Оптимизация заживления костной раны челюсти путем использования аутологичных и аллогенных стволовых клеток выделенных из жировой ткани (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК: 616. 716.4-018-003.93-089-74

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Оптимизация заживления костной раны челюсти путем использования аутологичных и аллогенных стволовых клеток выделенных из жировой ткани (экспериментальное исследование)

14.01.14 - «Стоматология» (медицинские науки)

14.03.03 - «Патологическая физиология» (медицинские науки)

кандидата медицинских наук

Черняев Сергей Евгеньевич

Москва - 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный

медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ»

Научные руководители:

Заслуженный врач РФ,

Доктор медицинских наук, профессор Светлана Владимировна Дьякова

заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Александр Ильич Воложин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Светлана Викторовна Тарасенко

доктор биологических наук, профессор Инга Александровна Вальцева

Ведущее учреждение: ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий»

Защита состоится «___» ____________2011 г. в____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ» по адресу: 127206, г. Москва, ул. Долгоруковская, 4.

Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ «ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития РФ» по адресу: 125206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10А.

Автореферат разослан: «___»_____________2011 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета, доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Гиоева

дефект челюсть стволовой ткань

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В хирургии и хирургической стоматологии возникает необходимость поиска путей усиления построения полноценной в анатомическом и функциональном отношении репаративном регенерате костной ткани, что важно для пациентов со значительными по размеру дефектами, а так же имеющими нарушение обмена веществ, сахарный диабет и другие общесоматические заболевания. У таких пациентов необходимо применение новых технологий, позволяющих усилить репаративный процесс костной ткани (Воложин А.И., 2000; Amit M., 2000; Fleming J.E., 2000). К новым технологиям относится применение стволовых клеток, дифференцированных в остеогенном направлении. До настоящего времени основным источником получения стволовых клеток был костный мозг человека. Методы выделения, дифференцировки мезенхимальных клеток костного мозга, заселение ими поверхности носителей (металлы, пластмассы и др.) для внесения в костную рану, успешно разрабатываются (Ю.И. Денисов-Никольский и соавт., 2003; Т.Ю. Татаренко-Козьмина и соавт., 2005, А.И. Воложин и соавт., 2002-2006 и другие).

В последние годы, наряду с костным мозгом, как источник стволовых клеток, широкое распространение получила жировая ткань. Однако, перспектива применения аутологичных и аллогенных стволовых клеток, полученных из жировой ткани, остается малоизученным вопросом. Имеются разные мнения, не подкрепленные научными данными. Полностью отсутствуют сравнительные данные остеорегенераторной эффективности применения аутологичных и аллогенных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани. Преимущества этих клеток заключаются в том, что они могут быть выделены в большом количестве с минимальными болезненными ощущениями для пациента. Вышеперечисленное свидетельствует о том, что жировая ткань и расположенные в ней популяции стволовых клеток могут быть альтернативой источника получения стволовых клеток для исследователей и клиницистов, в том числе челюстно-лицевых хирургов.

Изучение этого вопроса является актуальным для последующего использования данных клеточных технологий в клинической практике, в том числе в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, что послужило основанием для проведения экспериментального исследования.

Цель исследования - провести сравнительную оценку остеорегенераторного потенциала аллогенных и аутологичных стволовых клеток жировой ткани (СКЖТ) на экспериментальных моделях in vivo.

Задачи исследования:

1. Исследовать дифференцировочный потенциал СКЖТ in vitro.

2. Разработать биоинженерную конструкцию на основе губки ГАПКОЛ (ГАПКОЛ, «НПО ПОЛИСТОМ») для трансплантации СКЖТ в дефект костной ткани кролика.

3. Изучить в экспериментальной модели сквозного дефекта угла нижней челюсти кролика влияние аутологичных и аллогенных СКЖТ на процесс остеорепарации.

4. Исследовать влияние аутологичных и аллогенных СКЖТ на скорость процессов костеобразования в экспериментальной модели сквозного дефекта угла нижней челюсти кролика.

Научная новизна. Впервые, в сравнительном аспекте оценена эффективность применения аутологичных и аллогенных СКЖТ для оптимизации регенерации дефекта костной ткани нижней челюсти у кроликов. Разработанная биоинженерная конструкция на основе губки из коллагена с гидроксиаппатитом ГАПКОЛ (ГАПКОЛ, «НПО ПОЛИСТОМ») для трансплантации СКЖТ в дефект костной ткани позволила впервые установить, что индуцированные к остеогенной дифференцировке СКЖТ стимулируют репаративный остеогенез. Причем влияние клеток аутологичного происхождения выражено в большей степени, чем клеток аллогенного происхождения, что выражалось в большей скорости созревания костного матрикса.

