Методика флюориметрии плазмы для измерения объема циркулирующей крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МЕТОДИКА ФЛЮОРИМЕТРИИ ПЛАЗМЫ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ОБЪЕМА ЦИРКУЛИРУЮЩЕЙ КРОВИ

14.00.27 - хирургия

Кочанов Дмитрий Александрович

Москва 2008

1. Общая характеристика работы

Актуальность. В связи с расширением объема и тяжести оперативных вмешательств, большой частотой заболеваний, сопровождающихся кровопотерей или перемещением жидкости организма в третье пространство, сохраняют большую актуальность диагностика и лечение разнообразных изменений волемии (Горбашко А.И., 1982; Горобец Е.С., 2001; Абакумов М.М., 2002; Бахалова Г.Е., 2003; Fujita Y, Yamamoto T, 2004; Maarek J.M., 2005; Belin de Chantemиle E., Gauquelin-Koch G., 2006; Feldschuh J., 2007; Hoff R.G., 2008). Это связано с тем, что развивающееся в результате этих изменений несоответствие между объемом циркулирующей крови и емкостью сосудистого русла приводит к нарушению тканевой перфузии, возникновению гипоксии, и, как следствие, расстройству функционирования органов и систем.

Известно, что уменьшение объема крови на 30-50% от исходного приводит к гибели, поскольку такой объем соответствует показателям «порога смерти»: глобулярный объем 10 мл/кг и объем крови 58 мл/кг (Воробьев А.И., Городецкий В.М., Шулутко Е.М., Васильев С.А., 2001; Левченко Л.Б., 2002; Rehm M., Orth V., 2000; Drummond J.C., 2001; Wadsworth G.R. 2002).

Восполняя дефицит циркулирующей крови, важно знать его к началу лечения и контролировать в процессе, чтобы «вовремя остановиться». При этом, ежедневно вмешиваясь в волемию больных, врачи, как правило, не имеют средств для ее измерения, часто опираясь на ложные представления о ее реальной величине. Так, например, до настоящего времени в большинстве случаев определяют степень гиповолемии по клиническим, инструментальным признакам, показателям гемограммы. Хотя установлено, что в большинстве случаев имеется значительное несоответствие между состоянием наполненности сосудистого русла, особенно при быстром его изменении, и этими показателями. На основании указанных выше данных удается составить только самое приблизительное представление о колебаниях объема циркулирующей крови. (Штыголь С.Ю., Гришина Т.Р., 2001; Glick Y.A., Wilson L.D., 2002; Dworkin H.J., 2007).

К настоящему времени предложены десятки принципов и сотни вариантов оценки волемии. Среди них наиболее приемлемыми являются индикаторные способы, которые позволяют измерить объем непосредственно компонентов крови (плазменного и глобулярного), что дает возможность истинно установить, сколько ее находится в кровеносном русле (Лекманов А.У., Гольдина О.А., 2001; Thomas E., Jones G., 2000; Mitra S., 2003; Leung T.S., 2004; Dworkin H.J., Premo M., Dees S., 2007). Подобные методики либо не обеспечивают достаточной точности измерений (использование в качестве меток Т-1824, полиглюкина, крахмала и др.), либо при ее наличии сложны, трудоемки и дорогостоящи, что требует особых условий их использования (радиоизотопная методика). Кроме того, они имеют ограничения в применении, обусловленные отрицательными свойствами самих индикаторов (Киселев В.В., 1998; Ермолов А.С., 2005; Rehm M., Haller M., Orth V., 2001; Persson J., Grдnde P.O., 2005; Salinas F.V., 2006; Engvall C., Ryding E., 2008).

Таким образом, на сегодняшний день нет быстрой, простой, точной и дешевой методики измерения объема циркулирующей крови. В то же время, рост технической оснащенности медицины позволяет решать многие существующие вопросы более эффективно. Один из подходов - люминесцентный метод. Важной особенностью его является возможность наблюдения свечения при очень малой концентрации (<10^-4 кг/м³) и малом количестве (~10^-13 кг) вещества (Orth V.H., Rehm M., 1998; Thomas E., 2000). Такая чрезвычайная чувствительность люминесцентного анализа побудила нас к разработке новой методики определения объема циркулирующей крови, основанной на измерении вторичной флюоресценции плазмы.

Цель исследования. Создать и применить флюоресцентную методику для измерения объема циркулирующей крови с помощью динатриевой соли флюоресцеина (флюрената).

Задачи исследования:

- Изучить фармакокинетику флюрената для разработки методики определения объема циркулирующей крови на основе флюориметрии плазмы.

- Изучить возможность спектрального измерения объема циркулирующей крови путем оценки точности и воспроизводимости результатов.

- Создать графическую флюориметрию, как экспресс-способ измерения объема циркулирующей крови.

- Разработать способ расчетной флюориметрии для однократного измерения объема циркулирующей крови.

- Разработать способ определения объема крови в динамике на основе расчетной флюориметрии.

Научная новизна

Экспериментально и клинически обоснован спектральный анализ вторичной флюоресценции плазмы после внутривенного введения флюрената для расчета объема циркулирующей крови.

Изучена фармакокинетика флюрената, используемого в качестве флюоресцентной метки и построена теория, происходящих при этом процессов.

Разработаны способы расчетной и графической флюориметрии для измерения объема циркулирующей крови.

