Миметик дисульфид глутатиона NOV-002

1561

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

Миметик дисульфид глутатиона NOV-002 ингибирует циклофсофамид-индуцированное подавление гемопоэтической активности и иммуносупрессию, снижая окислительный стресс

Окисленный миметик глутатион NOV-002 является уникальным противоопухолевым препаратом, который способен не только ингибировать пролиферацию, выживаемость и инвазию опухолевых клеток, но в некоторых ситуациях способен снизить токсическую гемопоэтическую активность и иммуносупрессию, индуцированную химиотерапией. Но пока неизвестны механизмы защиты гемопоэтической и иммунной системы с помощью NOV-002 от цитотоксических эффектов химиотерапии. Поэтому настоящее исследование посвящено изучению действий NOV-002 на мышиной модели, в которой терапия циклофосфамидом (CTX) приводила к подавлению гемопоэтической активности и иммунносупрессии. Было выявлено, что лечение NOV-002 в клинически сопоставимом дозовом режиме снижает CTX-индуцированное снижение числа гемопоэтических стволовых клеток костного мозга и клеток-предшественников (HSPCs) и купировало иммуносупрессивную активность миелоидзависимых супрессорных клеток (MDSCs), что приводило к достоверному повышению гемопоэтической и иммунной функции. Подобные эффекты NOV-002 могут объясняться способностью к модуляции клеточного окислительно-восстановительного процесса. Это предположение подтверждалось сведениями, что лечение NOV-002 вызывает экспрессию супероксиддисмутазы 3 и глутатион пероксидазы 2 в HSPCs, ингибировало CTX-индуцированное увеличение образования активных форм кислорода в HSPCs и MDSCs, и снижает CTX-индуцированное сокращение соотношения редуцированного и окисленного глутатиона в спленоцитах. Полученные наблюдения расширили понимание механизмов модуляции NOV-002 миелосупрессии и нарушения иммунной функции, индуцированного химиотерапией, и обеспечили более убедительные основания для клинического применения NOV-002 для ослабления подавления гемопоэтической активности и иммунносупрессии, индуцированной химиотерапией.

У многих онкологических пациентов, получающих химиотерапию и/или лучевую терапию, снижается гемопоэтическая активность и развивается иммуносупрессия, которая может привести к снижению доз и задержке лечения. Редукция доз и задержка лечения могут угрожать исходу противораковой терапии и снизить общую выживаемость и выживаемость без признаков заболевания [1,4-7]. Но разработка методов эффективного снижения подобных сопутствующих побочных эффектов и форсированного восстановления ослабленной гемопоэтической и иммунной функции после проведения химиотерапии и/или лучевой терапии остается важной клинической проблемой.

Растущий объем данных предполагает, что химиотерапия и лучевая терапия ухудшает гемопоэтическую и иммунную функцию, не только напрямую разрушая ДНК, а также усиливая продукцию активных форм кислорода (ROS) [8-12]. Усиленная продукция ROS в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках (HSPCs) может привести к супрессии костного мозга (BM) при индукции апоптоза и старения HSPC. Последний эффект объясняется преимущественно ROS-опосредованным циклами жизни HSPC и активацией проводящего пути старения38-p16 [13-20]. Помимо этого, усиленная продукция ROS является одним из основных механизмов, с помощью которых миелоидзависимые супрессорные клетки (MDSCs) ингибируют различные иммунные функции [21-30]. Поэтому было высказано предположение, что антиоксидантная терапия может ослабить подавление гемопоэтической активности и иммуносупрессии, вызванной химиотерапией и лучевой терапией. Но применение подобной терапии ограничено, так как существуют опасения, что антиоксиданты также могут ослабить ответ опухолевых клеток на проведенную химиотерапию и лучевую терапию.

NOV-002 представляет собой окисленную форму дисульфид глутатиона (GSSG), который имеет подтвержденную противораковую активность в комбинации с цитотоксической химиотерапией (Рис. 1A) [31-36]. Следует отметить, что на основании клинических и доклинических данных также можно предположить, что добавление NOV-002 может снизить гематологическую токсичность и иммуносупрессию, индуцированную химиотерапией [34,36]. По причине потенциальных гемопоэтических стимулирующих и иммуномодулирующих действий препарата предполагалось, что лечение NOV-002

Рис. 1. NOV-002 снижает CTX-индуцированную миелоидную супрессию Мыши получали плацебо (PBS), монотерапию CTX (CTX) или CTX в комбинации с NOV-002 (NOV + CTX). За три дня до лечения брали клетки костного мозга для анализа числа и функций HPCs и HSCs методом проточной цитометрии, и анализа CFC и CAFC, соответственно. (A) Структура NOV-002. (B) Репрезентативные методы гейтинга для анализов HPCs (Lin-, c-Kit+, Sca-1-) и HSCs (Lin-, c-Kit+, Sca-1+) в BM-MNCs методом проточной цитометрии. Показатели, указанные в диаграммах, представляют частоту встречаемости (%) каждой популяции клеток. (C) Среднее число BM-MNCs, HPCs, и HSCs у каждой мыши. (D) Среднее число CFU-GMs и CAFCs через 35 дней у каждой мыши. Данные представлены в виде средний значений ± SD из четырех или пяти независимых экспериментов. ap<0.05 vs PBS; bp<0.05 vs CTX.