Впервые, по данным морфометрического анализа установлено, что при закрытии дефекта костной ткани губкой ГАПКОЛ без нанесения СКЖТ регенерат представлен незрелой трабекулярной фиброзной тканью на всех сроках исследования (2 месяца, 4 месяца). При закрытии дефекта костной ткани губкой ГАПКОЛ с нанесением аллогенных клеток в костном матриксе регенерата доля пластинчатой и компактизирующейся костной ткани преобладает над долей фиброзного матрикса, уже начиная со 2-го месяца исследования. При закрытии дефекта костной ткани губкой ГАПКОЛ с нанесением аутологичных клеток во все сроки исследования (2 месяца, 4 месяца) регенерат представлен преимущественно трабекулярным типом строения, что свидетельствует об активном новообразовании костного вещества. Впервые установлено, что трансплантация стволовых клеток жировой ткани аллогенного происхождения не провоцирует развитие воспалительной реакции окружающих тканей на всех сроках экспериментального исследования.

Практическая значимость. Полученные результаты исследования показали, что жировая ткань является доступным источником стромальных клеток, способных дифференцироваться в различных направлениях. Стволовые клетки жировой ткани, дифференцируясь in vivo в остеогенном направлении, способны усиливать образование костной ткани, что представляет несомненный практический интерес для стимулирования заживления костных дефектов в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Для практического применения представляют ценность данные о разработанной биоинженерной конструкции на основе губки ГАПКОЛ с нанесенными на ее поверхность клетками аллогенного и аутологичного происхождения, стимулирующие репаративный остеогенез. Не выявлено отторжения трансплантата на гистологическом уровне при трансплантации конструкции с аллогенными клетками. Данные настоящего исследования подтверждают перспективу использования стволовых клеток жировой ткани для повышения эффективности остеорепаративных процессов в челюстно-лицевой области.

Основные положения, выносимые на защиту

Использование разработанной биоинженерной конструкции на основе губки из коллагена с гидроксиаппатитом ГАПКОЛ (ГАПКОЛ «НПО ПОЛИСТОМ») позволяет в сравнительном аспекте оценить стимулирующее влияние аутологичных и аллогенных стволовых клеток на репаративный остеогенез на экспериментальной модели угла нижней челюсти кролика.

Индуцированные к остеогенной дифференцировке аутологичные и аллогенные клетки имеют выраженное стимулирующее влияние на репаративный остеогенез, однако влияние аллогенных клеток выражено в меньшей степени, что выражается в меньшей скорости созревания костного матрикса.

Внедрение результатов исследования

Полученные данные используются в учебном процессе и дальнейшей научной работе на кафедре патофизиологии стоматологического факультета и на кафедре детской хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, на теоретических занятиях со студентами и ординаторами, а также с курсантами, проходящими циклы усовершенствования на указанных кафедрах.

Личный вклад автора

Автором лично проведены эксперименты на кроликах: проведены операции по формированию полнокостных дефектов угла нижней челюсти с последующим закрытием губкой ГАПКОЛ без клеток (4 кролика), губкой ГАПКОЛ с аллогенными клетками (4 кролика), губкой ГАПКОЛ с аутологичными клетками (4 кролика). Проанализированы результаты микрофокусного рентгенографического исследования, сканирующей электронной микроскопии, морфологического и гистоморфометрического исследования челюстей кроликов через 2 и 4 месяца после проведенных операций.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Ежегодной Всероссийской научной конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», (2009 г.); на V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008 г.); на III Всероссийской научно-практической конференции «Врожденная и наследственная патология головы, лица и шеи у детей: актуальные вопросы комплексного лечения» (Москва, 2009 г.).

Диссертация апробирована на межкафедральном совещании сотрудников кафедры детской хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии и кафедры патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 7 публикации в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты собственных исследований, Заключение, Выводы и Практические рекомендации, Список литературы.

