухоли. Затем иммуномагнитный сорбент отделяют и остаются только извлеченные клетки. С помощью такого сорбента можно связывать и удалять клетки (например, злокачественные) или получать из костного мозга здоровые клетки - родоначальники кроветворения, которые могут использоваться для введения этому же больному в случае повреждения кроветворения. [3]

Моноклональные антитела для направленной доставки препаратов

Ограничения применения цитостатиков

- высокая общая токсичность

низкий терапевтический индекс

недостаточная специфичность

Преимущества направленной доставки препаратов:

Доставка тысяч молекул лекарства, при использовании нескольких десятков молекул МКА;

Возможное проявление аддитивного/синергического эффекта МКА и лекарственного препарата;

Возможность присоединения МКА, обладающих уникальными сигнальными свойствами;

Защита окружающих тканей организма от цитотоксического действия препаратов;

Возможность «адресно» доставлять препарат в органы, ткани и отдельные клетки;

Характеристики МКА, используемых в конструировании нанопрепаратов

Сохранение специфичности при конъюгации с носителем;

Афинность, достаточная для связывания низкой концентрации препарата;

Низкая иммуногенность;

Эффективная интернализация клетками-мишенями;

Технологичность в производстве;

Достаточный срок хранения.

Конструкции иммунолипосом для направленного транспорта препаратов

- анти-CD20 для лечения В-клеточных лимфом и ХЛЛ;

- анти-CD5 для лечения Т-клеточных лимфом и ХЛЛ;

- анти-Her2/neu для лечения рака молочной железы;

- анти-Muc-1 для лечения рака яичника;

- анти-ПСА для лечения рака предстательной железы; [6]

Способы получения рекомбинантных АТ

Клонирование последовательности Fab из ДНК или мРНК из гибридом, экспрессирующих конкретное мышиное МКА. Генно-инженерное слияние с последовательностями Ig человека;

- Клонирование полноразмерных генов Ig из В-клеток человека;

- Создание мышей, несущих активные кластеры генов человеческих Ig и их последующая иммунизация с получением гибридом. [1]

Современные иммунобиологические препараты и биотехнологические методы их производства

Иммунобиотехнология так же занимается изучением способов и методов конструирования, биотехнологического получения, стандартизацию и оценки свойств иммунобиологических препаратов. Эти препараты играют существенную роль в снижении инфекционной заболеваемости и находят все более широкое применение в неинфекционной патологии - в онкологии, иммунологии, трансплантологии, в решении проблем репродукции и др.

В настоящее время разработано и используется в практике более 500 ИБП. В России ранее производилось 750 ИБП, в настоящее время их количество сократилось и составило - около 500 ИБП, обеспечивающих эпидемиологическое благополучие по многим инфекционным болезням.

ИБП можно разделить на 5 больших групп:

1. вакцины и другие микробные лечебные и профилактические препараты (анатокины, фаги, эубиотики);

2. препараты на основе антител (иммуноглобулины, иммунные сыворотки);

3. иммуномодуляторы;

4. адаптогены;

5. диагностические препараты.

Эта классификация является наиболее обоснованной и современной. ИБП адаптогенов оправдывается их влиянием на иммунную систему через эндогенные регуляторы, хотя они и обладают более широким спектром действия. [7]



Вакцины

Вакцины (лат. vaccinus коровий) - препараты, получаемые из микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности; применяются для активной иммунизации людей и животных с профилактической и лечебной целями.

Различают следующие виды вакцин:

Вакцина адсорбированная (v. adsorptum) - В., антигены которой сорбированы на веществах, усиливающих и пролонгирующих антигенное раздражение.

Вакцина антирабическая (v. antirabicum; анти- + лат. rabies бешенство) - В., изготовленная из штамма фиксированного вируса бешенства в суспензии тканей головного мозга животных или в культуре клеток и предназначенная для предупреждения заболевания у лиц, укушенных (ослюненных) животными, больными бешенством (подозреваемыми на заболевание).

Вакцина ассоциированная (v. associatum; син.: В. комбинированная, В. комплексная, поливакцина) - препарат, состоящий из нескольких В. различного типа, предназначенный для одновременной иммунизации против нескольких инфекционных болезней.