Практическая значимость работы

Разработанная методика измерения объема циркулирующей крови характеризуется наиболее высокой точностью получаемых результатов среди прочих подобных методик, основанных на методе разведения.

С помощью разработанной методики можно легко и быстро осуществить предварительное и последующее динамическое определение объема крови при любой патологии, требующей внутривенные вливания с восполняющей или дезинтоксикационной целью.

Предлагаемая методика позволяет с большой точностью контролируемо устранять различные варианты дисволемии.

Грамотное использование трансфузионных сред, основанное на динамическом измерении объема крови больных, позволяет улучшить результаты лечения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Методика флюориметрии плазмы позволяет с высокой точностью измерить объем циркулирующей крови.

2. Графическая флюориметрия является экспресс-методикой измерения объема внутрисосудистой жидкости.

3. Однократное использование методики флюориметрии позволяет выявить пациентов с нормо- и дисволемией.

4. Динамическая флюориметрия позволяет четко контролировать процесс инфузионной терапии, оценивать ее эффективность.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанная методика флюориметрии плазмы для измерения объема циркулирующей крови используется в практической деятельности хирургического, онкологических, реанимационного отделений ГКБ № 40 г. Москвы, в научно-исследовательской работе лаборатории клинической и экспериментальной хирургии НИМСИ МГМСУ.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

научной конференции «От науки - к практике. Проблемы организации научных исследований в России», МГМСУ, г. Москва, 5 декабря 2006 г.;

VII научно-практической конференции НИМСИ МГМСУ «От науки к практике». МГМСУ, г. Москва, 13 декабря 2007 г.;

межкафедральной научно-практической конференции кафедр госпитальной хирургии, оперативной хирургии, медицины катастроф, реаниматологии и анестезиологии МГМСУ, лаборатории клинической и экспериментальной хирургии НИМСИ МГМСУ, г. Москва, 19 января 2008 г.

Публикации по теме диссертации опубликованы в печати 6 научных работ.

2. Содержание работы

Материалы и методы исследования

Проведенная работа включила лабораторные и клинические исследования. Лабораторный этап являлся предварительным и составил 1510 измерений флюоресценции плазмы, мочи, физиологического раствора и дистиллированной воды. В основу клинической работы положен анализ результатов обследования 200 пациентов, наблюдаемых нами в хирургическом, онкологических и реанимационном отделениях ГКБ №40 за период с 2005 по 2008 гг., которым суммарно выполнено 1579 измерений вторичной флюоресценции плазмы и мочи.

Характеристика клинического материала

Все исследованные (200 человек) были разделены на 3 группы. На примере первой группы (40 практически здоровых и больных пациентов) разрабатывалась и проверялась пригодность методики. Второй группе пациентов (67 человек) объем крови измерялся только однократно, третьей (93 человека) - объем крови определяли в динамике. Пациентам второй и третьей групп, с патологией, приведшей к различным вариантам волемии непосредственно или на фоне лечения, производилось измерение объема крови для определения необходимости проведения инфузионной коррекции и ее адекватности. Разделение обследуемых пациентов на группы отражает последовательность разработки предложенной методики измерения объема циркулирующей крови.

Среди всех пациентов мужчины доминировали - 114 человек (57%), женщин - 86 человек (43%). Больные пожилого и старого возраста составили 12%, лица функционально активного возраста - 88% (табл. № 1.).

Таблица № 1. Распределение больных по возрасту и полу.

Возраст	1-ая группа	2-ая группа	3-ая группа	Всего
	м	ж	м	ж	м	ж
Молодой (до 45 лет)	10	10	18	7	24	10	79
Средний (45-59 лет)	9	4	19	14	23	28	97
Пожилой (60-74 лет)	3	4	3	5	4	2	21
Старый (75 лет и выше)	0	0	1	0	0	2	3
Всего	22	18	41	26	51	42	200

Можно выделить три патологии, приведшие к дисволемии, которые в нашем исследовании встречались наиболее часто: желудочно-кишечное кровотечение из верхних отделов пищеварительного тракта (31,9%), острый панкреатит (23,1%) и острая кишечная непроходимость (18,8%). Среди других причин мы отметили: желудочно-кишечное кровотечение из нижних отделов пищеварительного тракта (8,1%); перитонит (6,2%); рак желудка, по поводу которого пациенты были радикально оперированы в плановом порядке (5,6%); рак толстой кишки, осложненный распадом и оперированный паллиативно по экстренным показаниям (5%); внутрибрюшное кровотечение, обусловленное повреждением селезенки вследствие тупой травмы живота (1,3%). Из всех больных 83% изучались в послеоперационном периоде.

В работе использована классификация волемии, согласно которой различают гипо-, нормо- и гиперволемию. Независимо от причин и характера гиповолемии она всегда имеет главную характеристику - объем дефицита крови. В связи с этим она делится на (Бисенков Л.Н. 2000): легкую - дефицит объема циркулирующей крови 10-20%, дефицит глобулярного объема до 30% (шока нет); умеренную - дефицит объема циркулирующей крови 21-30%, дефицит глобулярного объема 30-45% (шок развивается при длительной гиповолемии); тяжелую - дефицит объема циркулирующей крови 31-40%, дефицит глобулярного объема 46-60% (шок); крайне тяжелую - дефицит объема циркулирующей крови > 40%, дефицит глобулярного объема > 60% (шок, терминальное состояние). Независимо от происхождения, гиперволемия классифицируется как легкая 105-110 % от должной величины, средняя 111-120%, и высокая свыше 120%.