Работа изложена на 118 страницах, содержит 4 таблицы, 15 диаграмм, схем и рисунков. Библиографический указатель содержит 247 наименования: 26 отечественных и 221 зарубежных источников.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Выделение и культивирование клеток. В работе использовали клетки стромы жировой ткани, выделенные из липоаспиратов или кусочков жировой ткани человека, полученных при абдоминальной пластической операции, и кусочков жировой ткани кролика, полученных из паховой области. Биоптаты жировой ткани обрабатывали в течение 8 часов после операции. Стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) выделяли по методу Zuk (2001) с модификациями в лаборатории «Проблем клеточной пролиферации» института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, заведующий д.б.н. профессор В.В. Терских. Ткань промывали в солевом растворе Хенкса с гентамицином (200 ед/мл), измельчали ножницами и инкубировали с 0,1 % раствором коллагеназы I типа (Worthington) при 37?С при постоянном перемешивании в течение 90 мин. Фермент ингибировали добавлением 10% телячьей сыворотки («Биолот», Россия). Зрелые адипоциты отделяли центрифугированием при 300 g в течение 10 мин. Клеточный осадок 2 раза отмывали от фермента в среде ДМЕМ (Sigma), содержащей 10% телячьей сыворотки. Суспензию клеток фильтровали через нейлоновый фильтр и центрифугировали в градиенте плотности (Histopaque -1077, Sigma) при 400 g в течение 30 мин при комнатной температуре для получения фракции мононуклеарных клеток. Суспензию клеток отмывали от Histopaque в среде ДМЕМ три раза. Клетки культивировали до первого пассирования в среде ДМЕМ, содержащей 20% сыворотки, затем культуры переводили на среду ДМЕМ/F12 (соотношение по объему 1:1), содержащей 10% телячьей сыворотки и в дальнейшем культивировали на этой среде. Смену среды проводили каждые 3 - 4 дня.

Индукция адипогенной дифференцировки. Для выявления потенции клеток стромальной фракции жировой ткани дифференцироваться в адипоциты СКЖТ культивировали в индукционной среде следующего состава: среда DMEM/F-12, 10% телячьей сыворотки, 0.5 мМ изобутил-метилксантин, 1 мкМ дексаметазон, 10 мкМ инсулин, 200 мкМ индометацин. Смену среды проводили каждые 3 дня. Через 14 дней культивирования клетки фиксировали и окрашивали на нейтральные жиры красителем Oil Red O (Sigma) и экспрессию маркера зрелых адипоцитов - лептина (Chemicon).

Индукция остеогенной дифференцировки. Для остеогенной дифференцировки клетки сажали в концентрации 2,5х10⁴ клеток/см² и культивировали до достижения конфлюэнтного слоя. Затем среду культивирования меняли на среду следующего состава: среда ДМЕМ/F-12, 10% телячьей сыворотки, 0.01 мкМ 1,25-дигидрокси витамин Д₃ (Sigma), 50 мкМ аскорбат-2-фосфат (Sigma), 10 мМ в-глицерофосфат (Sigma). Клетки культивировали в течение 14 и 21 дней, среду культивирования меняли каждые 3 дня. Дифференцировку клеток оценивали по гистологической окраске на активность щелочной фосфатазы (Alkaline phosphatase detection kit (Chemicon)), окраске на кальцификацию внеклеточного матрикса (Alizarin Red S (Sigma)), по иммуногистохимическому окрашиванию на экспрессию остеогенных белков - остеопонтина, остеокальцина и остеонектина.

Индукция хондрогенной дифференцировки. Для индукции хондрогенной дифференцировки клетки культивировали в течение 3 недель в дифференцировочной среде следующего состава: ДМЕМ, 1% телячьей сыворотки, 6.25 мкM инсулин, 10 нг/мл TGFв-1 (Peprothech), 50 нM аскорбат-2-фосфат, 100 нM дексаметазон (Sigma). Затем клетки фиксировали и с помощью иммуногистохимического анализа исследовали экспрессию хрящевого протеогликана, коллагена I и II типов.

Исследования на животных. Эксперименты проводили на базе вивария кафедры патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ на 12 самцах кроликов породы шиншилла весом 3,5 - 4 кг. Операции проводили в условиях операционной под наркозом «Zoletil» («Virbac Sante Animale», Франция). Препарат вводили внутримышечно из расчета 7,5 мг/кг веса тела кролика. В области края и ветви нижней челюсти выстригали шерсть, делали разрез кожи с соблюдением правил асептики, обнажали угол и ветвь челюсти. Создавали дефект костной ткани, который закрывали имплантатом. Затем рану ушивали послойно PGA, Surgipro на кожу. Рана заживала первичным натяжением. После операций животным во избежание осложнений внутримышечно вводили антибиотики в течение 5 дней.