может иметь особый эффект в комбинации с определенными препаратами гемопоэтической иммуносупрессивной терапии, например циклофосфамид (CTX) для лечения онкологических больных [36].

Но еще полностью не изучен механизм действия NOV-002 по модуляции ответа гемопоэтической и иммунной системы на химиотерапию и/или лучевую терапию. Было предположено, что фармакологические эффекты NOV-002 могут объясняться модуляцией редокс-функции клеток компонентом GSSG [33,35,36]. Подобная модуляция может лежать в основе клинических эффектов препарата, включая активацию гематологического восстановления и иммуностимуляции на фоне ослабления гемопоэтической и иммунной системы, индуцированного химиотерапией, которые наблюдались в более ранних исследованиях [33,35,36]. Чтобы протестировать эту гипотезу, изучали эффекты NOV-002 на CTX-индуцированную гемопоэтическую токсичность и иммуносупрессию в мышиной модели. Полученные результаты показали, что лечение NOV-002 индуцировало экспрессию супероксиддисмутазы (SOD) 3 и глутатиона пероксидазы (GPX) 2 в HSPCs, подавляло CTX-индуцированное усиление продукции ROS в HSPCs и MDSCs и уменьшало CTX-индуцированное сокращение соотношения редуцированного- окисленного глутатиона в селезенке. Подобные эффекты приводили к достоверному повышению гемопоэтической и иммунной функции. Полученные наблюдения расширили понимание механизмов NOV-002 в модуляции миелосупрессии и нарушения иммунной функции, индуцированного химиотерапией, и обосновывают проведение клинического исследования NOV-002 для активации процесса восстановления костного мозга и усиления иммунитета на фоне цитотоксической химиотерапии.

Материалы и методы

Мыши

Самцов мышей C57BL/6 (Ly5.2) приобрели в компании Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA). Мышей помещали в клетку по четыре особи и не ограничивали потребление корма и воды. Для эксперимента использовали мышей в возрасте примерно 8-12 недель. Животных разделили на три группы, минимум по три-пять мышей в группе: контрольная группа, группа CTX и NOV-002 в комбинации CTX. Контрольные мыши получали только фосфатно-буферный раствор (PBS), мышам CTX внутрибрюшинно (в.б.) вводили CTX (200 мг/кг; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в день 0, и мышам из группы NOV-002 + CTX ежедневно на протяжении семи последующих дней вводили внутрибрюшинно 25 мг/кг NOV-002 (Nove-los Therapeutics, Newton, MA, USA), начиная за день до введения CTX. В дни 3 и 7 после лечения CTX мышей умерщвляли с помощью CO2 и смещения шейных позвонков для забора клеток костного мозга, как сказано далее. Pmel-1 трансгенных мышей (Ly5.2), которых поставила Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA), выращивали в AAALAC-сертифицированном виварии Медицинского Университета Южной Каролины (MUSC). T-клетки Pmel-1 трансгенных мышей, экспрессирующих Vcd/V (рецептор Т-клетки 313) специфично распознают H-2Db-рестриктированный человеческий эпитоп gp10025-33 (KVPRNQDWL: gp10025-33). Этот пептид представляет собой измененную форму мышиного gp10025-33 (EGSRNQDWL) с более высокой способностью к связыванию с MHC класса I. Комиссия по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных MUSC и Университета Майами одобрила все экспериментальные процедуры, которые использовали в этом исследовании.

Выделение мононуклеарных клеток костного мозга (BM-MNCs) и приготовление спленоцитов

Бедренную и большеберцовую кость брали у мышей незамедлительно после умерщвления. Клетки костного мозга вымывали из костной ткани и помещали в сбалансированный солевой раствор Хенкса, содержащий 2% фетальную телячью сыворотку, используя иглу 21 калибра и 5-мл шприц. Собирали пул клеток трех-пяти мышей для получения достаточного числа клеток и центрифугировали через Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich) для выделения мононуклеарных клеток костного мозга. Готовили одноклеточные суспензии из селезенки животных [20,37].

Количественный анализ гемопоэтических стволовых клеток костного мозга (HSCs) и гемопоэтических клеток-предшественников (HPCs)

Инкубировали 1x106 BM-MNCs биотин-конъюгированными крысиными антителами против CD3, CD45R/B220, Gr-1, Mac-1 и Ter-119, и стрептавидина-FITC. После инкубации антителами к CD16/CD32 осуществляли окрашивание антителами к Sca-1-PE и c-kit-APC. Все антитела были приобретены в BD Biosciences (San Diego, CA, USA). Клетки Lin-, c-Kit+, Sca-1 + представляли собой обогащенные HSCs и Lin-, c-Kit+, клетки Sca-1- это гемопоэтические клетки-предшественники. Для получения каждого образца анализировали как минимум 200,000 клеток на FACSCalibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA), а полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton-Dickinson) после гейтинга жизнеспособных клеток.