Необходимые компоненты методики

Для измерения объема крови использовался один из триарилметановых (ксантеновых) красителей - флюоресцеин натрия (fluorescein sodium) - Флюренат (одобрен Фармакологическим комитетом МЗ СССР, регистрационный № 87/682/8, входит в 9 издание Фармакопеи СССР). Он хорошо растворим в воде, обладает очень высокой эмиссионной способностью, 95% поглощенного сине-фиолетового света (максимум абсорбции 480-500 нм) трансформируется в желто-зеленый свет флюоресценции (максимум эмиссионной кривой соответствует 525-530 нм). Флюренат отвечает требованиям, предъявляемым к веществам маркерам, и отличается дешевизной. Для проведения флюоресцентных исследований применялся 10% раствор флюрената, вводимый внутривенно в объеме 2 мл.

Для получения плазмы из образцов крови, забираемых после введения флюрената и его смешивания с объемом циркулирующей крови, использовалась центрифуга MULTI CENTRIFUGE CM 6M (Латвия).

Экспресс-определение показателей крови, прежде всего гематокрита, необходимое при каждом исследовании, производилось на полностью автоматизированном гематологическом анализаторе GRANIS-3 (Ysebaert, Франция) предназначенном для количественной оценки клеток крови в 32 мкл цельной крови.

Измерения интенсивности флюоресценции полученных путем центрифугирования растворов флюрената в плазме проводились на спектрометре LESA 7, который автоматически рассчитывает параметры флюоресценции и выдает информацию в виде графического изображения текущего спектра. Используемый спектрометр является эмиссионным (принцип действия приборов этого типа отличается тем, что в них образец после возбуждения сам является источником излучения).

Методика проведения однократного флюоресцентного исследования

Приготовление стандарта. Готовилось стандартное разведение флюрената в изотоническом растворе, из расчета 1 мл 10% раствора красителя на 24 мл изотонического раствора натрия хлорида. Этим достигается разведение в 25 раз: в 1 мл такого раствора содержится 4 мг красителя. Полученный раствор хранится в колбе с притертой пробкой.

При каждом исследовании объема циркулирующей крови готовился стандарт на плазме контрольного образца, которую получали из крови, взятой из вены больного до введения раствора флюрената в день исследования. Для этого брали 0,1 мл (с помощью микропипетки на 0,1 мл) стандартного раствора красителя, смешивали с 3,9 мл плазмы больного и получали разведение в 40 раз. Таким образом, в 1 мл раствора флюрената в плазме содержалось 0,1 мг сухого вещества красителя, т. е. получалось итоговое разведение в 1000 раз.

Техника получения исследуемого образца плазмы. Больных обследовали натощак в горизонтальном положении. Шприц-тюбик, содержащий антикоагулянт, подсоединялся к специальной венозной игле. Последняя вводилась в вену и продвигалась по ней на 2-3 см. Для пункции использовались вены локтевого сгиба или предплечья (возможно использование магистральных вен в случае катетеризации их). Забирали 4 мл крови и шприц-тюбик отсоединяли от иглы. Затем, используя ту же иглу, через специальный переходник сухим стерильным шприцем набирали 10 мл крови. Набранная кровь выливалась в пробирку для центрифугирования, содержащую 3 капли 5000 ED раствора гепарина (или 2 капли 10000 ЕД раствора гепарина), и осторожно тщательно перемешивалась (проба №1). Среди известных антикоагулянтов преимуществом обладает именно гепарин, так как он в меньшей степени вызывает сокращение эритроцитов.

Далее к игле, через тот же переходник, присоединяли шприц, наполненный 2,2 мл 10% раствора флюрената. Учитывая, что часть краски остается на стенках шприца, набиралось на 0,2 мл флюрената больше, так как опытным путем Афанасьева Э.А. и соавт. (1972) установили, что именно такой объем остается в шприце после введения растворов. Затем медленно вводили флюренат в венозное русло. После этого иглу извлекали из вены (рис. № 1).

Рисунок № 1. Схема методики флюориметрии.

Через 10 мин. (время полного смешивания препарата со всем объемом циркулирующей крови) от момента введения флюрената пунктировали вену противоположной руки. Шприцем забирали 5 мл крови, которая выливалась в пробирку для центрифугирования с 2-мя каплями 5000 ED раствора гепарина и осторожно перемешивалась, чтобы не получить гемолиза (проба №2). Затем, игла извлекалась из вены, место прокола придавливалось. Gregersen M.J. and Noble R.P. (1944, 1946) статистически доказали, что для определения объема циркулирующей плазмы достаточно забирать один образец крови, после периода смешивания ее с красителем. Авторы показали, что ошибка, возникающая от возможного неполного смешивания, имеет тенденцию к уравновешиванию ошибки, вводимой игнорированием потери краски с белком в течение периода смешивания.

Для подготовки к исследованию, введения красителя и забора крови требовалось около 20-30 мин.