Сравнение аутологичных и аллогенных СКЖТ на регенерацию костной ткани в модели дефекта угла нижней челюсти кролика. С помощью фрезы при постоянном охлаждении стерильным физиологическим раствором в области угла нижней челюсти создавали полнокостный дефект размером 8х8 мм, который закрывали губкой ГАПКОЛ. Губку фиксировали двумя швами через заранее приготовленные отверстия (рис. 1).

Рис. 1. Схема костного дефекта

Животные были разделены на 3 группы (по 4 кролика): Контроль - дефект закрыт губкой ГАПКОЛ без клеток; Опыт 1 - дефект закрыт губкой с аллогенными клетками; Опыт 2 - дефект закрыт губкой с аутологичными клетками.

Сроки наблюдения составили 2 и 4 месяца.

Нижние челюсти вместе с прилежащими мышцами фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили их рентгенографическое исследование. Под контролем рентгенограмм выделяли прилежащие к области дефекта фрагменты кости.

Микрофокусное рентгенографическое исследование было выполнено на кафедре лучевой диагностики МГМСУ, заведующий кафедрой член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ А.Ю. Васильев, без увеличения изображения, с прямым увеличением в 3-5-7-20 раз на аппарате «Пардус-150».

Сканирующая электронная микроскопия. Фрагменты нижней челюсти были исследованы методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Исследование всех образцов проводили в микроскопе Philips SEM-515 (Голландия) при ускоряющем напряжении 15 kv.

Гистоморфологическое исследование 12 фрагментов нижней челюсти делали на серийных срезах, окрашенных гематоксилин-эозином по стандартной методике. Гистологическая обработка. Выделенные тканевые фрагменты декальцинировали в 25% Трилоне Б с последующей дегидратацией в спиртах возрастающих концентраций. Заливали тканевые блоки в парафин и готовили в поперечной плоскости серии срезов, проходящих через дефекты и их костные края. Окраска срезов гематоксилин-эозином. Морфометрический анализ. Морфометрический анализ осуществляли на микрофотограммах с серией гистологических срезов, полученных на микротоме фирмы Микром (ФРГ) НМ-325, толщиной 8 мкм. Изучение гистологических препаратов и микрофотосъёмку осуществляли в оптической системе Axioplan-2 фирмы Zеiss (фотокамера фирмы Hitachi). Гистоморфометрическую оценку проводили на микрофотограммах с увеличениями х25, х100 и х200.

В качестве критериев гистоморфометрических исследований использовали следующие структурные детерминанты: 1. Костный матрикс; 2. Пластинчатый костный матрикс; 3. Фиброзный костный матрикс; 4. Низкодифференцированный костный матрикс; 5. Костные лакуны (костномозговые пространства); 6. Фиброзная соединительная ткань в составе костной части регенерата.

Результаты исследования

Исследование дифференцировочных потенций СКЖТ in vitro.

В настоящем исследовании был показан дифференцировочный потенциал СКЖТ in vitro. Была подтверждена способность клеток стромальной фракции жировой ткани дифференцироваться в различных индукционных средах в адипогенном, остеогенном, хондрогенном направлениях.

Критерием дифференцировки СКЖТ в адипоциты считали накопление в цитоплазме нейтральных жиров - основного критерия адипогенной дифференцировки, а также экспрессию лептина - одного из маркеров зрелых адипоцитов (рис. 2).

Рис. 2. Адипогенная дифференцировка СКЖТ.

Культивированные в контрольной среде клетки не окрашиваются на нейтральные жиры (а) и не экспрессируют лептин (б). При культивировании в специфической среде СКЖТ накапливают в цитоплазме липидные вакуоли (окрашивание Oil Red O) (в) и экспрессируют лептин (г).

Критерием дифференцировки СКЖТ в остеогенные клетки с помощью иммуногистохимического анализа была показана экспрессия щелочной фосфатазы и специфических остеогенных белков - остеопонтина, остеокальцина и остеонектина (рис. 3).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Критерием дифференцировки СКЖТ в хондрогенном направлении считали усиление экспрессии специфичных для хондрогенеза белков - хрящевого протеогликана, коллагена I и II типа, а также экспрессию гликозоаминогликанов (рис. 4).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сравнение влияния стволовых клеток жировой ткани аутологичного и аллогенного происхождения на регенерацию полнокостного дефекта нижней челюсти кролика

