Репродуктивная функция у мужчин при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов

Размещено на http://www.Allbest.ru/

14.01.23 - Урология. Медицинские науки

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Тема:

Репродуктивная функция у мужчин при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов

Мингболатов Аятулла Шахболатович

Москва - 2011

Работа выполнена в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава»

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Теодорович Олег Валентинович

Доктор медицинских наук, профессор Божедомов Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Зайцев Андрей Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор Кадыров Зиератшо Абдуллоевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а).

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор М.М. Умаханова

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

В настоящее время в среднем каждая седьмая пара в мире бесплодна и в половине случаев это связано с нарушениями репродуктивной функции у мужчин (WHO, 2000; EAU, 2010). Одной из причин мужского бесплодия считаются аутоиммунные реакции против сперматозоидов, которые сопровождаются выработкой антиспермальных антител/АСАТ (Божедомов В.А. и соавт., 2001, 2005; Тиктинский О.Л. и соавт., 2004; Check J., 2006; Lee R. et al., 2009; Walsh T., Turek P., 2009; Krause W., Naz R., 2009). Уже почти 30 лет диагноз «иммунное бесплодие» выделен в отдельную нозологию (Лопаткин Н.А., 1998; ВОЗ,1980-2010). В то же время значение АСАТ в развитии бесплодия, многие вопросы диагностики, этиологии, патогенеза, профилактики и лечения данного заболевания остаются спорными. Известно, что аутоиммунные реакции против сперматозоидов не всегда приводят к бесплодию и АСАТ могут быть обнаружены в значимых количествах у фертильных мужчин (Naz R, 2004; Bohring C, Krause W, 2005; Chamley L, Clarke G, 2007). Недавно представлены данные о наличии т.н. «холодовых» АСАТ, которые при использовании метода проточной цитофлюорометрии (ПЦМ) выявлялись в значительных количествах на сперматозоидах фертильных мужчин (Николаева М.А., 2007). Некоторые урологи и специалисты в области ЭКО не учитывают данный фактор, считая его клинически мало значимым (Krapez J et al.,1998; Kutteh W,1999; Kallen C., Arici A., 2003; Leushuis E et al., 2008, 2009; Zini A et al., 2011). Отсутствует понятие иммунологической причины бесплодия в Руководстве по урологии Европейской ассоциации урологов (EAU, 2010).

Скептицизм, касающийся роли аутоиммунных реакций в развитии бесплодия, вызван, в немалой степени, существованием большого числа различных методов определения АСАТ, результаты которых слабо коррелируют друг с другом (Божедомов В.А. и соавт., 2003; Helmerhorst F. et al., 1999; Francavilla F. et al., 2007).

Нет единой точки зрения о том, каким образом АСАТ влияют на фертильность. Имеются данные, что АСАТ способны нарушать сперматогенез и приводить к патоспермии, препятствовать проникновению через цервикальную слизь (ЦС) и оплодотворению яйцеклетки (Божедомов В., 2001; Bohring C. et al., 2001; Check J. et al., 2002; Lombardo F. et al., 2004; Zhang H. et al., 2006; Clarke G., 2009). Однако имеется немалое количество публикаций, опровергающих каждое из этих утверждений (Gubin D. et al.,1998; Carbone Jr D. et al.,1998; Liu R. et al., 2003).

Остается недостаточно изученным этиопатогенез данного заболевания. Показано, что к выработке АСАТ могут приводить многие воздействия: непроходимость семявыносящих путей, инфекции репродуктивного тракта (ИРТ), орхиты, простатиты, варикоцеле, крипторхизм, перекрут яичка и др. (Чернышов В.П.,1990; Божедомов В.А. и соавт., 2001, 2005; Полховский В.Н. и соавт., 2006; Walsh T., Turek P., 2009; Krause W., Naz R., 2009; Kurpisz M. et al., 2010). Показана роль гемато-тестикулярного барьера (ГТБ) в предотвращении аутоиммунного процесса в яичках (Райцина С.С.,1985). Однако абсолютный и относительный риск развития бесплодия при действии различных повреждающих факторов остаются неизвестными. Некоторые исследователи ставят под сомнение существование причинно-следственной связи между продукцией АСАТ и такими потенциально повреждающими факторами, как хронические урогенитальные воспалительные заболевания (Семенов А.В. и соавт., 2010; Marconi M. et al., 2008; Eggert-Kruse W. et al., 2008) и варикоцеле (Божедомов О.В., Теодорович О.В., 2005; Verдjдnkorva E. et al., 2003).

