Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

УДК: 616.314.17-008.1-089.844

14.00.21 - «Стоматология»

14.00.16 - «Патологическая физиология»

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ НОВОГО ОСТЕОПЛАСТИЧЕСКОГО ГЕЛЯ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНА И ГИДРОКСИАПАТИТА С НЕКОЛЛАГЕНОВЫМИ БЕЛКАМИ КОСТИ ДЛЯ ЗАПОЛНЕНИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ ЧЕЛЮСТЕЙ

КОРОТЕЕВ А.А.

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Научные руководители:

Засл. деят. науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Барер Гарри Михайлович

Засл. деят. науки РФ, Лауреат государственной премии РФ в области науки и техники, доктор медицинских наук, профессор

Воложин Александр Ильич

Официальные оппоненты:

Засл. врач РФ, доктор медицинских наук, профессор

Елизарова Валентина Михайловна

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Мовшев Борис Ефимович

Ведущая организация:

ФГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий».

Защита состоится «___» _______________2007 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127006, г. Москва, ул. Долгоруковская, д. 4.

Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Автореферат разослан «___» ________________2007 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н., доцент Н.В.Шарагин

1. Основная характеристика

Актуальность проблемы

Актуальной проблемой стоматологии и челюстно-лицевой хирургии является поиск остеопластических материалов для заполнения костных дефектов, в том числе, при выполнении операций на тканях пародонта. С этой целью применяют разнообразные материалы аутогенного, аллогенного, ксеногенного происхождения, синтетические, а также мембраны для направленной регенерации костной ткани. Большое распространение получили костно-пластические материалы на основе коллагена, гидроксиапатита, других фосфорно-кальциевых соединений и с введением в их состав различных бактерицидных компонентов, стимуляторов регенерации и т.д. (В.К. Леонтьев и др., 1995; А.И. Воложин и др., 1996; 1999; В.С. Агапов и др., 1999; С.Г. Курдюмов и др., 2000).

Среди остеопластических материалов исследованы в эксперименте и рекомендованы в практику гелевые композиции (Нидаль А.А.-А., 1997; А.И.Воложин и др., 2002-2005; А.В.Войнов, 2005;В.В.Сарычев, 2005).

Разработаны и предложены в практику различные композиции гелей для костной пластики. В качестве основы геля для введения в ткань рекомендованы полиакриламидный гель, гиалуроновая кислота и коллаген. Эти высокомолекулярные вещества с полимерными свойствами разрешены к применению в клинике в качестве имплантационных материалов. К настоящему времени гели, основанные на полиакриламиде, используются нечасто, так как дают высокий процент осложнений, о чем свидетельствуют данные литературы (А.И. Неробеев, 2002). Более перспективным является применение в качестве гелевой основы гиалуроновой кислоты. Она используется в косметологии и других разделах медицины как наружное средство и при введении в ткань, например, для устранения морщин. Имеется удачный опыт применения геля на основе гиалуроновой кислоты в соединении с гидроксиапатитом для придания этой композиции остеоинтегративных свойств (В.В. Сойфер, 2005).Такой гель способствует новообразованию костной ткани в искусственно вызванных дефектах челюсти. Гели могут быть использованы для заполнения пространства между мембраной и минерализованными тканями пародонта для направленной регенерации тканей пародонта. Мембраны для направленной регенерации костной ткани широко используют в пародонтологии (Nyman et al., 1982; Drummond et al., 1995; Buns, 1995). Однако необходимо дальнейшее совершенствование гелевых форм материалов, так как в клинических условиях нередко необходимо стимулировать заживление костной раны у пациентов со сниженным репаративным потенциалом, что встречается при иммунодефицитном состоянии, сахарном диабете, патологии печени и т.д.

В связи с этим актуальной проблемой стоматологии и патофизиологии является разработка усовершенствованного варианта остеоинтегративного геля, содержащего остеостимулирующие и остеоиндуктивные факторы. К ним относятся морфогенетические протеины, которые выделены и сравнительно недавно их начали использовать в практической медицине. Очень мало известно о гелях, основанных на коллагене, они используются главным образом в косметологии, офтальмологии. Коллагеновый гель, обладающий остеоиндуктивным свойством, еще не разработан, что является актуальной проблемой медицины. На создание и изучение остеоинтегративной способности таких гелей, основанных на коллагене, содержащем гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости, направлена настоящая экспериментальная работа.