Следующим этапом пробы №1 и №2 центрифугировались при 3000 об./мин. в течение 30 мин. (рекомендации Knouse, 1964), затем плазма сливалась в сухие пробирки. Далее образец плазмы до введения краски (№1) использовался для приготовления стандартного раствора (смешивали 0,1 мл стандартного раствора флюрената и 3,9 мл плазмы). Приготовленные образцы стандартной и исследуемой плазмы разливались поочередно в кювету и измерялась их флюоресценция на спектрометре, который автоматически выдает значения площадей под соответствующими спектральными кривыми стандарта () и исследуемого образца (S).

Проба крови из шприц-тюбика использовалась для определения венозного гематокритного числа (). Для поправки на отклонения для плазменно-гематокритового метода применяется коэффициент F_cells равный 0,91, который учитывает поправку на завышение результатов на 10% (Beling G., 1950; Кравчинский Б.Д., 1963; Римерман В.Н.,1968). Поэтому умножался на 0,91, превращаясь тем самым в гематокритное число тела ():

Расчет объема циркулирующей крови осуществляли с помощью формулы, выведенной исходя из концепции прямой зависимости интенсивности флюоресценции и площади под спектральной кривой флюоресценции от концентрации флюрената в исследуемом растворе:

.

Коэффициент (1600) в формуле является частным от известных данных - массы введенного больному флюрената и его концентрации в стандартном образце. Выражение в скобках представляет долю плазменного компонента в объеме крови, исходя из так называемого среднего гематокрита.

Методика проведения динамического флюоресцентного исследования

Для оказания адекватного инфузионного пособия однократного измерения объема циркулирующей крови, как правило, недостаточно. Необходимы данные об его количестве в любой понадобившийся момент, что позволяет правильно контролировать объем и скорость вводимых растворов, а также вовремя прекратить инфузию. Такие сведения можно получить, проводя динамическое исследование. Высокая чувствительность флюоресцентного метода, достаточно быстрая элиминация флюрената, отсутствие его токсичности, позволяют проводить контроль изменения объема циркулирующей крови в динамике, то есть обусловливают повторяемость метода.

Динамическое измерение объема крови включало приготовление стандарта и получение исследуемых образцов плазмы, которые по технике ничем не отличались от однократного измерения объема крови. При этом последующие исследуемые образцы плазмы можно забирать через любые необходимые временные интервалы. В наших исследованиях подобные заборы осуществлялись через 30, 60, 120, 240 и 360 мин. от начала обследования. Для получения этих образцов перед очередным исследованием забиралась кровь больного в объеме 5 мл, 1 мл плазмы которой исследовался на спектрометре для выявления величины остаточной флюоресценции от предыдущего(-их) введения(-й) флюрената. Затем вводилась новая доза флюрената (2 мл 10% раствора) и через 10 мин. осуществлялся забор образца крови. В этом случае измеряемая флюоресценция плазмы обусловлена очередной новой дозой равномерно распределившегося в циркулирующей крови флюрената и остаточным количеством красителя, введенного до этого, которое еще не вывелось из кровотока и циркулирует к данному моменту.

Расчет производился по формуле аналогичной для однократного исследования, с учетом разницы между флюоресценцией плазмы после введения очередной дозы флюрената (S) и остаточной флюоресценцией плазмы от предыдущего его введения ():

.

Через сутки и более на фоне инфузионной и диуретической терапии флюренат в крови, как правило, уже не выявляется, поэтому повторные измерения объема крови в эти сроки сводятся к аналогичным вышеописанным действиям, как будто это делается впервые у данного больного.

Для оценки параметров выборок рассчитывали: среднюю величину признака (), среднее квадратичное отклонение (), ошибку средней арифметической (m), коэффициент вариации (). Для сравнения выборок высчитывали критерий Стьюдента (t), определяли вероятность () возможной ошибки. Расчет показателей, построение графиков и схематические рисунки осуществлялись на компьютере с помощью пакета прикладных программ Statgraph, Supercalk, MS Excel, Origin 6.1, Macromedia Flash MX PRO 2004 7.0.

Разработка и изучение методики флюориметрии

На первом этапе работы при обследовании 40 практически здоровых и больных пациентов первой группы изучалась фармакокинетика флюрената.

При определении объема циркулирующей крови и ее компонентов у больных с различной патологией обязательно учитывается время, необходимое для смешивания метки с кровью. Для этого мы изучили динамику накопления и выведения флюрената в плазме. При этом, 10 практически здоровым пациентам внутривенно вводили 2 мл 10% раствора флюоресцеина натрия. Затем через 5, 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240 и 300 мин. производили забор 5 мл венозной крови, 1 мл плазмы которой исследовали на предмет вторичной флюоресценции. Полученные спектральные графики позволили нам построить кривую динамики накопления и выведения флюрената в плазме (рис. № 2).



Рисунок № 2. Динамика накопления и выведения флюрената в плазме при его однократном внутривенном введении: ряд 1 - практическая кривая, ряд 2 - теоретическая кривая.