Остается очень ограниченным выбор способов лечения мужского иммунного бесплодия: традиционно для этого используют высокие дозы кортикостероидов и ЭКО ИКСИ (Божедомов В.А., 2000-2009; Walsh T., Turek P., 2009; Francavilla F. et al., 2009; Zini A, et al., 2011). Однако, учитывая низкую эффективность, а, кроме того, значительный процент побочных эффектов в первом случае и высокую стоимость во втором, поиск патогенетически обоснованных методов лечения представляет собой актуальную задачу.

Все это обусловило актуальность избранной темы исследования.

Цель исследования: показать роль аутоиммунных реакций против сперматозоидов в комплексной профилактике нарушений мужской репродуктивной функции.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать взаимосвязь между выраженностью аутоиммунных реакций против сперматозоидов и фертильностью мужчин.

2. Уточнить роль различных экзо- и эндогенных факторов в этиологии аутоиммунных реакций против сперматозоидов.

3. На основе этих данных уточнить патогенез снижения фертильности при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов.

4. На основе новых данных о патогенезе снижения фертильности при развитии антиспермального иммунитета разработать оригинальные методы лечения.

5. Разработать рекомендации по комплексной первичной, вторичной и третичной профилактике мужского иммунного бесплодия.

Научная новизна

Для оценки аутоиммунных реакций против сперматозоидов использован комплекс методов определения АСАТ (смешанная реакция агглютинации, проточная цитофлюорометрия, ИФА), что позволило установить новые закономерности взаимодействия антител с гаметами и оценить их влияние на фертильность. Сформулировано и обосновано положение о том, что продукция АСАТ является одним из механизмов естественного отбора сперматозоидов в мужском репродуктивном тракте.

Представлены комплексные данные о взаимосвязи между аутоиммунным процессом и 1) сперматогенезом, 2) подвижностью и морфологией сперматозоидов, их агглютинацией, 3) физико-химическими свойствами семенной плазмы, 4) акросомной реакцией, 5) апоптозом сперматозоидов. Количественно охарактеризованы нарушения спонтанной и индуцированной акросомной реакции у пациентов с иммунным бесплодием. Установлено, что между количеством АСАТ и процентом сперматозоидов с признаками апоптоза (дисперсия хроматина) и степенью таких нарушений существует прямая зависимость, а с процентом морфологически и функционально дефектных сперматозоидов, наоборот, обратная корреляция. Показана роль гиперпродукции активных форм кислорода (АФК) в развитии иммунного мужского бесплодия. Продемонстрирована возможность применения препаратов с антиоксидантным действием для освобождения гамет от антител и восстановления их функций.

Установлены распространенность различных этиологических факторов появления АСАТ (травмы, инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле и др.), абсолютный и относительный риск формирования аутоиммунных реакций против сперматозоидов при действии каждого из них. Показана роль Т-, НК- и В-клеточных реакций в развитии иммунного бесплодия, описаны механизмы наблюдаемых нарушений, охарактеризовано значение различных классов АСАТ.

Практическая значимость

Уточнены возможности различных методов оценки аутоиммунных реакций против сперматозоидов для клинических целей.

Установлена распространенность различных нарушений качества спермы у мужчин с иммунным бесплодием.

Уточнен патогенез снижения фертильности при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов, учитывающий данные стандартной спермограммы, тестов на акросомную реакцию, оксидативный стресс и апоптоз сперматозоидов, показателей состояния иммунной системы.

Рекомендованы в практику меры первичной, вторичной и третичной профилактики мужского иммунного бесплодия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов снижают фертильность пропорционально доли подвижных гамет покрытых АСАТ классов IgG и IgA. У пациентов с АСАТ наблюдаются нарушения спонтанной и индуцированной акросомальной реакции. Существует прямая зависимость между процентом АСАТ-позитивных сперматозоидов и долей мужских гамет с признаками апоптоза (дисперсия хроматина). Наличие антител только на неподвижных гаметах и свободных АСАТ в семенной плазме является физиологическим механизмом, обеспечивающим элиминацию поврежденных и мертвых сперматозоидов, и оказывает слабое влияние на фертильность.