Цель. Доклиническая оценка на экспериментальных моделях новой композиции остеоинтегративного геля на основе коллагена, синтетического гидроксиапатита и с введением в его состав неколлагеновых белков кости.

Задачи:

1. Оценить динамику заживления костной раны челюсти при использовании коллагенового геля с гидроксиапатитом и неколлагеновыми белками кости в эксперименте на молодых половозрелых крысах.

2. Изучить особенности заживления костной раны челюсти при использовании коллагенового геля с гидроксиапатитом и неколлагеновыми белками кости в эксперименте на «старых» крысах.

3. Определить особенности заживления костной раны челюсти при использовании коллагенового геля с гидроксиапатитом и неколлагеновыми белками кости в эксперименте на «старых» крысах в условиях иммунодефицитного состояния.

4. Изучить характер заживления костного дефекта в челюсти при его заполнении коллагеновым гелем с гидроксиапатитом и неколлагеновыми белками кости в эксперименте на собаках.

5. Дать оценку применения коллагенового геля с гидроксиапатитом и неколлагеновыми белками кости в сочетании с мембраной «Пародонкол» для ускорения заполнения костной раны челюсти в эксперименте на собаках.

Научная новизна

Научной новизной являются данные о том, что введение в костную рану гелевой композиции коллаген/гидроксиапатит/неколлагеновые белки кости (КГ/ГАП/НБК) приводит к сдвигу фаз костной регенерации на более ранние сроки и способствует ускорению заживления дефекта ветви нижней челюсти. Впервые показано, что ускорение репарации костной ткани при введении в рану остеопластического коллагенового геля с НБК проявляется в более раннем заполнении дефекта костными балочками на фоне активной сосудистой реакции и перестройки с участием остеокластов. Регенерация кости нижней челюсти у «старых» крыс с нормальным иммунитетом идет медленнее, чем у молодых животных. Еще больше отстают темпы регенерации кости у старых животных с иммунодефицитным состоянием. Введение этим животным в костную рану геля, содержащего НБК, приводит к сокращению объема деструктивных изменений и увеличению количества сосудов, врастающих в зону дефекта. Однако полной нормализации репаративного процесса не происходит. Новыми являются данные о том, что сочетанное применение мембраны «Пародонкол» и коллагенового геля, содержащего ГАП и НБК, в области экспериментально воспроизведенных костных дефектов на альвеолярном отростке собак, приводило к ускорению заживления костной раны благодаря построению костного вещества и его оссификации.

Практическая значимость

Разработан и экспериментально апробирован на модели костной раны челюсти крыс и собак состав остеоинтегративного геля на основе коллагена, содержащего синтетический гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости. При разработке новых композиций остеопластических гелей для стоматологии и челюстно-лицевой хирургии обоснована необходимость их испытания на экспериментальных моделях костного дефекта челюсти животных с нормальным и сниженным иммунитетом.

Применять коллагеновый гель нового состава с неколлагеновыми белками кости целесообразно в сочетании с мембраной для направленной регенерации костной ткани, которая способствует восстановлению костного дефекта. Рекомендуется проведение клинической апробации коллагенового геля, содержащего синтетический гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости геля в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. Соотношение компонентов геля, источники их получения, консистентность и метод стерилизации следует уточнить в соответствии с имеющимся законодательством и условиями применения в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ускорение репарации костной ткани при введении в рану челюсти молодых крыс коллагенового геля содержащего гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости проявляется в более раннем заполнении дефекта анастомозирующими новообразованными костными балочками на фоне неоваскулогенеза, активной сосудистой реакции и явлениями перестройки с участием остеокластов. В результате регенерации и перестройки новообразованная костная ткань через 90 сут после нанесения травмы теряет границу с окружающей костной тканью.

2. Регенерация нижней челюсти у «старых» крыс идет медленнее, чем у молодых животных. Значительно отстают темпы регенерации кости у старых животных с иммунодефицитным состоянием, которым вводили в костную рану коллагеновый гель, содержащий гидроксиапатит, но без неколлагеновых белков кости. Особенностью регенерации кости у животных с иммунодефицитом является развитие деструктивных процессов и ослабление остеобластической реакции на фоне снижения интенсивности ангиогенеза.

3. У животных с иммунодефицитным состоянием, которым в костную рану челюсти вводили коллагеновый гель, содержащий гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости, объем деструктивных изменений сокращается, и возрастает количество сосудов, врастающих в зону дефекта.