Вакцина живая (v. vivum) - B., содержащая жизнеспособные штаммы патогенного микроорганизма, ослабленные до степени, исключающей возникновение заболевания, но полностью сохранившие антигенные свойства, обусловливающие формирование специфического иммунитета у привитого.

Вакцина поливалентная (v. polyvalens; греч. poly - много + лат. valens, valentis сильный) - В., изготовленная на основе нескольких серологических вариантов возбудителя одной инфекционной болезни.

Вакцина убитая (v. inactivatum) - В., изготовленная из микроорганизмов инактивированных (убитых) воздействием физических или химических факторов.

Вакцина фенолизированная (v. phenolatum) - убитая В., изготовленная из микроорганизмов, инактивированных фенолом.

Вакцина формалинизированная (v. formalinatum; син. формолвакцина) - убитая В., изготовленная из микроорганизмов, инактивированных формалином.

Вакцина химическая (v. chemicum) - В., состоящая из специфических антигенов, извлеченных из микроорганизмов, и очищенная от балластных веществ.

Вакцина эмбриональная (v. embryonale) - В., изготовленная из вирусов или риккетсий, выращенных на эмбрионах птиц (кур, перепелок).

Вакцина этеризованная (v. aetherisatum) - убитая В., изготовленная из микроорганизмов, инактивированных эфиром.

Вакцины состоят из действующего начала - специфического антигена; консерванта для сохранения стерильности (в неживых В.); стабилизатора, или протектора, для повышения сроков сохраняемости антигена; неспецифического активатора (адъюванта), или полимерного носителя, для повышения иммуногенности антигена (в химических, молекулярных вакцинах). Специфические антигены, содержащиеся в В., в ответ на введение в организм вызывают развитие иммунологических реакций, обеспечивающих устойчивость организма к патогенным микроорганизмам. В качестве антигенов при конструировании В. используют: живые ослабленные (аттенуированные) микроорганизмы; неживые (инактивированные, убитые) цельные микробные клетки или вирусные частицы; извлеченные из микроорганизмов сложные антигенные структуры (протективные антигены); продукты жизнедеятельности микроорганизмов - вторичные метаболиты (например, токсины, молекулярные протективные антигены): антигены, полученные путем химического синтеза или биосинтеза с применением методов генетической инженерии.[2]

В соответствии с природой специфического антигена В. делят на живые, неживые и комбинированные (как живые, так и неживые микроорганизмы и их отдельные антигены). Живые В. получают из дивергентных (естественных) штаммов микроорганизмов, обладающих ослабленной вирулентностью для человека, но содержащих полноценный набор антигенов (например, вирус коровьей оспы), и из искусственных (аттенуированных) штаммов микроорганизмов. К живым В. можно отнести также векторные В., полученные генно-инженерным способом и представляющие собой вакцинный штамм, несущий ген чужеродного антигена (например, вирус оспенной вакцины со встроенным антигеном вируса гепатита В).

Неживые В. подразделяют на молекулярные (химические) и корпускулярные. Молекулярные В. конструируют на основе специфических протективных антигенов, находящихся в молекулярном виде и полученных путем биосинтеза или химического синтеза. К этим В. можно отнести также анатоксины, которые представляют собой обезвреженные формалином молекулы токсинов, образуемых микробной клеткой (дифтерийный, столбнячный, ботулинический и др.). Корпускулярные В. получают из цельных микроорганизмов, инактивированных физическими (тепло, ультрафиолетовое и другие излучения) или химическими (фенол, спирт) методами (корпускулярные, вирусные и бактериальные вакцины), или из субклеточных над-молекулярных антигенных структур, извлеченных из микроорганизмов (субвирионные вакцины, сплит-вакцины, вакцины из сложных антигенных комплексов).

Молекулярные антигены, или сложные протективные антигены бактерий и вирусов, используют для получения синтетических и полусинтетических вакцин, представляющих собой комплекс из специфического антигена, полимерного носителя и адъюванта. Из отдельных В. (моновакцин), предназначенных для иммунизации против одной инфекции, готовят сложные препараты, состоящие из нескольких моновакцин. Такие ассоциированные вакцины, или поливакцины, поливалентные вакцины обеспечивают иммунитет одновременно против нескольких инфекций. Примером может служить ассоциированная АКДС-вакцина, в состав которой входят адсорбированные дифтерийный и столбнячный анатоксины и коклюшный корпускулярный антиген. Существует также семейство полианатоксинов: ботулинический пентаанатоксин, противогангренозный тетраанатоксин, дифтерийно-столбнячный дианатоксин. Для профилактики полиомиелита применяют единый поливалентный препарат, состоящий из аттенуироваиных штаммов I, II, III серотипов (сероваров) вируса полиомиелита.