Анализ колониеобразующих клеток (CFC)

Гранулоцитарно-моноцитарную колониеобразующую единицу (CFU-GM) анализировали методом анализа CFC для определения функции HPC. Суспендировали BM-MNCs в среде MethocultM3434 (StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada) при 2x104 жизнеспособных клеток/мл и делали посев на лунках 24-луночных плашек. Чашки инкубировали при температуре 37°C в увлажненном инкубаторе с наличием 5% CO2 в воздухе на протяжении 7 дней. Осуществляли подсчет колоний по 50 или более клеток, используя инвертированный микроскоп.

Анализ клеток, образующих области булыжника (CAFC)

Анализ CAFC осуществляли в соответствии с процедурами, разработанными Pleomacher et al., модифицированными, как ранее сообщалось [37-39]. Стромальные слои готовили, осуществляя посев 103 FBMD-1 стромальных клеток/лунка на плоскодонных 96-луночных плашках (Falcon, Lincoln Park, NJ, USA). Одну неделю спустя, выполняли наложение BM-MNCs на эти стромальные слои в шести разведениях, по 3 разведения, состоящих по 20 лунок на разведение, для анализа предельного разведения клеток-предшественников, образующих гемопоэтические клоны под стромальным слоем. Культуры еженедельно подпитывали, меняя Ѕ среды. Определяли частоту встречаемости CAFCs через 35 дня с момента посева для определения клоногенной функции HSCs, как было сказано ранее [37-39].

Анализ частоты встречаемости клеток-предшественников эритроцитов в BM-MNCs методом проточной цитометрии

Инкубировали 1 x106 BM-MNCs с антителом к CD16/CD32 (BD Biosciences) для подавления антитело-неспецифичного связывания. Затем клетки окрашивали PE-конъюгированным Ter-199 антителом (BD Biosciences) для маркировки клеток-предшественников эритроцитов. Фенотипический анализ клеток-предшественников выполняли с помощью FACSCalibur (Becton-Dickinson), а полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton-Dickinson) после гейтинга жизнеспособных клеток. а полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton-Dickinson) после гейтинга жизнеспособных клеток.

Анализ продукции ROS в BM HSPCs

Гемопоэтические клетки негативной линии дифференцировки костного мозга (клетки Lin-) выделяли вышеуказанным методом [8,9]. Клетки Lin- (1x106/мл) окрашивали антителами к Sca-1-PE, и антитела к c-Kit-APC суспендировали в фосфатно-солевом буферном растворе, дополненном 5 мМ глюкозы, 1 мМ CaCl2, 0.5мМ MMgSO4 и 5 мг/мл альбумина бычьей сыворотки и затем инкубировали 5-(и-6)-хлорометил-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат (CM-H2DCFDA; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) (10 мМ) на протяжении 30 минут при температуре 37 °C. Уровни ROS в клетках Lin, HPCs и HSCs анализировали при измерении средней интенсивности флуоресценции (MFI) 2',7'- -дихлордигидрофлуоресцеина (DCF), с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton-Dickinson). Для каждого образца получали как минимум 200,000 Lin- клеток, и данные анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton-Dickinson). Во всех экспериментах использовали изотипический контроль PE и APC, и иной положительный, и отрицательный контроль.

Анализ частоты встречаемости MDSCs в периферической крови и селезенке методом проточной цитометрии

Периферическую кровь и суспензии клеток печени инкубировали APC- и PE-конъюгированными антителами к CD11b и Ly6G (BD Biosciences). Процентную долю популяций двойных положительных клеток определяли с помощью проточного цитометра FACSCalibur (Becton-Dickinson). Для каждого образца получали как минимум 200,000 Lin- клеток, а полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest (Becton-Dickinson).

Анализ супрессии Т-клеток in vitro

Спленоциты инкубировали APC- и PE-конъюгированными антителами к CD11b и Ly6G (BD Biosciences). CD11b+, клетки Ly6G+ MDSCs выделяли методом сортировки клеток, используя сортировщик клеток Aria (BD Biosciences). CD3+ T клетки изолировали с помощью магнитных микроносителей (BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Осуществляли посев MDSCs и T-клеток в указанном соотношении и стимулировали гранулами, покрытыми антителами к CD3/CD28 (BD Biosciences) в соотношении 1 гранула/1 гранула. Через пять дней после посева клетки возбуждали [3H] тимидином на протяжении ночи, и включение [3H]тимидина определяли с помощью сцинтилляционного счётчика. Процентную долю угнетенной пролиферации Т-клеток рассчитывали по формуле (число копий в минуту из лунок, содержащих MDSCsx 100)/(число копий в минуту из лунок, не содержащих t MDSCs).