4. Применение мембраны «Пародонкол» на основе коллагена и гидроксиапатита способствует осуществлению костно-регенераторного процесса в дефектах альвеолярных отростков собак. Гелевая композиция на основе коллагена и гидроксиапатита, введенная в костные дефекты, оссифицируется, построение костного регенерата в ее присутствии протекает более активно. Сочетанное применение мембраны «Пародонкол» и коллагенового геля, содержащего гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости, в область экспериментально воспроизведенных костных дефектов приводит к оптимальному эффекту, который выражается в ускорении заживления костной раны благодаря построению костного вещества и его оссификации.

Апробация работы

Основные положения и результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на III Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» 07.02.06 г.; на совместном совещании сотрудников кафедры госпитальной терапевтической стоматологии и кафедры патофизиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава 27.06.07 г.

Личное участие соискателя в разработке проблемы

Все исследования по теме диссертации выполнены соискателем лично или при его непосредственном участии.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в дальнейшую научную работу на кафедре госпитальной терапевтической стоматологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава, а также в учебный процесс и научную работу кафедры патологического физиологии стоматологического факультета ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 4 научные работы, в том числе 1 работа в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста. Состоит из введения обзора литературы и глав «Материалы и методы исследования», «Собственные результаты», обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, состоящего из 205 источников, из них 76 отечественных и 129 иностранных. Диссертация иллюстрирована 75 рис.

2. Содержание работы

Материалы и методы

Решение основных задач работы, которые заключались в разработке остеопластического геля, состоящего из коллагена, гидроксиапатита и неколлагеновых белков кости (КГ/ГАП/НБК), способствующего заживлению костного дефекта челюстей, проводилось в эксперименте на крысах и собаках.

Выполнено 2 серии опытов на 54 крысах.

В первой серии были использованы молодые белые лабораторные крысы линии Вистар (24 особи) массой 180-220 г, которых поровну разделили на 2 группы: контрольную и опытную. Животным обеих групп в области угла ветви нижней челюсти под гексеналовым наркозом создавали сквозной дефект твердосплавным бором №3 на малых оборотах. В дефект челюсти крыс 1-й группы (контрольная группа) гель вводили гель КГ/ГАП без НБК. Во 2-й группе (опыт) в костный дефект вводили основную композицию геля - КГ/ГАП/НБК. Во время операции гель из шприца через толстую иглу вводили в дефект ветви челюсти и для предотвращения его вытекания закрывали с обеих сторон тонкими коллагеновыми мембранами, которые применяются для изготовления остеопластического материала «Пародонкол». Животных выводили из опыта в сроки 15,30,60 и 90 сут введением избыточной дозы гексенала. Челюсти выделяли, фиксировали в 10% нейтральном формалине и после общепринятой гистологической обработки заливали в парафин. Срезы толщиной 7-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали в световом микроскопе.

Во второй серии были использованы крысы в возрасте около 11 - 12 мес, массой 300-350 грамм. В этом возрасте крысы практически не растут, их можно отнести к «старой» популяции животных. Экспериментальные животные 2-й серии опытов (30 крыс Вистар) были разделены на 3 равные группы по 10 особей в каждой: 1-я группа - животные с нормальным иммунным статусом (контроль), 2-я и 3-я группы - с иммунодефицитным состоянием (ИДС), вызванным введением антиметаболита циклофосфана (Мустафаев Муслим Ш., Гемонов В.В., Воложин А.И.,1999).

Умеренную степень ИДС воспроизводили во 2-й и 3-й группах второй серии опытов посредством парентерального введения антиметаболита циклофосфана в дозе 25 мг/кг на инъекцию. Препарат разводили на физиологическом растворе и вводили крысам под кожу бедра по 0,5 мл. Cначала по инъекции двое суток подряд, затем, для поддержания ИДС, циклофосфан вводили в той же дозе (25 мг/кг, однократно) с периодичностью 10 сут. Оперативное вмешательство проводили на 10-й день после начала введения циклофосфана, когда у животных развилось иммунодефицитное состояние.

Животным всех групп в области угла ветви нижней челюсти под гексеналовым наркозом создавали сквозной дефект твердосплавным бором №3. В дефект челюсти крыс 1-й группы гель не вводили. В костный дефект крыс 2-й группы вводили гель КГ/ГАП без НБК. В 3-й группе в костный дефект вводили основную композицию геля - КГ/ГАП/НБК. Таким образом, нами оценивалось влияние НБК в составе геля на регенерацию костной ткани у животных в условиях иммунодефицитного состояния.