Насчитывается около 30 вакцинных препаратов, применяемых с целью профилактики инфекционных болезней; примерно половина из них живые, остальные инактивированные. Среди живых В. выделяют бактерийные - сибиреязвенную, чумную, туляремийную, туберкулезную, против Ку-лихорадки; вирусные - оспенную, коревую, гриппозную, полиомиелитную, паротитную, против желтой лихорадки, краснухи. Из неживых В. применяют коклюшную, дизентерийную, брюшнотифозную, холерную, герпетическую, сыпнотифозную, против клещевого энцефалита, геморрагических лихорадок и другие, а также анатоксины - дифтерийный, столбнячный, ботулинический, газовой гангрены.

Основным свойством В. является создание активного поствакцинального иммунитета, который по своему характеру и конечному эффекту соответствует постинфекционному иммунитету, иногда отличаясь от него лишь количественно. Вакцинальный процесс при введении живых В. сводится к размножению и генерализации аттенуированного штамма в организме привитого и вовлечению в процесс иммунной системы. Хотя по характеру поствакцинальных реакций при введении живых В. вакцинальный процесс и напоминает инфекционный, однако он отличается от него своим доброкачественным течением.

Вакцины при введении в организм вызывают ответную иммунную реакцию, которая в зависимости от природы иммунитета и свойств антигена может носить выраженный гуморальный, клеточный или клеточно-гуморальный характер.

Эффективность применения В. определяется иммунологической реактивностью, зависящей от генетических и фенотипических особенностей организма, от качества антигена, дозы, кратности и интервала между прививками. Поэтому для каждой В. разрабатывают схему вакцинации. Живые В. обычно используют однократно, неживые - чаще двукратно или трехкратно. Поствакцинальный иммунитет сохраняется после первичной вакцинации 6-12 мес. (для слабых вакцин) и до 5 и более лет (для сильных вакцин); поддерживается периодическими ревакцинациями. Активность (сила) вакцины определяется коэффициентом защиты (отношением числа заболеваний среди непривитых к числу заболевших среди привитых), который может варьировать от 2 до 500. К слабым вакцинам с коэффициентом защиты от 2 до 10 относятся гриппозная, дизентерийная, брюшнотифозная и др., к сильным с коэффициентом защиты от 50 до 500 - оспенная, туляремийная, против желтой лихорадки и др.

В зависимости от способа применения В. делят на инъекционные, пероральные и ингаляционные. В соответствии с этим им придается соответствующая лекарственная форма: для инъекций применяют исходные жидкие или регидратированные из сухого состояния В.; пероральные В. - в виде таблеток, конфет (драже) или капсул; для ингаляций используют сухие (пылевые или регидратированные) вакцины. В. для инъекций вводят накожно (скарификация), подкожно, внутримышечно.

Наиболее просты в изготовлении живые В., так как технология в основном сводится к выращиванию аттенуированного вакцинного штамма с соблюдением условий, обеспечивающих получение чистых культур штамма, исключение возможностей загрязнения другими микроорганизмами (микоплазы, онковирусы) с последующей стабилизацией и стандартизацией конечного препарата. Вакцинные штаммы бактерий выращивают на жидких питательных средах (гидролизаты казеина или другие белково-углеводные среды) в аппаратах - ферментаторах емкостью от 0,1 м3 до 1-2 м3. Полученная чистая культура вакцинного штамма подвергается лиофильному высушиванию с добавлением протекторов. Вирусные и риккетсиозные живые В. получают выращиванием вакцинного штамма в эмбрионах кур или перепелов, свободных от вирусов лейкоза, либо в культурах клеток, лишенных микоплазм. Используют или первично-трипсинизированные клетки животных или перевиваемые диплоидные клетки человека. Живые аттенуированные штаммы бактерий и вирусов, применяемые для приготовления живых В., получены, как правило, из природных штаммов путем их селекции или пассажей через биологические системы (организм животных, эмбрионы кур, культуры клеток, питательные среды).