Анализ супрессии Т-клеток in vivo

Мыши C57BL/6 (Ly5.2+) получали PBS, CTX или NOV-002 и CTX, как было сказано ранее. В день 7 после введения CTX осуществляли адаптивный перенос этим мышам 1x107спленоцитов от мышей Pmel (Ly5.1+). Реципиентных мышей вакцинировали 100 мкг пептида мышиной меланомы gp10025-33 через 24 часа после переноса клеток. Частоту встречаемости перенесенных Pmel T-клеток определяли через 3 дня после вакцинации методом проточной цитометрии дл выявления Ly5.1 + донорских Т-клеток.

Анализ продукции ROS в MDSCs

Клетки костного мозга инкубировали при температуре 37 °C в присутствии 5 мкм CM-H2DCFDA на протяжении 30 минут после иммунноокрашивания APC-и PE-конъюгированными антителами к-CD11b и Ly6G (BD Biosciences). Для индуцированной активации осуществляли посев клеток одновременно с CM-H2DCFDA и 30 нг/мл форболмиристата ацетата (PMA; Sigma-Aldrich). Затем выполняли анализ продукции ROS CD11b+,Ly6G+ MDSCs методом проточной цитометрии, как было сказано ранее.

Анализ соотношения редуцированного (GSH) и окисленного глутатиона (GSSG)

Срезы селезенки тех мышей подвергали криозаморозке с PBS (образец GSH) или 30 мкг акцепторного раствора (образец GSSG sample) (Oxford Biomedical Research, Rochester Hills, MI, USA). Объем GSH и GSSG оценивали с помощью набора реагентов для микропланшетного формата (Oxford Biomedical Research) после размораживания и депротеинизации 5% раствором метафосфорной кислоты. Концентрации GSH и GSSG экстраполировали из калибрационной кривой, и соотношение рассчитывали следующим образом: соотношение = GSHt - 2GSSG/GSSG.

Анализ экспрессии мРНК антиоксидантных ферментов в HSPCs методом ПЦР-РВ

Тотальную РНК экстрагировали из очищенных HSPCs (клетки Lin-,c-Kit+, Sca-1 +) с помощью мини-набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Затем из тотальной РНК синтезировали первую цепь кДНК, используя систему для синтеза первой цепи (Invitrogen) как было ранее сказано. Праймеры ПЦР для SOD1, SOD2, SOD3, каталазы, GPX1, GPX2, пероксиредоксина (PRDX) 1, PRDX2 и тиоредоксинредуктазы (TXNRD) 1 были изготовлены по особому заказу и были получены у DNATechnologies (Coralville, IA, USA). Последовательность праймеров перечислена в Таблице 1. Значение порогового цикла (Ct)для каждого гена нормализовали до значения Ct глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Относительную экспрессию мРНК рассчитывали сравнительным методом Ct (2-AAQ).

Статистические анализы

Статистические анализы проводили с помощью двухстороннего t-критерия и непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия были достоверными при значении p <0.05. Все анализы выполняли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism от GraphPad, Inc. (San Diego, CA, USA).

Результаты

NOV-002 снижает CTX-индуцированную миелосупрессию, защищая HSPCs

Таблица 1 Последовательность праймеров, использованных для ПРЦ-РВ.

S, смысловые; A, антисмысловые

дисульфид глутатион гемопоэтический иммунносупрессия

Для изучения механизмов, с помощью которых NOV-002 снижает токсичность для костного мозга, индуцированную химиотерапией, в первую очередь изучали эффекты лечения NOV-002 на миелосупрессию, индуцированную CTX, на мышиной модели. В данной модели мыши получали однократную дозу CTX в комбинации или без ежедневных инъекций NOV-002, начиная за один день до химиотерапии. Подобный ежедневный режим дозирования приближен к графику дозирования NOV-002, который применяли в клинических исследованиях. В день 3 после лечения CTX мышей умерщвляли и получали клетки костного мозга. Частоту встречаемости HSCs (клетки Lin-, c-Kit+, Sca-1+) и HPCs (клетки Lin-, c-Kit+, Sca-1-) в BM-MNCs анализировали методом проточной цитометрии (Рис. 1B). Число этих клеток рассчитывали на основании общего числа BM-MNCs и вычисляли среднее значение для каждой мыши в тех же лечебных группах. Исходный эксперимент показал, что у мышей, получавших монотерапию NOV-002, не отмечено достоверных изменений различных показателей костного мозга по сравнению с контрольными животными группы плацебо (данные не представлены). Поэтому эту группу исключили из последующих экспериментов исследования. Как показано на Рис. 1C, лечение CTX привело к снижению числа BM-MNCs, HPCs и HSCs. Подобное снижение сократилось на фоне лечения NOV-002. Чтобы изучить потенциальный протективный эффект лечения NOV-002 To на клоногенную функцию HPCs и HSCs, провели анализы CFU-GM и CAFC, соответственно. В соответствии с предыдущими наблюдениями, CTX достоверно снижало клогенную функцию HPCs и HSCs [9]. Но ежедневные инъекции NOV-002 привели к достоверно высоким уровням клоногенной функции HSC, согласно показателям CAFCs в день 35 по сравнению с монотерапией CTX. Подобным образом, мыши, получавшие NOV-002, имели достоверно более высокую клоногенную функцию, согласно показателям HPC CFU-GMs, чем мыши, получавшие монотерапию CTX, но в меньшей степени, чем HSCs (Рис. 1D).