Методика выделения морфогенетических НБК заключалась в следующем. Диафизы трубчатых костей свиней освобождали от параоссальных тканей и измельчали. Далее, в результате последовательного применения стандартных процедур: декальцинации, диссоциативного экстрагирования, высаливания (К.С.Десятниченко, 1997), получали раствор НБК и гранулы внеклеточного матрикса. Коммерческий 2%-ный коллагеновый гель (КГ) помещали в диализный мешок и освобождали от остатка уксусной кислоты посредством диализа против дистиллированной воды с трехкратной ее сменой в течение 24 ч не реже, чем через 4 ч. К диализированному коллагену добавляли раствор неколлагеновых белков костной ткани, перемешивали до получения гомогенного гелевого раствора.

В полученный гель небольшими порциями при постоянном перемешивании вносили ГИДРОКСИАПОЛ ГАП 85 уд (НПО ЗАО «Полистом») в весовой доле 12 - 15 %. Перемешиванием добивались максимальной гомогенности, после чего помещали в вакуум-эксикатор, который эвакуировали с помощью мембранного насоса-компрессора в течение 1 ч. Деаэрированный материал фасовали в одноразовые шприцы (объемом 2 мл), которые запаивали в двухслойные полиэтиленовые мешки и стерилизовали гамма-излучением.

Во время операции на животных гель из шприца через толстую иглу вводили в дефект ветви челюсти и для предотвращения его вытекания закрывали с обеих сторон очень тонкими коллагеновыми мембранами, которые применяются для изготовления остеопластического материала «Пародонкол». Животных выводили из опыта избыточной дозой гексенала в сроки 15 и 30 сут после операции. Челюсти выделяли, фиксировали в 10% нейтральном формалине и после общепринятой гистологической обработки заливали в парафин. Срезы толщиной 7-8 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и рассматривали в световом микроскопе.

Опыты на собаках

В опыт были взяты 4 беспородных собаки обоего пола в возрасте 1,5 - 3 года (возраст определяли по состоянию зубов) массой от 8 до 11 кг. Под каллипсоловым наркозом с предварительной премедикацией элениумом животное было фиксировано на спине в станке для хирургического вмешательства. Последовательно, вначале на верхней, а затем на нижней челюсти острым одноразовым скальпелем делали разрез и отсепаровывали прикрепленную десну в области больших и малых клыков. Затем, на альвеолярной кости в области проекции корней этих зубов с помощью фрезы диаметром 3 мм были созданы дефекты глубиной около 2-3 мм. Использована бормашина со скоростью вращения не более 400 об/мин с постоянным орошением физиологическим раствором для предотвращения перегревания кости. Всего на челюстях одной собаки было сделано 12 дефектов, по три на каждой стороне верхней и нижней челюстей.

1-я группа - контроль. Три дефекта на альвеолярной кости не были заполнены испытуемыми материалами, костная рана заживала под сгустком крови

2-я группа - Пародонкол. Три дефекта закрыты мембраной «Пародонкол» производства ЗАО НПО «Полистом». Мембрана перекрывала края дефекта на 2 мм

3-я группа - Коллагеновый гель с гидроксиапатитом. Три дефекта были заполнены коллагеновым гелем, содержащим ГАП в виде порошка (1 : 1 по весу) и неколлагеновые костные белки. Густая композиция геля позволяла ему достаточно прочно удерживаться в дефекте.

(4-я группа - основная) Три дефекта заполнены коллагеновым гелем, содержащим ГАП и неколлагеновые белки кости. Сверху наложена мембрана «Пародонкол».

Животные были выведены из опыта через 2 и 4 мес после операции внутривенным введением избыточной дозы гексенала. Эти сроки достаточны для реализации регенераторного потенциала поврежденной костной ткани и изучения заживления костного дефекта под влиянием гелевых композиций. Челюсти выделялись, распиливались на фрагменты, соответственно четырем группам, фиксировались в 10% нейтральном формалине, рентгенологически уточняли локализацию дефекта. Материал деминерализовали в трилоне Б. Дальнейшая обработка, приготовление и окраска препаратов гематоксилин-эозином проводилась традиционно.