В связи с успехами генетики и генетической инженерии появились возможности целенаправленного конструирования вакцинных штаммов. Получены рекомбинантные штаммы вируса гриппа, а также штаммы вируса вакцины со встроенными генами протективных антигенов вируса гепатита В. Инактивированные корпускулярные бактериальные В. или цельновирионные инактивированные В. получают соответственно из культур бактерий и вирусов, выращенных на тех же средах накопления, что и в случаях получения живых вакцин, и затем подвергнутых инактивации нагреванием (гретые вакцины), формалином (формолвакцины), ультрафиолетовым излучением (УФ-вакцины), ионизирующим излучением (радиовакцины), спиртом (спиртовые вакцины). [5]

Инактивированные В. ввиду недостаточно высокой иммуногенности и повышенной реактогенности не нашли широкого применения.

Производство молекулярных В. - более сложный технологический процесс, т. к. требует извлечения из выращенной микробной массы протективных антигенов или антигенных комплексов, очистки и концентрирования антигенов, введения в препараты адъювантов. Выделение и очистка антигенов с помощью традиционных методов (экстракции трихлоруксусной кислотой, кислотного или щелочного гидролиза, ферментативного гидролиза, высаливания нейтральными солями, осаждения спиртом или ацетоном) сочетаются с применением современных методов (скоростного ультрацентрифугирования, мембранной ультрафильтрации, хроматографического разделения, аффинной хроматографии, в т.ч. на моноклональных антителах). С помощью этих приемов удается получать антигены высокой степени очистки и концентрирования. К очищенным антигенам, стандартизированным по числу антигенных единиц, с целью повышения иммуногенности добавляют адъюванты, чаще всего сорбенты-гели (гидрат окиси алюминия и др.). Препараты, в которых антиген находится в сорбированном состоянии, называют сорбированными или адсорбированными (дифтерийный, столбнячный, ботулинический сорбированные анатоксины). Сорбент играет роль носителя и адъюванта. В качестве носителя в синтетических вакцинах предложены всевозможные полимеры. [4]

Интенсивно разрабатывается генно-инженерный способ получения протективных белковых антигенов бактерий и вирусов. В качестве продуцентов используют обычно эшерихии, дрожжи, псевдомонады со встроенными в них генами протективных антигенов. Получены рекомбинантные штаммы бактерий, продуцирующие антигены возбудителей гриппа, коклюша, кори, герпеса, гепатита В, бешенства, ящура, ВИЧ-инфекции и др. Получение протективных антигенов генно-инженерным способом целесообразно в том случае, когда выращивание микробов связано с большими трудностями или опасностями, или когда трудно извлекать антиген из микробной клетки. Принцип и технология получения В. на основе генно-инженерного способа сводятся к выращиванию рекомбинантного штамма, выделению и очистке протективного антигена, конструированию конечного препарата.

Препараты В., предназначенные для иммунизации людей, проверяют на безвредность, реактогенность и иммуногенность. Безвредность включает проверку на лабораторных животных и других биологических системах токсичности, пирогенности, стерильности, аллергенности, тератогенности, мутагенности препарата В. Реактогенность, т.е. побочные местные и общие реакции на введение В., оценивают на животных и при прививках людей. Иммуногенность проверяют на лабораторных животных и выражают в иммунизирующих единицах, т.е. в дозах антигена, защищающих 50% иммунизированных животных, зараженных определенным числом инфицирующих доз патогенного микроба или токсина. В противоэпидемической практике эффект вакцинации оценивают по соотношению инфекционной заболеваемости в привитых и непривитых коллективах. Контроль В. осуществляют на производстве в отделах бактериологического контроля и в Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасовича по разработанной и утвержденной МЗ СССР нормативно-технической документации.