Так как по результатам предыдущих клинических исследований по изучению NOV-002 у онкологических больных, получающих химиотерапию, сообщалось о снижении случаев анемии [36,40], изучалось, оказывает ли лечение NOV-002 эффект на CTX-индуцированное повреждение клеток-предшественников эритроцитов. В этой связи, суспензии клеток костного мозга брали у мышей в день 3 после введения PBS или CTX на фоне или без лечения NOV-002. Эти клетки окрашивали антителом против эритроидного маркера Ter-119. На Рис. 2A изображена репрезентативная точечная диаграмма клеток костного мозга из каждой экспериментальной группы. Были отмечены достоверно более высокие уровни Ter-119-позитивных клеток в клетках костного мозга, взятых у мышей, получавших NOV-002, в день 3 после приемаCTX по сравнению с мышами, получавшими монотерапию CTX (Рис. 2B). Также отметили большее число предшественников мегакариоцитов-эритроцитов, из которых образовались клеточные линии мегакариоцитов-эритроцитов, в костном мозге мышей, получавших NOV-002 в день 3 после лечения CTX, по сравнению с числом клеток у мышей, получавших монотерапию CTX (данные не представлены). В своей совокупности, полученные данные позволяют предположить, что лечение NOV-002 может снизить токсичность, индуцированную CTX, не только ослабляя снижение числа HSCs и HPCs, а также сохраняя их гемопоэтическую функцию.

NOV-002 ингибирует CTX-повышение продукции ROS в HSPCs

Степень продукции ROS в HSPCs может усиливаться при различных патологических условиях, которые подавляют функцию HSPC и супрессию костного мозга, так как ROS может вызывать апоптоз и старение HSPC дозозависимым образом [13-20]. Было изучено, может ли NOV-002 как модулятор окислительно-восстановительного процесса ослаблять CTX-индуцированную супрессию в том, что касается инактивации продукции ROS в HSPCs. Как показано на Рис. 3, средняя интенсивность флуоресценции DCF в гемопоэтических клетках Lin- BM, HPCs и HSCs, взятых у животных, получавших CTX, была достоверно выше, чем в клетках мышах, получавших PBS. Маловероятно, что подобное изменение вызвано различиями поглощения CM-H2DCFDA и оттока DCF между клетками мышей группы PBS и мышей группы CTX, так как они продемонстрировали аналогичную среднюю интенсивность флуоресценции DCF MFI после инкубации клеток облученными CM-H2DCFDA (данные не представлены). Помимо этого, Mn(III) мезо-тетракис(N-этилпиридин-2-ил)порфирин, миметик супероксид дисмутаза и мощный антиоксидант, может ингибировать CTX-индуцированное повышение DCF MFI в HSPCs (данные не представлены). Полученные результаты позволяют предположить, что лечение CTX повышает продукцию ROS в гемопоэтических клетках.C.M. Diaz-Montero et al. / Free Radical Biology & Medicine 52 (2012) 1560-1568 1565

Рис. 2. NOV-002 оказывает протективный эффект на предшественники эритроцитов от СTX-индуцированной токсичности. Мыши получали плацебо (PBS), монотерапию CTX (CTX) или CTX в комбинации с NOV-002 (NOV + CTX). Через три дня после лечения собирали клетки костного мозга для анализа Ter-119+ эритроидных клеток (A) Репрезентативные методы гейтинга для анализа Ter-119+ эритроидных клеток в BM-MNCs методом проточной цитометрии. Показатели на диаграммах разброса данных представляют частота встречаемости (%) of Ter-119+ эритроидных клеток в BM-MNCs. (B) Среднее количество BM Ter-119+ клеток у каждой мыши. Данные представлены в виде средних значений ± SD в трех независимых экспериментах ap<0.05 vs PBS; bp<0.05 vs CTX.

Следует отметить, что на фоне лечения NOV-002 прекращался рост HSCs, и снижалось число Lin-клеток. Полученные результаты указывают что NOV-002 достоверно снижает продукцию ROS в HSPCs, что свидетельствует о достоверном протективном эффекте для HSPCs от CTX-индуцированной токсичности.