Результаты исследования

В серии опытов с молодыми крысами получены следующие результаты.

У контрольных интактных молодых крыс (1-я группа) дефект челюсти, у которых был заполнен коллагеновым гелем с ГАП без НБК, выделено 3 фазы заживления костной раны.

В первую фазу через 15 сут после операции в зоне травмы сохранялись остаточные явления воспалительной реакции с диффузным распределением лейкоцитов. Начальные этапы восстановительного процесса выражались в костеобразовании на границе сохранившихся структур. Остальная часть дефекта в этот период заполнена соединительной тканью. Большое количество расположенных здесь сосудов микроциркуляторного русла обеспечивает проникновение периваскулярных клеток, способных дифференцироваться в клетки остеобластического дифферона (Рис.1).



Рис.1. Контроль. 15 сут после нанесения травмы. Начало регенерации костной ткани. Образование костных балочек (1) на границе с сохранившимися костными структурами (2). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 10.

Вторая фаза регенерации характеризуется активным процессом построения костной ткани в зоне дефекта, что происходит к 30-е сут опыта. В зоне дефекта костные балочки расположены на сохранившихся костных структурах и окружены остеобластами с резко базофильной цитоплазмой. Между балочками вновь образованной кости еще сохраняется рыхлая волокнистая соединительная ткань, богатая клеточными элементами и кровеносными сосудами (Рис.2). По всей зоне травмы видны расширенные и гиперемированные кровеносные сосуды. В целом, происходящие в этот срок изменения можно охарактеризовать как активную фазу регенерации.

Рис.2. Контроль. 30 сут после нанесения травмы. В межбалочковых промежутках вновь образованной кости располагались разнообразные клеточные элементы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 40.

Через 60 сут после нанесения травмы наступает 3-я фаза репаративного процесса, когда морфологическая картина в зоне травмы, по сравнению с предыдущим сроком, существенно меняется. Новообразованная кость заполняет всю зону травмы анастомозирующими балочками, промежутки между которыми значительно меньше, чем на 30-е сут. Но в центре дефекта балочки располагались более редко, чем на периферии.

Тогда же уменьшилось содержание в межбалочковых промежутках кровеносных сосудов. По ходу балок новообразованной кости встречаются многоядерные остеокласты, лежащие в лакунах, что говорит о перестройке костной ткани одновременно с ее формированием. В этот период происходит активная перестройка новообразованной кости (Рис.3).

Рис.3. Контроль. 60 сут после нанесения травмы. Остеокласты (1), расположенные по ходу балочек новообразованной кости. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 40.

К 90-м сут дефект почти полностью заполнен полноценной новообразованной костной тканью со всеми признаками ее физиологической перестройки. Однако составные части такого регенерата еще имеют разную степень дифференциации. Между костными балочками новообразованной кости выявляются элементы волокнистой ткани, хотя костная ткань регенерата в основном представлена пластинчатой костью. Хорошо различима граница между новообразованной костью и костью сохранившейся после травмы (Рис.4).



Рис.4. Контроль. 90 сут после нанесения травмы. Граница (1) между новообразованной костью (2) и костью, сохранившейся после травмы (3). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 40.

Во 2-й группе крыс введение в костную рану гелевой композиции с НБК не приводит к качественному изменению динамики репаративного процесса в ветви челюсти, сохраняются те же фазы регенерации.

В 1-ю фазу регенерации, на 15-е сут в основной группе по сравнению с контрольной преобладает процесс новообразования костной ткани над рыхлой соединительной тканью, то есть ускоряется наступление 2-й фазы регенерации. Об этом также свидетельствует наличие крупных остеобластов вокруг новообразованных костных балочек (Рис.5).

Рис.5. Опыт. 15 сут после нанесения травмы. Вокруг новообразованных костных балочек (1) видны крупные остеобласты (2). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 40.

На 30-е сут вся зона травмы заполнена анастомозирующими между собой новообразованными костными балочками, имеющими мазаичную картину. По сравнению с предыдущим сроком (15 сут), балочки становились крупнее, в их основном веществе располагались остеоциты. В составе регенерата новообразованная кость явно преобладала над остальными тканевыми компонентами, что приближает эту картину к той, которая получена на 60-е сут в контрольной серии опытов (Рис.6). По сравнению с предыдущей группой здесь происходит усиление неоваскулогенеза и активизация пролиферативных процессов.