2. Дисбаланс окислительных и антиокислительных процессов играет важную роль во взаимодействии АСАТ со сперматозоидами. Препараты с выраженным антиоксидантным действием, стабилизирующие мембраны на фоне избытка активных радикалов, способствуют освобождению гамет от антител и восстановлению их функций.

3. Преобладающими этиологическими факторами развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов являются повреждение гемато-тестикулярного барьера в результате механической травмы мошонки (АР = 59%, ОШ = 1,84) и орхита (АР = 78%, ОШ = 4,0). Инфекционно-воспалительные заболевания приводят к появлению АСАТ в результате иммуноопосредованных. Преобладание АСАТ класса IgA на сперматозоидах отражает признаки локальной и системной иммуносупрессии.

4. Ведение мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов предусматривает устранение всех возможных этиопатогенетических факторов (инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле, обтурация, перегревание и др.), снижение продукции АСАТ, удаление АСАТ, связанных со сперматозоидами, и вспомогательные репродуктивные технологии.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования и вытекающие из них рекомендации внедрены в работу Урологического центра ЦКБ№1 ОАО «РЖД», ФГУ «Клиническая больница Росздрава», используются в учебном процессе на кафедре эндоскопической урологии ГОУ ДПО «РМАПО Росздрава».

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на 4-й Всероссийской конференции «Мужское здоровье» (Москва, 2008); XIX международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Иркутск, 2009); IV Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва, 2010); Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты» (Москва, 2010); Пятом Международном конгрессе по андрологии (Тунис, Сусс, 2010), ХХ международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Нижний Новгород, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в т.ч. 1 - в журнале, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, подана одна заявка на Изобретение РФ, на которую получено положительное решение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы», главы содержащей результаты собственных исследований, главы «Обсуждение результатов», выводов и практических рекомендаций. В диссертации 17 таблиц и 33 рисунок. Библиографический список включает 54 отечественных и 366 зарубежных источника.

Материалы и методы исследования

Для выполнения поставленных задач представляемое исследование было разделено на ретроспективную и проспективную части. Ретроспективно были проанализированы истории болезни и амбулаторные карты мужчин репродуктивного возраста, обращавшихся по поводу бесплодного брака (n = 287). В проспективную часть данного исследования было включено 98 мужчин из бесплодных пар, проходящих комплексное клинико-лабораторное обследование, 49 из которых получали лечение согласно традиционным и новым способам. Контрольную группу составили 82 фертильных мужчины, у жен которых диагностирована беременность 6-20 недель, наступившая в естественном цикле.

При обследовании пациентов были использованы следующие методы:

общеклиническое обследование;

УЗИ простаты и яичек, в т.ч. доплерометрия сосудов семенного канатика;

оценка качества эякулята в соответствии с требованиями ВОЗ;

определение антиспермальных антител (АСАТ) IgG и IgA на сперматозоидах методом MAR (Ferti Pro N.V., Бельгия) и с помощью проточных цитофлуориметров Facscan (Becton Dickinson, США) и Bryte (Bio-Rad, Италия); в крови - с использованием набора “Spermatozoa antibody ELISA” (IBL, Германия).

определение акросомной реакции: проточная цитофлуорометрия с использованием лектинов P.sativum, меченного флуоресцеин-изотиоционатом, и A.hypogaea, меченного ТРИТЦ (Sigma) по методике М.А.Николаевой (2000);

оценка апоптоза сперматозоидов методом дисперсии ДНК в агарозном геле;

определение лейкоцитов в секрете простаты методом световой микроскопии;

определение интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительной активности методом хемилюминесценции («Хемилюминометр-003», Россия);

определение содержание гормонов (ФСГ, тестостерон и др.) в периферической крови методом ИФА;

обнаружение инфекций репродуктивного тракта методами ПЦР, ИФА, посевом на питательные среды;

иммунологические исследования: проточная цитофлуорометрия, метод Кембела, нефелометрический метод;

Лабораторные исследования выполнены на базе ФГУ «Клиническая больница Росздрава» (гл. врач - проф. Божедомов В.А.), ФГУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова Минздравсоцразвития РФ» (директор - акад. РАМН, проф. Сухих Г.Т.), ЦКБ№1 ОАО «РЖД» (директор - Пфаф В.Ф.).