NOV-002 не снижает индукции миелоид-зависимых супрессорных клеток CTX, но снижает иммуносупрессорную активность

Группа исследователей ранее сообщала, что лечение CTX может повышать уровни циркулирующих MDSCs (клетки CD11b+,Ly6G+) как у мышей, так и человека [22,41 -46]. MDSCs являются мощными супрессорами клеточно-опосредованного ответа [28,47] и поэтому могут способствовать CTX-индуцированной иммуносупрессии [46]. Изучалось, может ли лечение NOV-002 оказать эффект на CTX-индуцированную иммуносупрессию, модулируя индукцию и активность MDSCs. Как показано на Рис. 4A, CTX достоверно увеличивает частоту встречаемости MDSCs в селезенке и периферической крови. Лечение NOV-002 не влияло на увеличение числа клеток. Также определялось, оказывало ли лечение NOV-002 на иммуносупрессорную активность MDSCs. В этой связи, осуществляли посев T-клеток и очищенных MDSCs при различных соотношениях T-клеток и MDSC, а также активировали гранулами, покрытыми моноклональными антителами против CD3 и CD28. Пролиферацию T-клеток определяли на основании включения[3H]тимидина, и процентную супрессию пролиферации T-клеток рассчитывали на основании пролиферации, наблюдаемой при отсутствии MDSCs. На Рис. 4B показано достоверное снижение процентной супрессии пролиферации T-клеток MDSCs, взятыми у мышей, получавших CTX + NOV-002, по сравнению с MDSCs, взятыми у мышей, получавших монотерапию CTX.

Далее изучали эффект лечения NOV-002 на иммуносупрессорную активность in vivo CTX-индуцированных MDSCs. В этом исследовании C57BL/6 (Ly5.2) мышам вводили PBS, CTX или CTX + NOV-002, как

было сказано ранее. Через 7 дней лечения 1 x 107 спленоцитов, взятых у мышей Pmel (Ly5.1+), адаптивно переносились испытуемым мышам. Через один день после переноса реципиентные мыши получали 100 нг когната gp100 пептида, и через 3 дня определяли частоту встречаемости клеток Pmel в периферической крови методом проточной цитометрии в соответствии с окрашиванием Ly5.1 среди лимфоцитов хозяина, как показано на Рис. 4C. Рис. 4D показывает устойчивый рост лимфоцитов Pmel в ответ на активацию когнат пептидом у мышей, которые не получали CTX. Но подобный рост достоверно снижался после лечения CTX, предположительно по причине супрессорного эффекта CTX-зависимых MDSC [23,28,29]. И, напротив, ежедневные инъекции NOV-002 после лечения CTX смогли снизить сокращение роста клеток Pmel. Полученные результаты позволяют предположить, что NOV-002, хотя и неспособен повлиять на общий рост CTX-зависимых MDSCs, как показано на Рис. 4C, может снизить способность к подавления Т-клеточной иммунной реакции.

Лечение ингибирует NOV-002 продукцию ROS CTX-индуцированными миелоид-зависимыми супрессорными клетками и увеличивает соотношение GSH/GSSG в MDSCs, взятых у мышей группы CTX

Для дальнейшего изучения механизма, связанного со снижением иммуносупрессорной активности CTX-индуцированных DSCs после лечения NOV-002, измеряли уровни ROS в MDSCs мышей, получавших CTX или CTX+ NOV-002, так как было сделано предположение, что повышенная продукция ROS может усилить иммуносупрессорную активность MDSCs [23,28-30]. Продукцию ROS миелоид-зависимыми супрессорными клетками у мышей, получавших лечение CTX и/или NOV-002, определяли методом проточной цитометрии с/без стимуляции форболмиристацетатом, как показано на Рис. 5A. Лечение мышей препаратом NOV-002 достоверно снижало продукцию ROS в нестимулируемых MDSCs мышей, получавших CTX, приблизительно на 44%. Как и предполагалось, стимуляция MDSCs со дня 7 у мышей группы CTX с PMA (30 нг/мл) приводила к дальнейшему повышению продукции ROS.

Размещено на http://www.allbest.ru//

Рис. 3. NOV-002 ингибирует CTX-индуцированную продукцию ROS в BM HSPCs. Мыши получали плацебо (PBS), монотерапию CTX (CTX) или CTX в комбинации с NOV-002 (NOV+CTX). Через три дня после лечения собирали клетки костного мозга и анализировали. (A) Репрезентативный анализ продукции ROS в гемопоэтических клетках негативной линии дифференцировки костного мозга (Lin-), HPCs и HSCs методом проточной цитометри. Показатели на диаграммах разброса данных - средняя интенсивность DCF. (B) Процентное повышение продукции ROS production клетками Lin-, HPCs и HSCs после лечения CTX или CTX в комбинации с NOV-002 по сравнению с клетками, обработанными

PBS, в соответствии с изменениями DCF MFI. Данные представлены в виде средних значений ± SD трех независимых экспериментов. ***p<0.05 vs CTX.