Рис.6. Опыт. 30 сут после нанесения травмы. Мозаичная картина новообразованных костных балочек. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 10.

В 3-ю фазу регенерации на 60-е сут после нанесения травмы вся зона травмы заполнена новообразованной костью, представленной анастомозирующими костными балочками. Балочки становятся шире, а их окраска все больше напоминает окраску сохранившихся участков кости, что говорит о продолжающейся минерализации вновь образованной костной ткани (Рис.7). костный рана челюсть регенерация

Через 90 сут опыта нарастали процессы минерализации вновь образованных костных структур, дальнейшая перестройка и усложнение конфигурации костных балочек, которые по окраске и строению не отличались от сохранившейся костной ткани. Граница между ними становилась практически неразличимой (Рис.8). В некоторых балочках встречались отдельные остеокласты, участвующие в процессах перестройки. Содержание кровеносных сосудов в зоне регенерата было снижено по сравнению с предыдущим сроком наблюдения.



Рис.7. Опыт. 60 сут после нанесения травмы. Зона травмы заполнена новообразованной костной тканью. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 10.

По периферии дефекта вновь образованные костные балочки спаяны с сохранившейся здесь пластинчатой костной тканью.

Рис.8. Опыт. 90 сут после нанесения травмы. Костный регенерат из пластинчатой кости, заполняющий зону травмы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 10. Об. 10.

Таким образом, новая композиция геля на основе коллагена, гидроксиапатита и неколлагеновых белков кости способствует заживлению искусственно созданного дефекта ветви нижней челюсти крыс. В осуществлении стимулирующего эффекта геля важная роль принадлежит трем механизмам: 1- активизации сосудистой реакции, которая обеспечивает транспорт остеогенных клеток-предшественников в зону травмы и их дифференцировку в зрелые остеобласты, 2- реализации потенциала местных остеопрогениторных клеток в зоне травмы, 3 - фиксации собственных факторов роста на коллагене и гидроксиапатите.

На втором этапе работы была изучена регенерация костной раны на ветви челюсти «старых» животных, в том числе в условиях иммунодефицитного состояния.

У животных данной серии опытов (контроль) на 15-е сут опыта видно образование молодых костных балочек в области зоны травмы, а промежутки между костными балочками заполнены рыхлой тканью, богатой разнообразными клеточными элементами (Рис.9).

Рис. 9. Контроль. 15 сут после нанесения травмы. Животное с нормальным иммунным статусом. Образование молодых костных балочек в области зоны травмы. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. 10, об. 10.

Искусственно созданный дефект челюсти, заживающий под кровяным сгустком, то есть без гелевой субстанции полностью не заполнялся регенерирующей костной тканью и в течение 30 сут. Регенерация у «старых» животных идет медленнее, чем у молодых крыс (Рис 10).



Рис.10. Контроль. 30 сут после нанесения травмы. Животное с нормальным иммунным статусом. Новообразованные костные балочки полностью не перекрывают зону травмы. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. 10, об. 10.

Значительно отстают темпы регенерации кости у животных 2-й группы того же возраста с иммунодефицитным состоянием, которым вводили в костную рану коллагеновый гель, содержащий только ГАП.

На 15-е сут обнаружены проявления некроза участков костной ткани в зоне травмы, а также изменения тинкториальных свойств сохранившейся кости. В некоторых участках наблюдалась резкая базофилия, видно также скопление лейкоцитов в центре зоны травмы, что говорит о сохраняющихся явлениях воспаления (Рис 11).

Рис.11. ИДС + ГК/ГАП. 15 сут после нанесения травмы. Животное с иммунодефицитом. Резкие проявления некроза участков костной ткани в зоне травмы. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. 10, об. 10.

На 30-е сут в этой группе сохраняются деструктивные процессы и ослабленная остеобластическая реакция на фоне снижения интенсивности развития сосудов. Нередко видны многоядерные остеокласты в участках кости, расположенных вблизи зоны воспаления (Рис.12). В данной группе под влиянием геля на ряде препаратов видны также новообразованные костные балочки, связанные с сохранившейся костной тканью по периферии дефекта, а также гиперемированные сосуды между костными балочками новообразованной кости.

Рис.12. ИДС + ГК/ГАП. 30 сут после нанесения травмы. Животное с иммунодефицитом. Многоядерные остеокласты в участках кости, расположенных вблизи зоны воспаления. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. 10, об. 40.