Для сравнения влияния СКЖТ аутологичного и аллогенного происхождения на регенерацию костной ткани в модели дефекта угла нижней челюсти кролика использовали аллогенные и аутологичные СКЖТ, выделенные из жировой ткани кролика по ранее описанной методике. На 2-ом пассаже СКЖТ переводили на среду для остеогенной дифференцировки, где клетки культивировали в течение 10 дней. За сутки до операции клетки пассировали на губке ГАПКОЛ («НПО ПОЛИСТОМ», Россия). Животные были разделены на 3 группы: контроль - дефект закрыт губкой ГАПКОЛ без клеток; опыт 1 - дефект закрыт губкой с аллогенными клетками; опыт 2 - дефект закрыт губкой с аутологичными клетками.

Анализ результатов с помощью микрофокусной рентгенографии

При оценке структуры костной мозоли на различных сроках регенерации с помощью цифровой микрофокусной рентгенографии были выделены следующие показатели:

1. плотность костной мозоли, которая оценивалась при сравнении её интенсивности с плотностью кортикального слоя;

2. наличие костных балок в структуре костной мозоли;

3. наличие остеогенных островков минерализации костной мозоли, как включений высокой интенсивности округлой формы с нечеткими контурами.

4. остеосклероз вокруг краевого костного дефекта;

5. края костного дефекта, как закругленные при отсутствии регенерации, и сливающиеся с тенью костной мозоли при физиологической регенерации.

В группе опыт 2 показано незначительное улучшение показателей репаративной регенерации на сроке 2 месяца, по сравнению с группой опыт 1 (рис. 5).

Анализ цифровых микрофокусных рентгенограмм показал, что через 2 месяца после операции у животных группы опыт 2 в области костного дефекта отмечалась мягкотканая мозоль с более высокой и интенсивной степенью минерализации, неоднородной структуры, по сравнению с группой опыт 1. Чаще всего плотность мозоли приближалась к плотности кортикального слоя. Определялись отдельные тонкие незрелые костные балки, как правило, в проекции коркового слоя (рис. 6а). В большинстве случаев на этом сроке отмечался физиологический остеосклероз вокруг краевого костного дефекта. Образование пластинчатой костной ткани и формирование отдельных трабекул отмечалось при сканирующей электронной микроскопии на сроках регенерации 60 суток (рис. 6б).



Рис.5. Сравнение показателей регенерации костной ткани у животных через 2 месяца после операции.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Регенерация костной ткани через 2 месяца, опыт 2. а) цифровая микрофокусная рентгенограмма, 20-кратное увеличение изображения б) СЭМ, ув. х 44,4.

Через 4 месяца после операции в группе опыт 2 определялось полное замещение дефекта костной тканью, однако новообразованная кость была незрелой, о чем свидетельствовало то, что костные балки были неравномерны по форме и величине и хаотично расположены. Отмечалось полное формирование кортикального слоя в проекции дефекта, физиологический остеосклероз вокруг новообразованной кости (рис. 7а). Данные сканирующей электронной микроскопии подтвердили формирование трабекулярной структуры костной ткани в проекции дефекта на данном сроке регенерации (рис. 7б).

В группе опыт 1 при использовании аллогенных стволовых клеток определялось запаздывание процессов регенерации на этом сроке, не отмечалось замещения дефекта костной тканью (рис. 7в). В структуре мягкотканной мозоли на микрофокусных рентгенограммах отмечались отдельные незрелые костные балки и остеогенные островки минерализации, как включения высокой плотности с нечеткими контурами.

Морфологический анализ

Морфологический анализ через 2 месяца в контрольной группе показал присутствие обширного костного дефекта (максимальная ширина составляла ? 5 мм), ограниченного фрагментами материнской кости кортикальной пластинки. Костный край изъеден, отмечается преимущественно клеточно-волокнистое содержимое костного дефекта.

В группе опыт 1 максимальная ширина костного составила ? 4 мм. В костном дефекте выявлено наличие мягкотканого регенерата, включающего в себя относительно рыхлую грубоволокнистую соединительную ткань, остатки мышечной ткани. Можно отметить, что костный матрикс регенерата приобретал характер относительно зрелой формации, однако в целом костный регенерат оставался фиброзным.

В группе опыт 2 в области краёв костных фрагментов наблюдали интенсивные напластования новообразованных трабекулярных структур, в результате чего расстояние между костными краями дефекта сокращались до ? 4 мм. Происходило уплотнение костного регенерата за счет сужения межтрабекулярных пространств. Отмечались отложения остеоидного вещества в области костных краев дефекта. Происходило утолщение костных трабекул, в которых сохраняется фиброзный костный матрикс.