Теоретическое обоснование полученной экспериментально динамики накопления и выведения флюрената в плазме, мы вывели, разбив данный процесс на стадии:

1. Введение флюрената. Уравнение, отражающее скорость накопления препарата в зависимости от времени, при его введении и смешивании с объемом циркулирующей крови, имеет вид:

, при . (1)

2. Установление равновесия концентраций флюрената между кровью и интерстицием и выведение его почками. После введения и смешивания препарата происходит уход флюрената в интерстиций и накопления его там, по мере чего появляется обратный его ток во внутрисосудистое пространство, который продолжается до установления равновесия количеств флюрената по обе стороны от сосудистой стенки, при этом начинается его почечная фильтрация. Уравнение, отражающее данный процесс имеет вид:

, при , (2)

где - скорость изменения количества флюрената в крови в зависимости от времени; - скорость внутривенного введения 2 мл 10% раствора флюоресцеина натрия, с учетом времени, затраченным на введение и перемешивание препарата со всем объемом крови; коэффициент 0,8 обозначает учет 20%-ой потери количества флюрената сразу после его введения, которое, не связываясь с альбумином, покидает русло; - поток флюрената из кровотока в интерстиций; - поток флюрената из интерстиция в кровоток, - изменение количества флюрената в крови в зависимости от времени () его ухода в почки.

Решив данные уравнения, с учетом коротких и больших времен, в общем виде мы получили:

, (3)

. (4)

Рассчитав и подставив значения констант и времен в полученные формулы (3 и 4), мы построили теоретический график фармакодинамики флюрената. Совместив его с практически построенным графиком, мы получили удовлетворительное совпадение результатов эксперимента и его теоретической модели (рис. № 2).

Процесс смешивания красителя с объемом крови, после которого следует забирать образец крови, на графике отражается быстрым начальным нарастанием концентрации флюрената и таким же быстрым ее снижением, что составляет 10 мин.

Подобное исследование фармакокинетики флюрената у произвольно выбранных 10-ти пациентов реанимационного отделения, с различной тяжелой хирургической патологией показало, что состояние волемии, равно как и величина плазменного и глобулярного объемов, никоим образом не влияют на скорость очищения плазмы от флюрената, которая определяется только временным интервалом, наряду с состоянием механизмов клубочковой фильтрации и диффузии через капилляры. Причем, у больных в условиях тяжелой патологии, которая оказывает влияние на упомянутые механизмы, флюренат из плазмы уходит волнообразно (рис. № 3).

Рисунок № 3. Динамика скорости исчезновения флюрената из плазмы в условиях патологии.

В первые полчаса после смешивания со средней скоростью - 1,839 ± 0,321 мг/мин., во вторую половину первого часа - 0,444 ± 0,097 мг/мин., в первую половину второго часа скорость выведения флюрената из плазмы вновь возрастает до 0,989 ± 0,137 мг/мин., а начиная с окончания второго часа и далее она значительно снижается до 0,234 ± 0,023 мг/мин. и продолжает убывать.

Сравнивая первые часы скорости выведения флюрената, видно, что показатели второго часа в два раза ниже, чем в соответствующие показатели первого часа. В свою очередь, сопоставляя кривые очищения плазмы от красителя у здоровых (рис. № 2) и больных (рис. № 3), заметна разница. В первом случае кривая характеризуется планомерным снижением, а во втором - при сохранении свойств планомерного снижения, кривая приобретает волнообразный характер с двукратным уменьшением пиковых концентраций скорости исчезновения флюрената из плазмы ежечасно. Выявленные пики снижения концентрации флюрената в плазме обусловлены предшествующим их появлению введением диуретиков за счет которых эти пики и были получены. Это приводило к одномоментным кратковременным ускорениям выведения препарата с мочой. Теоретическое обоснование экспериментально полученной кривой в условии патологии, как в случае с нормальной фармакокинетикой флюрената, не проводилось, так как введение диуретиков существенно усложняет график и соответствующие вычисления.

Проведенные исследования показали, что очищение плазмы от флюрената у больных в условиях патологии составляет в среднем 1,045 ± 0,188 мг/мин. Как указывает Lawson H. (1962), течение лимфы медленное и невелико по объему, так что врядли возврат красителя из лимфы может влиять на кривую его исчезновения из плазмы.

При этом мы определили, что с мочой выводится 0,104 ± 0,025 мг/мин. флюрената (3,9% в час). Учитывая скорость исчезновения красителя из плазмы, можно сделать вывод, что основное его количество поступает в ткани и там задерживается, а также выводится с желчью. По нашим расчетам диффузия флюрената в ткани у больных составляет 0,941 ± 0,171 мг/мин., то есть 90% от всего количества флюрената, покидающего плазму ежеминутно. Таким образом, скорость ухода флюоресцеина натрия в интерстиций в 9 раз превышает скорость его фильтрации в мочу.

Еще на 20 пациентах, также вошедших в контрольную группу, мы наблюдали выведение флюрената с мочой, что позволило определить, в частности, сколько его теряется с мочой за период смешивания. Оказалось, что за этот период выделяется от 0 до 0,002 г флюрената, что составляет максимум 1% от количества введенного препарата и то на фоне диуретиков. Для чистоты измерений мы учитывали эту потерю в формуле вычисления объема циркулирующей крови, у тех пациентов, у которых она была. Однако, считаем, что для простоты вычислений ею можно пренебречь в связи с малой величиной, значимо не влияющей на результаты.

Второй этап являлся лабораторным и заключался в создании графической флюориметрии.

Путем моделирования in vitro различных вариантов волемии были приготовлены разведения флюрената в плазме, начиная с наиболее низкой концентрации - 0,05 г/л (соответствует 4л плазмы) и, заканчивая наиболее высокой концентрацией - 0,2 г/л (соответствует 1л плазмы). Измерив флюоресценцию полученных растворов, мы построили калибровочную кривую (рис. № 4), позволяющую практически мгновенно оценить объем циркулирующей плазмы, предварительно измерив ее флюоресценцию, с погрешностью не более 8,35%.