Рис. 4. NOV-002 не снижает индукции MDSCs препаратом CTX, но ослабляет иммуносупрессивную активность. Мыши получали плацебо (PBS), монотерапию CTX (CTX) или CTX в комбинации NOV-002 (NOV+CTX). Через семь дней после лечения брали клетки периферической крови и спленоциты для анализа CD11b+,Ly6G+ MDSCs методом проточной цитометрии. (A) Процентная доля MDSCs в клетках периферической крови и спленоцитах. Данные представлены в виде средних значений ± SD трех независимых экспериментов. ap< 0.05 vs PBS. (B) Процентная супрессия пролиферации Т-клеток in vitro MDSCs, взятыми из селезенки мышей, получавших CTX или NOV-002+ CTX. Данные представлены в виде средних значений ± SD трех независимых экспериментов. *p=0.05 и **p = 0.01 vs CTX. (C) Метод гейтинга для определения роста Т-клеток Pmel, полученных у донора (Thy1.1+) после адаптивного трансфера и вакцинации. Показатели на диаграмме разброса данных - это частота встречаемости (%) Pmel -T-клеток, полученных у донора, в селезенке, Thy1.1-позитивных T-клеток. (D) Кратное увеличение роста полученных от донора Pmel T-клеток после вакцинации по сравнению с мышами без адаптивного переноса. Данные представлены в виде средних значений ± SD пяти независимых экспериментов. ap< 0.02 vs PBS; bp < 0.01 vs CTX.

Но подобное повышение вновь достоверно снижалось на фоне лечения NOV-002 (Рис. 5B). Помимо этого, анализировали общие уровни GSH и GSSG в селезенке, рассчитывали соотношение, и было выявлено, что лечение CTX достоверно снижало соотношение GSH/GSSG, тогда как лечение NOV-002 сокращало подобное снижение (Рис. 5C). Полученные результаты предполагали, что лечение NOV-002 снижало продукцию ROS CTX-индуцированными MDSCs, что может способствовать купированию MDSC-опосредованную иммуносупрессию функции T-клеток.

Лечение NOV-002 повышает экспрессию SOD3 в GPX2 HSPCs

Для большего понимания механизмов регуляции NOV-002 продукции ROS в гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников после лечения CTX проводили анализ экспрессии РНК нескольких значимых

антиоксидантных ферментов с помощью ПЦР в режиме реального времени. Как показано на Рис. 6, экспрессия SOD3 и GPX2 мРНК HSPCs инактивировалась более чем на 50% на фоне лечения CTX, тогда как экспрессия всех остальных изучаемых антиоксидантных ферментов достоверно не менялась при инъекции CTX. Лечение NOV-002 полностью подавляло инактивацию экспрессии SOD3 и GPX2 мРНК в HSPCs. Также следует отметить, что экспрессия SOD3 мРНК фактически увеличивалась в 2.5 раза в клетках мышей, получавших NOV-002, по сравнению с клетками мышей, получавших PBS. Полученные наблюдения позволяют предположить, что NOV-002 может как минимум частично ингибировать CTX-индуцированный окислительный стресс в HSPCs, активируя экспрессию SOD3 и GPX2.

Обсуждение

Гематологическая токсичность и иммуносупрессия являются распространенными осложнениями химиотерапии у онкологических больных [6,48]. Механизмы, вызывающие осложнения на фоне приема химиотерапевтических препаратов, еще полностью не изучены, но могут частично объясняться индукцией повышенной продукции ROS в HSPCs [49-54] и MDSCs [23,29].

Рис. 6. Эффекты лечения NOV-002 на экспрессию мРНК определенных антиоксидантных ферментов в HSPCs. Мыши получали плацебо (PBS), монотерапию CTX (CTX) или CTX в комбинации с NOV-002 (NOV + CTX). Через три дня лечения HSPCs очищали с помощью сортировки клеток, и экспрессия мРНК определенных антиоксидантных ферментов количественно определялась с помощью ПЦР в режиме реального времени. Полученные данные представлены в виде средних значений ± SD кратных изменений по сравнению с клетками, обработанными PBS (n = 3).