Через 4 месяца в группе контроль костный дефект оставался значительным (до ?4 мм). Большая область дефекта кости была занята мышечной тканью, волокна которой местами были просветлены, возможно, за счёт убыли гликогена и дистрофических изменений. На большом протяжении края костных фрагментов были представлены трабекулярной новообразованной костной тканью грубоволокнистого типа с беспорядочно ориентированными незрелыми остеобластическими элементами. Наблюдали довольно крупные ниши с гигантскими многоядерными остеокластами, что свидетельствовало об активации процесса резорбции.

В группе опыт 1 расстояние между краями дефекта сокращалось до ? 3,5 мм. Дефект был заполнен клеточноволокнистой и грубоволокнистой соединительной тканью с остатками мышечных элементов. Происходило активное отложение новообразованной костной ткани, имеющей вид широкопетлистой сети из костных трабекул, что приводило к заметному сокращению ширины костного дефекта. Материнская кость в краевых зонах костных фрагментов проявляла тенденцию к компактизации.

В группе опыт 2 после трансплантации выявлено выраженное сокращение расстояния между косными фрагментами, которое составило ? 1мм. Костный регенерат имел тонкое трабекулярное строение и проявлял тенденцию к компактизации. Наряду с незавершённостью и несовершенством структурной дифференциации новообразованной кости, наблюдали формирование остеонов.

Гистоморфометрический анализ

В группе контроль с помощью гистоморфометрического метода через 2 месяца от начала эксперимента показано статистически достоверное превалирование костного регенерата трабекулярного строения, заполнившего только часть костного дефекта. Максимальное расстояние между костными краям составляло в эти сроки ? 5 мм (при исходном расстоянии 8 мм). Остальную часть костного дефекта занимали фиброзная соединительная и мышечная ткани. Костный матрикс был низкодифференцированным, главным образом фиброзным. Пластинчатый матрикс был представлен в незначительной части костного вещества (табл. 1, рис. 8). Через 4 месяца от начала опыта максимальное расстояние между костными краями дефекта уменьшалось до ? 4 мм. Была отмечена небольшая, но статистически достоверная, тенденция к компактизации новообразованной костной ткани. Статистически достоверно снижалась доля фиброзного и повышалась доля пластинчатого матрикса. Снижалась так же доля соединительнотканного компонента, что было связано с некоторой, отмеченной выше, компактизацией новообразованной костной ткани (табл. 1). Однако, как и через 2 месяца доля соединительнотканного компонента была достаточно высокой, что соответствовало преимущественно трабекулярному типу строения костного регенерата.

В группе опыт 1 соотношение долей площадей, занимаемых структурными детерминантами регенерата, был отличным от группы контроль. В группе опыт 1 наблюдался высокий удельный вес (доля) регенерата трабекулярного типа, который значимо возрастал со 2-го к 4-му месяцу наблюдений. Однако различие с показателем доли площадей по сравнению с контролем оставалось статистически не значимым. Доля компактизирующейся кости в регенерате со 2-го к 4-му месяцу значимо снижалась, что подтверждало факт общего увеличения трабекулярного типа строения новообразованной костной ткани в группе опыт 1 по сравнению с контрольной группой (табл. 1). При этом наблюдалось превалирование фиброзного матрикса при снижении доли пластинчатого матрикса к 4 месяцу наблюдений, по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, увеличение общей массы новообразованной костной ткани регенерата (уменьшение размера костного дефекта с 8 мм до 3,5 мм) сопровождалось построением обширных полей незрелой трабекулярной костной ткани, в которой по мере развития происходило «огрубение» самих костных трабекул.

Трансплантация в костные дефекты аутологичных стволовых клеток (группа опыт 2) имела значительно более выраженное влияние на регенерацию костной ткани, чем трансплантация аллогенных клеток. Следует отметить сокращение расстояния между костными краями дефектов в наиболее широкой их части к 4 месяцу эксперимента до ? 1 мм. Из всех групп наблюдений это сокращение размеров костных дефектов было самым значительным.