Вакцинопрофилактика занимает значительное место в борьбе с инфекционными болезнями. Благодаря вакцинопрофилактике ликвидирована оспа, сведена к минимуму заболеваемость полиомиелитом, дифтерией, резко снижена заболеваемость корью, коклюшем, сибирской язвой, туляремией и другими инфекционными болезнями. Успехи вакцинопрофилактики зависят от качества вакцин и своевременного охвата прививками угрожаемых контингентов. Большие задачи стоят по совершенствованию В. против гриппа, бешенства, кишечных инфекций и других, а также по разработке В. против сифилиса, ВИЧ-инфекции, сапа, мелиоидоза, болезни легионеров и некоторых других. Современные иммунология и вакцинопрофилактика подвели теоретическую базу и наметили пути совершенствования В. в направлении создания очищенных поливалентных адъювантных синтетических В. и получения новых безвредных эффективных живых рекомбинантных вакцин. [6]

Современные ИБП наряду с важными достоинствами имеют и ряд недостатков. Во-первых, множество индивидуальных препаратов и необходимость многократных инъекций утяжеляют календарь прививок. Только до 10-летнего возраста каждый ребенок должен быть привит 7 препаратами, получить 22 инъекции, а в отдельных эндемических по некоторым инфекциям районах и того больше.

Открываются широкие возможности создания генно-инженерных векторных вакцин. Уже получены сотни рекомбинантных штаммов бактерий, дрожжей, вирусов, несущих не свойственные им и экспрессируемые антигены целевого назначения. Как на вектоные штаммы возлагаются надежды на ДНК-вирус вакцину, обладающую емким геномом, и апатогенные, аттенуированные штаммы сальмонелл, способные приживляться и персистировать в ЖКТ при пероральном введении. На основе вирус-вакцины уже получены векторные вакцины против гепатита В, клещевого энцефалита, ВИЧ-инфекции имногих других инфекций. В эксперименте получены также сальмонеллезные вакцины против гепатита В, ВИЧ-инфекции. Появляется перспектива создания холерной, брюшнотифозной и других вакцин. [7]

Процесс получения мономолекулярного полиантигена состоит из нескольких стадий:

выделение и определение структуры моноантигенов (аминокислотного состава и последовательности);

конструкция (или клонирвание) генов моноантигенов;

получение слитного гена (полигена), состоящего из генов нескольких антигенов;

встройка полигена в ДНК - получение рекомбинантной ДНК бактерии, дрожжей и вирусов;

получение рекомбинантного штамма бактерий., дрожжей со встроенным полигеном, способным экспрессировать полиантиген;

конструирование ассоциированной молекулярной вакцины из полиантигена. [8]

Пример иммунобиологического препарата - ИНФЛИКСИМАБ (РЕМИКЕЙД)

РЕМИКЕЙД - это химерные IgG 1 моноклональные антитела, которые на 75% состоят из человеческого белка, на 25% из мышиного. Мышиный фрагмент содержит место связывания ФНО-a, в то время как человеческий фрагмент обеспечивает эффекторные функции (см. Рисунок 1). РЕМИКЕЙД соединяется с растворимым и связанным с мембранами ФНО-а, а также ингибирует многие из биологических эффектов ФНО-b. Эти антитела, полученные генноинженерным путем, с высокой аффинностью, авидностью и специфичностью связывают человеческий ФНО-a. Они не связывают ФНО-b, известный также как лимфотоксин а. Высокая специфичность уменьшает возможность неспецифических влияний на другие иммунологические механизмы. РЕМИКЕЙД получают из линии рекомбинантных клеток, получаемых путем длительного пассажа\перфузии. РЕМИКЕЙД также известен под своим лабораторным названием как химерные А2 антитела (сА2).

	По данным Knight, et al. Mol. Immunol. 1993. Рис. 1. РЕМИКЕЙД (анти-ФНО-a моноклональные антитела). РЕМИКЕЙД с высокой афинностью, авидностью и специфичностью связывает ФНО-а.

Механизм действия

РЕМИКЕЙД подавляет патологические эффекты ФНО-a при РА посредством различных механизмов. РЕМИКЕЙД специфически связывает и таким образом нейтрализует как трансмембранный ФНО-а, так и растворимый ФНО-а в растворе . Кроме того, в исследованиях in vitro было показано, что РЕМИКЕЙД вызывает лизис ФНО-продуцирующих клеток путем фиксации комплемента или за счет антител-зависимой цитотоксичности (АЗЦТ). [9]



Список литературы

гибридома антигенный антитело иммунобиологический

Ройт Р., Бростофф Дж.,.Мейл Д. Основы иммунологии. М.: Мир, 2000.

Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология . - М.: Медицина, 2000. - 432 с.

Размещено на Allbest.ru

...