У животных с иммунодефицитным состоянием, которым в костную рану вводили гель, содержащий помимо ГАП также и НБК, объем деструктивных изменений уже на 15-е сут сокращался, и возрастало количество сосудов, врастающих в зону дефекта. На препаратах видны новообразованные костные балочки, растущие от периферии к центру (Рис.13). Вокруг сосудов в основном происходило образование костной ткани, благодаря активации клеточной реакции, однако полной нормализации репаративного процесса все же не происходило. Эффективность применения геля, содержащего коллаген, ГАП и НБК обусловлена активацией ангиогенеза, благодаря чему усиливается также и построение костной ткани.

Рис.13. ИДС+ГК/ГАП/НБК. 15 сут после нанесения травмы. Животное с иммунодефицитом и введением геля с НБК. Новообразованные костные балочки, растущие от периферии к центру дефекта. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. 10, об. 40.

На 30-е сут видна новообразованная костная ткань в виде переплетающихся балочек по ходу которых имеются остеокласты, которые свидетельствуют о перестройке новообразованной костной ткани. Однако темпы регенерации в этой группе с ИДС, несмотря на использование геля, все же несколько отставали от группы контроля (Рис.14).

Таким образом, введение в состав остеоинтегративного геля неколлагеновых белков кости способствует активации регенерации костной ткани при иммунодефицитном состоянии, вызванном у «старых» животных введением антиметаболита циклофосфана.

Рис.14. ИДС+ГК/ГАП/НБК. 30 сут после нанесения травмы. Животное с иммунодефицитом и введением геля с НБК.

Новообразованная костная ткань в виде переплетающихся балочек. По ходу балочек видны остеокласты. Окраска гематоксилином и эозином. Ок. 10, об. 10.

Исследование на собаках.

В дефектах челюсти, которые не были закрыты мембраной или в них не вводили композиции геля, регенерация происходила очень слабо в связи с тем, что дефект заполнялся рыхлой соединительной тканью, препятствующей репаративному процессу.

У подопытных животных с мембраной «Пародонкол» без ГАП-геля и НБК, то есть во 2-й группе, через 2 мес после травмы темпы регенерации были умеренные. После начала опыта виден участок резкого утолщения и гомогенизации мембраны (Рис.15).

Рис.15. Мембрана «Пародонкол». 2 мес после начала опыта. Участок резкого утолщения и гомогенизации мембраны. Окр. гематоксилин-эозином. х 160.

Через 4 мес процесс разволокнения мембраны нарастает на фоне усиления регенерации кости (Рис.16).

В 3-й группе введение ГАП и НБК, но без применения «Пародонкола» изменило ход репаративной регенерации челюсти.

Так, через 2 мес опыта, происходило отложение остеоида на периферии депозита композиции, содержащей гранулы ГАП и НБК (Рис.17).



Рис.16. Мембрана «Пародонкол». 4 мес после начала опыта. К мембране (слева) подлежат регенерирующие костные балочки. Окр. гематоксилин-эозином. х 160.

Рис.17. Композиция КГ/НБК. 2 мес опыта. Отложение остеоида на периферии депозита композиции. Окр. гематоксилин-эозином. х 200.

Через 4 мес процесс оссификации депозита прогрессирует, зона остеоидного вещества продвигается к центру депозита. Характерно, что депозиты композиции, располагавшиеся вне кости, оссификации не подвергались. То есть для оссификации депозита необходим контакт с костной тканью.

Рис.18. Композиция КГ/НБК. 4 мес опыта.

Процесс оссификации депозита прогрессирует, зона остеоидного вещества продвигается к центру депозита. Окр. гематоксилин-эозином. х 250.

В 4-й группе совместное применение мембраны «Пародонкол» и композиции, содержащей ГАП и НБК, привело к оптимальному результату, особенно это выявлялось на 4-й мес после нанесения травмы, когда происходит замуровывание микрофрагментов в компактизирующуюся новообразованную костную ткань (Рис.19).

Рис.19. «Пародонкол» + КГ/НБК». 4 мес опыта. Остатки оссифицированных депозитов композиции (по центру) замурованы в новообразованную костную ткань. Окр. гематоксилин-эозином. х 160.