Рисунок № 4. Калибровочная кривая.

Третий этап - оценка точности измерений.

Сравнение полученных данных и “истинных” осуществлялось in vitro и in vivo. В пробирках с известными объемами физиологического раствора (10 исследований) и плазмы (10 исследований) смешивались известные количества флюрената. Полученные путем перерасчета флюоресценции на спектрометре результаты объема растворов совпадали с истинными с точность до 98,8% для физиологического раствора и 97,2% для плазмы.

In vivo определение точности методики проведено на тех же 10 практически здоровых пациентах, на примере которых мы изучали фармакодинамику флюрената в плазме. Средний должный (“истинный”) объем крови среди обследованных, исходя из их массы, составил 5304,6 193,2 мл. Полученный с помощью флюориметрии средний показатель объема циркулирующей крови составил 5192 158 мл. В результате доверительный коэффициент t составил 0,453, что говорит о несущественности различий между показателями “истинными” объема крови, вычисленными по Муру и данными флюориметрии, а следовательно, о точности последнего. Среднее значение объема крови по графической флюориметрии (с помощью калибровочной кривой) составило 4763 ± 177 мл. Соответственно доверительный коэффициент между графической флюориметрией и данными методики по Moore оказался равен 2, что соответствует границе достоверности различия полученных средних величин и, следовательно, указывает на возможность применения этой методики только для получения ориентировочных данных для быстрого определения лечебной тактики.

Наряду с этим, доверительный коэффициент между графической и расчетной флюориметрией составил 1,808, что указывает на допустимость использования графической флюориметрии для более или менее точного определения объема циркулирующей крови, поскольку расчетная флюориметрия, по нашим данным, точнее методики по Moore. Статистически это выражается в том, что объем крови, вычисленный с помощью калибровочной кривой в среднем на 8,35% ниже должного. Мы считаем такой результат вполне удовлетворительным при необходимости быстрого, без дополнительных расчетов, определения объема крови для ориентировки на необходимость и объем инфузионной терапии. Следует учитывать, что расчет должного (“истинного”) объема крови по Moore основывается на весе больного, что заранее предусматривает определенную ошибку, и это, возможно, указывает на еще большую точность методики флюориметрии, поскольку показатели ее с должными все-таки несколько разнятся.

Для определения воспроизводимости мы провели серии по 10 повторных измерений вторичной флюоресценции известных объемов физиологического раствора и плазмы in vitro. Получены достаточно точные результаты, которые для физиологического раствора не отличались от истинных более чем на 2,2%, а для плазмы - на 4%. Следовательно, имеется удовлетворительная воспроизводимость данных. Несущественность различий и хорошая воспроизводимость данных позволяют говорить о высокой точности методики.

Четвертый этап - исследование метода в клинических условиях.

Однократное определение объема крови произведено 67 пациентам второй группы. Предполагалось, что у каждого была гиповолемия, ввиду анамнеза, характера заболевания, клинических данных. Вычисление объема дефицита/избытка циркулирующей крови требует знание должного показателя объема крови для больного. Однако, пациенты ввиду патологических изменений на фоне основного заболевания уже имеют измененный объем крови к моменту поступления. Так что сведения о должном количестве крови в этот момент путем измерения получить невозможно. Проблема решается путем вычисления должных индивидуальных показателей на основе средних данных об объеме крови на 1 кг массы тела. Подобный расчет, используя флюоресцентную методику, на рассматриваемых практически здоровых пациентах показал, что средний объем циркулирующей крови на 1 кг массы тела составляет 68,7±1,24 мл.

При этом коэффициент вариации () составил 1,8%, следовательно, полученный средний показатель достоверно характеризует представленный ряд. Данный показатель средний для лиц мужского и женского пола, различного конституционального типа, веса и роста, поэтому он имеет разброс от 63,69 мл до 73,23 мл, что определяет максимальную ошибку в 5,01 мл (7,3%). В случаях, когда сведения о массе тела получить было невозможно, отталкивались от средних показателей, установленных Bischoff, согласно которым объем крови взрослого человека составляет от 5 до 6 л.

В итоге, среди всех однократно обследованных 67 больных с нормоволемией отмечены 8 (11,9%) пациентов. Гиповолемия имела место у остальных 59 пациентов (88,1%): легкая - у 17 (25,4%), умеренная - у 28 (41,8%), тяжелая - у 12 (17,9%), крайне тяжелая - у 2 (3%). Следовательно из всех 67 обследованных были выделены пациенты (59 челолвек), которым показана инфузия ввиду дефицита внутрисосудистого объема жидкости.

При этом 56 пациентов не были оперированы к моменту исследования. Среди остальных 11 больных, 6 были обследованы в раннем послеоперационном периоде после плановой операции по поводу рака желудка, а 5 - после экстренной операции по поводу рака толстой кишки.

Таким образом, однократное измерение объема циркулирующей крови у поступивших и оперированных больных позволяет оценить наполненность сосудистого русла и выделить среди них тех, кому показана инфузионная терапия, предположить необходимый ее объем и скорость инфузии.

Для оказания адекватного инфузионного пособия однократного измерения объема циркулирующей крови, как правило, недостаточно. Необходимы данные о его количестве в любой понадобившийся момент, что позволяет правильно контролировать объем и скорость вводимых растворов, а также вовремя прекратить инфузию. Такие сведения можно получить, проводя динамическое исследование.