При анализе гистоморфометрических показателей обращало внимание преимущественно трабекулярное строение новообразованной костной ткани на 2-м месяце эксперимента (табл. 1), с последующим уплотнением её костного вещества, что выражалось в значимом повышении доли компактизирующейся костной ткани (табл. 1, рис. 8). Доля фиброзного матрикса в группе опыт 2 была значительно ниже, чем в группах контроль и опыт 1. Это наблюдалось в 2 и 4 месяца эксперимента. В отношении пластинчатого матрикса отмечалась обратная корреляция, т.е. доля площадей занятых более дифференцированной формацией была значимо выше, чем в предыдущих группах эксперимента (табл. 1, рис. 8). Доля соединительнотканного компонента костного регенерата к 4 месяцу наблюдений значимо сокращается, что вполне соответствует концепции уплотнения и созревания новообразованного костного вещества регенерата под влиянием введения в костную рану аутологичных СКЖТ подопытных животных.

Таблица 1. Доля площадей основных структурных детерминант регенерата, занимаемых их основными структурными детерминантами по группам наблюдений.

Структурные детерминанты	Контроль	Опыт 1	Опыт 2
	2 мес.	4 мес.	2 мес.	4 мес.	2 мес.	4 мес.
Трабекулярный регенерат	72,2 ±6,5	61,5±11,5	48,1±7,1	67,6±1,4	96,7±1,3	31,5±3,1
Компактизированный регенерат	29,8±3,1	37,8±7,6	45,6±3,5	35,3±1,8	0,5±0,8	46,6±11,1
Фиброзный матрикс	79,9±10,6	52,3±7,6	85,5±75	72,1±7,7	24,6±1,6	44,7±8,7
Пластинчатый матрикс	18,3±4,7	40,9±51	11,5±1,8	27,9±3,4	25,1±2,5	56,1±6,7
Соединительная ткань	37±5,8	31,2±3	24,1±2	27,4±3,1	34,4±2,4	18,2±4,9

Таким образом, микроскопическое исследование показало по гистоморфологическим характеристикам однотипное формирование костного регенерата во всех группах. Однако значительное уменьшение размеров дефекта свидетельствует о том, что скорость регенерации в опытных группах больше, чем в контроле. Морфометрический анализ позволил количественно оценить степень дифференциации костного матрикса регенерата в разных группах на разных сроках (рис.8).

Регенерат в контрольной группе в основном представлен менее зрелой трабекулярной фиброзной тканью. В группе опыт 2 в костном матриксе значительно снижена доля фиброзного матрикса, доля более зрелых компонентов увеличена (пластинчатая и компактизирующаяся ткань). В группе опыт 2 регенерат на всех исследованных сроках в основном представлен трабекулярным типом строения, что свидетельствует об активном новообразовании костного вещества, но не о его созревании.

Эти данные свидетельствуют о том, что трансплантация дифференцированных в остеогенном направлении СКЖТ стимулирует репаративный остеогенез. Однако происхождение клеток влияет на скорость созревания матрикса костного регенерата. Трансплантация СКЖТ аллогенного происхождения не провоцирует развитие воспалительной реакции, по крайней мере, на выбранных сроках исследования усиленной воспалительной реакции не выявлено

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8. Диаграммы распределения структурных детерминант костного регенерата в разные сроки восстановления дефекта угла нижней челюсти.

Выводы

1. Исследование дифференцировочных потенций стромальных жировых клеток (СКЖТ) in vitro показало, что они способны дифференцироваться в адипогенном, остеогенном, хондрогенном направлениях в зависимости от вида индукционной среды.

2. При введении СКЖТ в дефект костной раны кролика, с применением разработанной биоинженерной конструкцией на основе губки ГАПКОЛ, происходила активация костеобразования, что является проявлением регенераторных процессов.

3. На основании морфологического и гистоморфометрического анализа показано, что при закрытии дефекта костной ткани нижней челюсти кролика губкой ГАПКОЛ с нанесением аллогенных клеток высокий удельный вес регенерата трабекулярного типа возрастает со 2-го к 4-му месяцу наблюдений. Отмечалось активное новообразование костного вещества при отставании его созревания. Восстановление целостности костного дефекта через 4 месяца произошло на 57%.

4. На основании морфологического и гистоморфометрического анализа показано, что при закрытии дефекта костной ткани нижней челюсти кролика губкой ГАПКОЛ с нанесением аутологичных клеток через 2 месяца отмечались интенсивные напластования костной ткани. Через 4 месяца костный регенерат имел трабекулярное стороение, отмечалось формирование остеонов, восстановление целостности костного дефекта через 4 месяца произошло на 87,5%.