Таким образом, применение мембраны «Пародонкол» на основе коллагена и гидроксиапатита способствует осуществлению костно-регенераторного процесса в дефектах альвеолярных отростков. Гелевая композиция на основе коллагена и гидроксиапатита, введенная в костные дефекты, оссифицируется. Построение костного регенерата в ее присутствии протекает более активно. Сочетанное применение мембраны «Пародонкол» и коллагенового геля, содержащего ГАП и неколлагеновые белки кости в область экспериментально воспроизведенных костных дефектов вызвало эффект, выражающийся в ускорении заживления костной раны благодаря построению костного вещества и его оссификации.

Выводы

1. Ускорение репарации костной ткани при введении в рану челюсти коллагенового геля, содержащего гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости, проявляется в более раннем заполнении дефекта анастомозирующими новообразованными костными балочками на фоне неоваскулогенеза, активной сосудистой реакции и явлениями перестройки с участием остеокластов. В результате регенерации и перестройки новообразованная костная ткань через 90 сут после нанесения травмы теряет границу с окружающей костной тканью.

2. Регенерация костной ткани нижней челюсти у «старых» крыс идет медленнее, чем у молодых животных. Значительно отстают темпы регенерации кости у «старых» животных с иммунодефицитным состоянием, которым вводили в костную рану коллагеновый гель, содержащий гидроксиапатит, но без неколлагеновых белков кости. Особенностью регенерации кости у животных с иммунодефицитом является развитие деструктивных процессов и ослабление остеобластической реакции на фоне снижения интенсивности ангиогенеза.

3. У животных с иммунодефицитным состоянием, которым в костную рану челюсти вводили коллагеновый гель, содержащий гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости, объем деструктивных изменений сокращается, и возрастает количество сосудов, врастающих в зону дефекта. Вокруг кровеносных сосудов активно формируется костная ткань, однако полной нормализации репаративного процесса не происходит.

4. Применение мембраны «Пародонкол» на основе коллагена и гидроксиапатита способствует осуществлению костно-регенераторного процесса в дефектах альвеолярных отростков собак. Гелевая композиция на основе коллагена и гидроксиапатита, введенная в костные дефекты, оссифицируется, построение костного регенерата в ее присутствии протекает более активно. Сочетанное применение мембраны «Пародонкол» и коллагенового геля, содержащего гидроксиапатит и неколлагеновые белки кости, в область экспериментально воспроизведенных костных дефектов приводит к оптимальному эффекту, который выражается в ускорении заживления костной раны благодаря построению костного вещества и его оссификации.

Практические рекомендации

1. При разработке новых композиций остеопластических гелей для стоматологии и челюстно-лицевой хирургии рекомендуется их испытание на экспериментальных моделях костной травмы челюсти крыс с нормальным и сниженным иммунитетом.

2. Испытания остеопластического геля рекомендуется также проводить на другой модели - заполнении искусственного дефекта альвеолярного отростка челюсти собак, строение костной ткани у которых близко к строению кости человека. На данной модели возможно комбинированное применение геля с мембраной для направленной регенерации костной ткани.

3. В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии рекомендуется проведение клинической апробации коллагенового геля, содержащего синтетический гидроксиапатит (в виде порошка и гранул) и неколлагеновые белки кости. Соотношение компонентов геля, источники их получения и метод стерилизации уточняется в соответствии с законодательством и условиями применения в клинической практике.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Воложин А.И, Коротеев А.А., Гемонов В.В, Десятниченко К.С., Курдюмов С.Г. Влияние остеопластического геля с морфогенетическими белками на регенерацию костной ткани в эксперименте.// Дентал-Форум.-2006.- №1.- С.19-26.

2. Коротеев А.А. Влияние остеопластического геля с неколлагеновыми морфогенетическими белками на регенерацию костной ткани в эксперименте. //Труды XXVIII Итоговой конференции общества молодых ученых МГМСУ/МГМСУ. - Москва, 2006 - стр. 167.

3. Коротеев А.А., Гемонов В.В, Десятниченко К.С. Влияние остеопластического геля с неколлагеновыми белками кости на регенерацию костной ткани у «старых» крыс с иммунодефицитным состоянием.// Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии». - Москва, 2006.- С.77-78.

4. Воложин А.И, Гемонов В.В, Десятниченко К.С., Коротеев А.А., Курдюмов С.Г. Экспериментальное обоснование эффективности применения остеопластического геля с морфогенетическими белками для оптимизации заживления костной ткани челюсти.// Российский стоматологический журнал.-2006.- № 6.- С.4-7.

Размещено на Allbest.ru

...