Среди 93 пациентов обследованных в динамике как с момента поступления, так и на фоне уже проводимой инфузионной терапии, вошедших в третью группу, первое измерение объема крови показало (табл. № 2), что гиповолемия имела место у 86 пациентов (92,5%): легкая - у 33 (35,5%), умеренная - у 36 (38,7%), тяжелая - у 14 (15,1%), крайне тяжелая - у 3 (3,2%); нормоволемия встретилась у 4 пациентов (4,3%); гиперволемия - у 3 (3,2%): легкая - у 2 (2,2%), среднетяжелая - у 1 (1%).

Проведенная за 6 часовой интервал инфузионная терапия, контролируемая динамическим измерением объема циркулирующей крови с помощью разработанной флюориметрии плазмы, привела к изменениям волемии у обследованных 93 пациентов, представленным в таблице № 3.

В итоге, гиповолемия имела место у 77 пациентов (82,8%): легкая - у 48 (51,6%), умеренная - у 29 (31,2%); нормоволемия была достигнута у 13 пациентов (14%); гиперволемия - у 3 (3,2%): легкая - у 2 (2,2%), среднетяжелая - у 1 (1%).

Таблица № 2. Распределение пациентов по уровню волемии к началу исследования.

Нозология	Гиперволемия	Нормоволемия	Легкая гиповолемия	Умеренная гиповолемия	Тяжелая гиповолемия	Крайне тяжелая гиповолемия	Итого
Кровотечение из верхних отделов желудочно-кишечного тракта	3	2	9	6	8	3	31
Толстокишечное кровотечение	-	-	6	1	-	-	7
Внутрибрюшное кровотечение	-	-	-	1	1	-	2
Острая кишечная непроходимость	-	-	9	11	-	-	20
Острый панкреатит	-	-	5	13	3	-	21
Перитонит	-	-	2	2	2	-	6
Рак желудка	-	2	1	-	-	-	3
Рак сигмовидной кишки	-	-	1	2	-	-	3
Всего	3	4	33	36	14	3	93

Таблица № 3. Распределение пациентов, которым производилось динамическое измерение объема крови, по уровню волемии к окончанию исследования.

Нозология	Гиперволемия	Нормоволемия	Легкая гиповолемия	Умеренная гиповолемия	Тяжелая гиповолемия	Крайне тяжелая гиповолемия	Итого
Кровотечение из верхних отделов желудочно-кишечного тракта	3	2	14	12	-	-	31
Толстокишечное кровотечение	-	-	7	-	-	-	7
Внутрибрюшное кровотечение	-	1	1	-	-	-	2
Острая кишечная непроходимость	-	3	14	3	-	-	20
Острый панкреатит	-	-	8	13	-	-	21
Перитонит	-	2	3	1	-	-	6
Рак желудка	-	2	1	-	-	-	3
Рак сигмовидной кишки	-	3	-	-	-	-	3
Всего	3	13	48	29	-	-	93

Сравнивая представленные данные с исходными, видно, что проведенная инфузионная терапия, сопровождаемая динамическим контролем объема циркулирующей крови позволила уменьшить глубину гиповолемии во всех случаях, среди которых полностью нивелированы тяжелая и крайне тяжелая гиповолемии. В некоторых случаях достигнута нормоволемия. Неизменным осталось количество пациентов с гиперволемией, ввиду отсутствия специфического лечения из-за преимущественно легкой ее степени и тенденции к снижению объема крови в сторону нормоволемии (рис. № 5).

Проведенный анализ измерений объема внутрисосудистой жидкости выполненных в процессе инфузионной терапии через 30, 60, 120, 240 и 360 мин. от начала обследования у 93 пациентов третьей группы позволили оценить эффективность вводимых инфузионных средств в зависимости от скорости их введения. Суммарные данные отражающие это представлены в таблице №4.



Рисунок № 5. Соотношение уровня волемии у пациентов до и после инфузионной терапии, проведенной под динамическим контролем объема крови.

Таблица № 4. Эффективность инфузии различных сред в отношении прибавки объема циркулирующей крови.

Среда	Инфузия, мл/час	Диурез, мл/час	Прирост ОЦК, мл/час
Изотонические кристаллоиды	148,4±2,6	56,4±1,8	-
Изотонические кристаллоиды	200,7±20,9	63,8±2,4	5,55,5
Изотонические кристаллоиды	241,7±7,4	57,8±1,7	15,9±3,7
Изотонические кристаллоиды	303,1±86,4	57,6±1,7	33,512,8
Коллоиды	200	39,8±0,2	156,3±1,5

Анализ результатов инфузии различных сред при гиповолемии показал, что введение изотонических кристаллоидов со скоростью до 200 мл/час не приводит к изменениям объема крови на фоне достаточного диуреза. В то же время инфузия тех же солевых растворов более 200 мл/час при адекватном диурезе приводит к увеличению объема крови.