Статистическая обработка данных выполнена с применением электронных таблиц «Microsoft Excel» и «Statistica» (StatSoft, США); вычисляли медиану, M, SD, значимость различий оценивали по критериям Стьюдента, Манна-Уитни и Фишера, Вилкоксона для независимых и парных выборок, Хи-квадрат и критерию знаков, выполняли корреляционный анализ (вычисляли коэффициенты r, R, Gamma).

Результаты исследования и их обсуждение

Группа фертильных мужчин по возрасту существенно не отличалась от пациентов бесплодных пар: 32,8+7,3 и 31,6+7,8 лет соответственно. У фертильных мужчин АСАТ встречались так же часто, как у пациентов из бесплодных пар, но имелись существенные различия в степени выраженности аутоиммунного процесса (рис. 1).



Рис. 1. Доля прогрессивно подвижных сперматозоидов, покрытых АСАТ (А) и распространенность аутоиммунных реакций (Б) в группах фертильных мужчин (n = 82), пациентов из бесплодных пар с первичным (n = 184) и вторичным (n = 201) нарушением репродуктивной функции.

Примечание:

*распространенность иммунного бесплодия по сравнению с фертильными больше с p<0,01;

**с p<0,001;

# между группами с нарушением фертильности с p<0,01.

У фертильных (рис.1, А) для MAR%IgG квартили 25%-75% = (0; 6), диапазон не выпадающих значений = (0;15); только в 4-х случаях (5%) антителами были покрыты больше половины подвижных гамет. Из анамнеза было известно, что зачатие в естественном цикле от этих мужчин имело место в первые 3 мес половой жизни без механической контрацепции, в то время как при меньшем проценте АСАТ-позитивных сперматозоидов оно происходило за период до 24 мес. При вторичном бесплодии умеренно выраженные аутоиммунные реакции (MAR 10-50%) встречались в 15% случаев, «иммунное бесплодие» по ВОЗ (MAR IgG>50%) - в 17% случаев, что в 3,4 раза чаще, чем у фертильных (p_хи2<0,05); квартили 25%-75% = (0;16), диапазон не выпадающих значений = (0;40). У пациентов с первичным бесплодием АСАТ на подвижных сперматозоидах встречаются чаще всего - в 47% случаев, квартили 25%-75% = (0;72,5); диапазон не выпадающих значений = (0;100); при этом АСАТ в умеренном количестве - 12% случаев; «иммунное бесплодие» - 29% случаев (что в 5,8 раз чаще, чем у фертильных, p_хи2 < 0,001, и в 1,7 раза чем при вторичном бесплодии, p_хи2 < 0,01).

Использование различных методов выявления АСАТ показало, что только результаты MAR-теста положительно взаимосвязаны с длительностью вынужденного бесплодия даже при нормозооспермии (R = 0,39; р = 0,00001; рис.2). Причем антитела класса IgG демонстрировали более сильную зависимость, чем IgA (R = 0,20; p = 0,03).

Рис. 2. Взаимосвязь между длительностью вынужденного бесплодия у пациентов с нормозооспермией и процентом прогрессивно подвижных сперматозоидов, покрытых IgG и IgA

Данные ПЦМ, показывающие процент живых гамет, покрытых с АСАТ, и количество антител на каждом сперматозоиде, не обнаружили значимой корреляции с реальной фертильностью, так же как и определение концентрации АСАТ в сыворотке крови методом ИФА (p>0,05).

В группах с иммунным фактором бесплодия (MAR%IgG>10%) показатели спермограммы существенно хуже, чем у фертильных мужчин (табл. 1), но почти не различаются между собой. Зависимость числа сперматозоидов с нормальной морфологией и прогрессивной подвижностью (категории А и В) в эякуляте - индекс качества спермы (ИКС), - от MAR%IgG отсутствует (p>0,05). Так же как от количества АСАТ в крови (p>0,05). Зато имеется отрицательная зависимость ИКС от процента живых гамет, покрытых АСАТ по данным ПЦМ (рис. 3).