5. Трансплантация дифференцированных в остеогенном направлении СКЖТ стимулирует репаративный остеогенез. Происхождение клеток (аллогенные, аутологичные) влияет на скорость созревания матрикса костного регенерата - аутологичные СКЖТ имеют более выраженное влияние на остеогенез.

Практические рекомендации

1. На основании того, что сквозной дефект костной ткани угла нижней челюсти диаметром 8 мм, закрытый губкой ГАПКОЛ (ГАПКОЛ, «НПО ПОЛИСТОМ», Россия) не восстанавливался в течение 4 месяцев, то такой дефект можно считать критическим, и его можно использовать для оценки влияния стволовых клеток на носителе в качестве средства, способствующего заживлению дефектов костной ткани.

2. При закрытии сквозного дефекта костной ткани губкой ГАПКОЛ с нанесенными на ее поверхность аллогенными клетками не отмечалось отторжения трансплантата на гистологическом уровне. Это позволяет использовать как аутологичные, так и аллогенные клетки для регенерации тканей, что дает возможность постоянного наличия этих клеток для задач тканевой инженерии.

3. Для объективной оценки эффективности остеопластических материалов в экспериментальном исследовании рекомендуется использовать гистоморфометрический анализ, позволяющий оценить соотношения площадей различных структурных детерминант регенерата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Воложин А., Киселева Е., Калашникова Т., Черняев С., Васильев А., Высочанская Ю. Мультипотентные клетки жировой ткани: перспективы использования в челюстно-лицевой хирургии. // Cathedra - стоматологическое образование, 2007, Т. 6, № 3, с. 20 - 25.

Черняев С.Е., Киселева Е.В., Григорян А.С., Васильев А.В., Воложин А.И. «Мультипотентные клетки сторомы жировой ткани придают остеоиндуктивные свойства имплантатам из титана». //Материалы V Конф. молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» Москва, 2008. с. 472-473.

Васильев А.Ю., Буланова И.М., Мальгинов Н.Н., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Никулина О.М., Тарасенко И.В., Воложин А.И. «Возможности цифровой микрофокусной рентгенографии при оценке репаративной регенерации костной ткани в эксперименте». //Вестник рентгенологии и радиологии 2 - 3, 2008г. С. 21-25.

Киселева Е.В., Черняев С.Е., Воложин А.И. «Исследование регенеративного потенциала стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) на модели дефекта теменной кости кролика». //Материалы Ежегодной Всероссийской научной конференции с международным участием «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», май 2009, с.41- 42

Киселева Е.В., Черняев С.Е., Васильев А.В., Воложин А.И. «Перспективы использования стволовых клеток в рекострукции черепно-лицевого скелета». //Стоматология. 2009. - Т. 88, № 4. с. 77-81.

Киселева Е.В., Черняев С.Е. «Возможности использования стволовых клеток у детей с патологией челюстно-лицевой области». //Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Врожденная и наследственная патология головы, лица и шеи у детей: актуальные вопросы комплексного лечения», Москва, 2009 г. с. 190-192.

Воложин А.И., Васильев А.Ю., Буланова И.М., Мальгинов Н.Н., Григорян А.С., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Тарасенко И.В. «Оценка репаративной регенерации костной ткани с помощью микрофокусной ренгенографии в эксперименте с использованием аутологичных и аллогенных меземхимальных стволовых клеток». //Российская стоматология №1 том 3 2010 г. с. 50-55.

Воложин А.И., Васильев А.Ю., Мальгинов Н.Н., Буланова И.М., Григорян А.С., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Тарасенко И.В. «Использование мезенхимальных стоволовых клеток для активации репаративных процессов костной ткани челюсти в эксперименте». //Стоматология. 2010. - Т. 89, №1. с. 10-14.

Черняев С.Е., Киселева Е.В., Григорян А.С., Воложин А.И. «Влияние аллогенных и аутологичных мультипотентных сторомальных клеток жировой ткани на регенерацию костной ткани дефекта угла нижней челюсти кролика». //Стоматология. 2010. - Т. 89, №1. с. 23-29.

Мальгинов Н.Н., Воложин А.И., Лебеденко И.Ю., Васильев А.Ю., Черняев С.Е., Киселева Е.В., Серова Н.С., Петровская Н.С., Перова Н.Г. «Экспериментальное обоснование применения мезенхимальных стволовых клеток и усовершенствованных титановых имплантатов для ускорения остеоинтеграции». //Российский стоматологический журнал. 2011. - №1. с. 13-15.

Размещено на Allbest.ru

...