При этом получилось, что увеличение объема вводимых солей в 1,2 раза увеличивало прирост внутрисосудистой жидкости в 3 раза, в 1,35 раза - в 4,6 раз, в 1,4 раза - в 6 раз, в 1,8 раза - в 9 раз, а его увеличение в 2,3 раза увеличивало прирост - в 13 раз. Рассматривая инфузию коллоидов, в сравнении с таковой кристаллоидов мы отметили, что введение в 1,5 раза меньшего по объему коллоидов, увеличивает прирост объема крови в 3,3 раза больше. Другими словами, при равных объемах инфузии коллоиды почти в 5 раз дают больший прирост к объему циркулирующей крови, чем изотонические кристаллоиды.

При этом у пациентов с гиперволемией прибавки к объему крови практически не наблюдалось на фоне инфузии до 108,3±7,4 мл/час, что объяснялось компенсаторным увеличением диуреза до 95±7,1 мл/час. Подобная инфузия на фоне нормоволемии также не приводила к изменению объема крови при неизмененной работе почек, равно как и ее отсутствие.

Сложность процессов перераспределения вводимых растворов между водными секторами организма, зависящая от их химизма, концентрации, скорости введения, с учетом механизмов гемодилюции, почечной фильтрации и реабсорбции, не позволяют оценить наполненность сосудистого русла никаким способом, кроме как динамическим измерением объема циркулирующей крови. Такой контроль с помощью разработанной методики флюориметрии плазмы обеспечивает возможность проведения корректной инфузионной терапии и, как следствие - приводит к улучшению результатов лечения больных с дисволемей.

Методика флюориметрии определения объема циркулирующей крови позволяет достаточно просто и точно выявить нарушение волемии, правильно оценить состояние больных, целенаправленно и полноценно определить комплекс лечебных мероприятий.

Подводя итог мы отметили, что разработанная флюоресцентная методика измерения объема циркулирующей крови характеризуется безопасностью, необременительностью для больных, воспроизводимостью и достаточной точностью измерений. По сравнению с имеющимися подобными индикаторными методиками она отличается большей простотой осуществления методики и ее дешевизной, аппаратура компактна, быстро подключается в необходимых ситуациях, не требуя специального персонала. При этом не было выявлено каких-либо побочных эффектов флюоресцентного исследования.

Выводы

1. Построенная теория процессов, происходящих при введении флюрената в кровь, позволила разработать методику измерения объема циркулирующей крови.

2. Разработанная методика дает высокую точность результатов спектрального определения объема циркулирующей крови (97,2%).

3. Созданная калибровочная кривая позволяет быстро оценить объем циркулирующей крови путем графической флюориметрии с погрешностью менее 8,35%.

4. Разработанный способ расчетной флюориметрии для однократного измерения объема циркулирующей крови позволяет четко выделить пациентов, которым изначально показана инфузионная терапия.

5. Разработанный способ определения объема крови в динамике на основе расчетной флюориметрии, позволяет корректно проводить инфузионную терапию.

Практические рекомендации

1. Всем пациентам с патологией, приводящей к изменению объема внутрисосудистой жидкости вследствие ее потери во внешнюю среду или перемещения в другие водные пространства организма, при планировании инфузионной терапии необходимо однократное измерение объема циркулирующей крови флюоресцентной методикой, что позволяет выявить среди них больных с гиповолемией, нуждающихся в инфузии, и пациентов с нормо- и гиперволемией, которым ее проводить не следует, а если и нужно с дезинтоксикационной целью, то с использованием диуретиков, дабы не допустить перегрузки сердечно-сосудистой системы.

2. Динамическое измерение объема циркулирующей крови через любые понадобившиеся временные интервалы показано при проведении интенсивной инфузионной терапии, требующей большого объема жидкости особенно во время длительных операций и в послеоперационном периоде.

3. При легкой гиповолемии рекомендуется производить вливания солевых растворов со скоростью более 200 мл/час, что приводит к ее нивелированию, поскольку скорость их введения менее 200 мл/час не успевает компенсировать уход кристаллоидов в интерстиций и через почки в мочу.

4. В случаях умеренной и тяжелой гиповолемии предварительное введение коллоидов и последующий более интенсивный темп инфузии кристаллоидов (300 мл/час) позволит уменьшить степень гиповолемии.

флюориметрия кровь плазма волемия

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кочанов Д.А., Полсачев В.И., Словоходов Е.К. Изучение микроциркуляции кишки люминесцентным методом //Актуальные вопросы клинической медицины. - Москва, 2005. - С. 120-121.

2. Кочанов Д.А., Полсачев В.И., Уртаев С.А., Словоходов Е.К. Флюоресцентный метод измерения объема циркулирующей крови //Клиническая медицина Центросоюза. - Москва, 2006. - С. 175-177.

3. Кочанов Д.А., Полсачев В.И., Уртаев С.А., Словоходов Е.К. Флюоресцентный метод измерения объема циркулирующей крови //Актуальные вопросы маммологии, экспериментальной и клинической медицины. - Москва, 2007. - С. 106-108.

4. Полсачев В.И., Кочанов Д.А. Флюоресцентная диагностика: история развития и состояние проблемы //Хирург. - 2008. - № 4. - С. 28-32.

5. Кочанов Д.А., Полсачев В.И., Басанов Р.В., Намиот В.А. Определение объема циркулирующей крови с помощью спектрометрии плазмы //Хирург. - 2008. - № 4. - С. 33-38.

6. Кочанов Д.А., Полсачев В.И., Намиот В.А. Флюоресцентная методика измерения объема циркулирующей крови //Врач-аспирант. - 2008. - № 2. - С. 154-159.

Размещено на Allbest.ru

...