Рис. 3. Взаимосвязь между количественными показателями спермограммы и процентом всех живых, покрытых IgG, по данным проточной цитофлуорометрии

аутоиммунный сперматозоид фертильность бесплодие

Интересен факт, что процент АСАТ-положительных сперматозоидов связан отрицательной зависимостью с процентом патологических форм: для MAR IgG (R = -0,23; p = 0,0003), MAR IgA (Gamma = -0,22; p = 0,038), для ПЦМ IgG (r = -0,25; р<0,01). В первую очередь, это происходит за счет патологии головки. Т.е. чем больше АСАТ - тем меньше патологических и больше нормальных форм сперматозоидов в эякуляте. В условиях относительного избытка АСАТ (MAR IgG 100%) различия в количестве сперматозоидов с нормальной морфологией и прогрессивной подвижностью между группами с ПЦМ% больше-меньше медианы составляют 2,4 раза (табл. 2).

Таблица 1

Параметры спермограммы у фертильных мужчин и пациентов из бесплодных пар с АСАТ на сперматозоидах

Показатель	Фертильные	MAR IgG не менее 10%
		MAR<50%	MAR>50%
Число обследованных	82	198	227
MAR IgG, %	2,64,3	23,011,4###	86,217,6***###
Объём, мл	3,91,5	3,81,5	3,81,5
Концентрация, млн/мл	82,249,7	70,351,8###	66,548,7###
Подвижность А, %	24,815,7	15,413,0###	17,014,0###
Подвижность В, %	20,611,4	18,612,6	18,814,0
Подвижность Д, %	37,613,2	44,819,2###	45,217,8###
Патолог. формы, %	46,523,2	47,924,2##	46,424,2###
Лейкоциты, млн/мл	0,320,31	0,320,31	0,320,30
Агглютинация, баллы	0,00,00	0,300,46	0,500,68*
Количество сперматозоидов с нормальной морфологией и подвижностью, млн.	68,255,4	38,939,8###	45,446,6###

Примечание:

M - среднее арифметическое,

SD - стандартное отклонение;

* - различия между АСАТ-позитивными группами достоверны при P_t<0,05;

*** - при P_t<0,001;

^## - различия между АСАТ-позитивной и фертильной группами достоверны при P_t<0,01,

^### - при P_t<0,001. Исключены пациенты с инфекционно-воспалительными процессами дополнительных половых желез.

Таблица 2

Различия показателей спермограммы у бесплодных пациентов c MAR IgG 100% в зависимость от результатов анализа методом ПЦМ

Показатель	MAR IgG = 100%
	ПЦМ IgG<45%	ПЦМ IgG>45%
Число обследованных	35	37
MAR IgA, %	49.732.7	49.234.5
Объём, мл	3.61.1	3.81.3
Концентрация, млн/мл	78.746.1	44.529.0***
Подвижность категории А, %	19.915.5	17.514.9
Подвижность категории В, %	18.713.0	17.312.8
Подвижность категории С, %	22.69.7	20.29.5
Подвижность категории Д, %	41.816.4	47.417.7
Патологические формы, %	30.010.0	33.015.7
Лейкоциты, млн/мл	0.350.25	0.560.54**
Клетки сперматогенеза, млн/мл	1.941.40	1.031,36*
Количество сперматозоидов с нормальной морфологией и подвижностью, млн	73.658.6	30.623.9***

Примечание:

M - среднее арифметическое,

SD - стандартное отклонение; основные ИРТ - отрицательно; процент активно-подвижных сперматозоидов больше 0;

* - различия между группами достоверны при P_t<0,05;

** - при P_t<0,01,

*** - при P_t<0,001.

Одним из факторов патоспермии при этом является увеличение содержания в сперме лейкоцитов даже при отсутствии диагностируемых ИРТ. Известно, что гранулоциты и макрофагоциты участвуют не только в защите от инфекций, но и выполняют функцию контроля качества спермы, устраняя морфологически ненормальные гаметы (Tomlinson M. et al., 1992; Fedder J.et al., 1993). Полученные результаты подтверждают мнение многих авторов (Божедомов В. и соавт., 2000-2009; Naz R., 2004; Check J., 2006; Ahangari G. Et al., 2008; Cline A., Kutteh W., 2009), что присутствие АСАТ на сперматозоидах сопровождается снижением реальной фертильности. Но даже значительные количества АСАТ не всегда приводят к бесплодию. Очевидно, в этом случае АСАТ направлены против функционально малозначимых структур гамет. Однако отличить АСАТ, приводящие к бесплодию, и не связанные со снижением фертильности в настоящее время не представляется возможным, поскольку антигенная специфичность АСАТ известна недостаточно (Chiu W., Chamley L., 2004; Ahangari G. Et al., 2008). При этом взаимосвязь между процентом АСАТ-позитивных сперматозоидов и параметрами спермограммы является слабой, большинство бесплодных мужчин имеют субнормальные количество и подвижность сперматозоидов. Следовательно, бесплодие на фоне АСАТ обусловлено главным образом функциональными нарушениями сперматозоидов.