Было установлено, что повышенная продукция ROS способствует супрессии костного мозга, индуцированной облучением всего тела [9]. Но роль ROS в опосредованной супрессии костного мозга, индуцированной химиотерапевтическими препаратами, такими как CTX, еще полностью не изучена. Настоящие исследования позволяют предположить, что ROS также может играть важную роль в CTX-индуцированной миелосупрессии. Во-первых, было отмечено, что повышенная продукция ROS связана с CTX-индуцированной гемопоэтической токсичностью. Более того, проведенное исследование показывает, что добавление миметика глутатиона сульфида NOV-002 к CTX, широко используемого химиотерапевтического препарата, имеет протективный эффект для HSPCs костного мозга от цитотоксических эффектов CTX, включая сохранение числа BM HSPCs и их клоногенной активности. Протективные эффекты NOV-002 от действия CTX могут объясняться способностью к модуляции редокс-клеточной функции. Это предположение подтверждалось наблюдением, что лечение NOV-002 активировало экспрессию SOD3 и GPX2 в HSPCs, ингибировало CTX-индуцированное повышение продукции ROS в HSPCs и MDSCs, ослабляло CTX-индуцированное сокращение соотношения GSH/GSSG в MDSCs. Но еще не изучены механизмы ROS-опосредованное CTX-индуцированного повреждения HSPC. Но показано, что ROS может нарушать функцию HSPC, индуцируя апоптоз и старение HSPC. Индукция апоптоза HSPC преимущественно приписывается ROS-индуцированному окислительному повреждению. И, напротив, индукция старения HSPC может привести к ROS-опосредованной стимуляции циклов жизни HSPC и активации p38 митоген-активируемого пути протеинкиназы-p16Ink4a. Еще потребуется определить, что CTX вызывает супрессию костного мозга посредством индукции апоптоза и/или старения HSPC, вызванного ROS. Помимо этого, оказалось, что протективный эффект NOV-002 на HSCs превышает эффект на HPCs, как показано на Рис. 1C и D. Это может объясняться более высокой чувствительностью HSCs к окислительному повреждению по сравнению с HPCs, как было показано в предыдущих исследованиях [9,15-17]. Хотя NOV-002 может оказывать протективный эффект на HSPCs, ингибируя CTX-индуцированную продукцию ROS, маловероятно, что NOV-002 повысит риск развития у онкологических пациентов вторичных злокачественных новообразований. Это объясняется тем, что усиленная продукция ROS является основополагающим механизмом, а облучение вызывает генетическую нестабильность, которая может привести к индукции лейкемии и рака.

MDSCs представляют собой гетерогенную популяцию незрелых миелоидных клеток, число которых может значительно увеличиваться на фоне различных заболеваний, включая рак, аутоиммунные заболевания, травмы, ожоги и сепсис, а также в ответ на определенные иммуносупрессорные химиотерапевтические препараты, например CTX [21-23,28,29]. Первоначальные исследования по изучению MDSCs в основном проводились на онкологических больных, особое внимание уделялось способности MDSCs к подавлению активации T-клеток через различные механизмы, включая продукцию ROS, деплецию GSH, нитросилирование рецептора T-клеток, деплецию внеклеточного аргинина (важный микронутриент для T-клеток) и секрецию иммунно-ингибирующих цитокинов и молекул (например, ИЛ-10 и простагландины) [21-30]. Группа исследователей ранее показала взаимосвязь между химиотерапией препаратами CTX и повышенными уровнями циркулирующих MDSCs, которые могут подавлять активацию T-клеток в различных доклинических и клинических условиях [22,42-45]. Полученные результаты, представленные в этой статье, показали, что NOV-002 не оказывает влияния на общие уровни CTX-индуцированных MDSCs. Но было отмечено, что миелоид-зависимые супрессорные клетки мышей, получавших NOV-002, имели сниженные иммуносупрессорные способности. Так как один из иммуносупрессорных механизмов MDSCs состоит в продукции ROS, изучали, влиял ли прием NOV-002 на способность MDSCs продуцировать ROS. Полученные наблюдения позволяют предположить, что ежедневное назначение NOV-002 могло купировать супрессию T-клеток с помощью CTX-индуцированных MDSCs in vivo, посредством инактивации продукции ROS, как наблюдалось в HSCs/HPCs.

Полученные наблюдения говорят о том, что фармакологические модуляторы редокс-баланса, например NOV-002, могут быть альтернативой факторам роста для снижения гематологической токсичности и иммуносупрессии, индуцированной химиотерапией. Это исключительно важно, так как сомнения по широкому применению стимуляторов эритропоэза, снижающих выживаемость и/или приводящих к менее оптимистичным исходам заболевания у онкологических больных, ограничили их применение, и не существует актуальных альтернативных методов лечения, помимо переливания крови. Более того, полученные результаты также показали, что NOV-002 способен модулировать супрессорные эффекты CTX-зависимых MDSCs. Проведенные исследования углубили наше понимание о гематологических эффектах NOV-002. Одно предыдущее рандомизированное исследование фазы 2 у пациентов с распространенным немелкоклеточным раком легкого, получавших химиотерапию препаратами платины с комбинации с ежедневными инъекциями NOV-002, выявило, что пациенты, получавшие NOV-002 в комбинации с химиотерапией, имели сниженную выраженность гематологической токсичности, вызванной химиотерапией, что подтверждалось достоверно более высоким число лейкоцитов периферической крови, гемоглобина и лимфоцитов [36]. Но подобные наблюдения не наблюдались в последующем, более крупномасштабном рандомизированном исследовании фазы 3. Полученные результаты предполагают, что повышение гематологических показателей при добавлении ежедневных инъекций NOV-002, которое наблюдалось в некоторых клинических исследованиях, может частично объясняться способностью препарата ингибировать продукцию ROS в HSPCs в ответ на химиотерапию. Однако, в отличие от иных редокс-модулирующих препаратов, в частности различных антиоксидантов, NOV-002 не защищает опухолевые клетки от действия химиотерапии. Поэтому NOV-002 может оказывать определенный клинический эффект в снижении гематологической токсичности и иммуносупрессии, индуцированной химиотерапией, у онкологических больных.

Размещено на Allbest.ru