Ранее было показано, что существует положительная взаимосвязь между процентом АСАТ-позитивных сперматозоидов и процентом гамет, преждевременно утративших акросому (Короткова И.В. и соавт., 2001; Feng H. et al., 2008). Можно наблюдать, как сперматозоиды агглютинируют «головка к головке» при добавлении АСАТ-позитивной сыворотки в образец (рис. 4, А).

Рис. 4. Акросомная реакция у пациентов с АСАТ: (А) агглютинация сперматозоидов головками в области акросомы при добавления АСАТ-позитивной сыворотки в образец; (Б) нарушения АР при различной активности аутоиммунного процесса против сперматозоидов (n = 122 и 148)

По нашим данным (рис.4,Б) при аутоиммунных реакциях против сперматозоидов имеют место нарушения двух типов: избыточность спонтанной АР и недостаточность индуцированной. Нередко эти нарушения наблюдаются вместе. Чем больше сперматозоидов покрыты АСАТ, тем больше выражены эти нарушения. Только 40% сперматозоидов у мужчин с «иммунным бесплодием» по ВОЗ имеют нормальную АР. Остается не ясным принципиальный вопрос: сами аутоиммунные реакции против сперматозоидов вызывают нарушения АР, или АСАТ взаимодействуют с гаметами, неполноценными в результате влияния каких-то других факторов - наследственных или экзогенных.

Важным является следующее наблюдение - при исследовании спермы методом MAR возникшая агглютинация подвижных гамет с латексными частичками, покрытыми IgG или IgA, может исчезать. Описано «исчезновение» АСАТ с поверхности живых гамет при использовании метода ПЦМ (Николаева М. и соавт., 2000). Очевидно, мембрана сперматозоида способна сбрасывать чужеродные частички, в том числе АСАТ. Условием этого является ее достаточно низкая ригидность, что обеспечивается оптимальным соотношением насыщенных и ненасыщенных жирных кислот при балансе процессов свободно-радикального окисления в организме. Нами установлено (Божедомов В. и соавт., 2008, 2009), что у мужчин с иммунным бесплодием продукция активных форм кислорода (АФК) в 3,1 раза больше, чем у фертильных. В группе, где АСАТ покрывают меньше половины подвижных сперматозоидов, уровень АФК больше, чем у фертильных, в 1,79 раза. Различия высоко достоверны и между группами пациентов с АСАТ (1,71 раза; p<0,001). При нормальной концентрации сперматозоидов между АФК и АСАТ имеется прямая зависимость, причем продукция АФК больше зависит от количества антител на спер46 (p = 0,02), соответственно.

Известно (Henkel R et al., 2005; Villegas J et al., 2005; de Jonge C, Barratt C, 2006; Kao S et al.,2008), что гиперпродукция АФК является одной из причин, приводящих к фрагментации ДНК, которая является признаком апоптоза сперматозоидов. Последние годы появились данные, что повышенная фрагментация ДНК сперматозоидов не влияет на процесс оплодотворения, но приводит к нарушениям развития зародыша (Meseguer M.,et al.,2007; Zini A. et al.,2008). Несмотря на то, что многие из полученных эмбрионов гибнут на ранних эмбриональных стадиях, есть вероятность, что ребенок с поврежденной отцовской ДНК может родиться. Последствия этого пока достоверно неизвестны, но предполагается, что поврежденная ДНК может обуславливать генетические дефекты и рак у детей (Aitken R et al.,2003; de Jonge C, Barratt C,2006).

Чтобы уточнить взаимосвязь между аутоиммунными реакциями против сперматозоидов и нарушениями их функций, было проведено изучение апоптоза сперматозоидов. Наши исследования показали, что между продукцией АФК, с одной стороны, и фрагментацией ДНК с другой существует положительная взаимосвязь (рис.5). Одновременно имеется значимая положительная взаимо-связь между процентом сперматозоидов, покрытых АСАТ, с одной стороны, и процентом сперматозоидов с фрагментацией ДНК (R = 0,42; p = 0,023) и степенью такой фрагментации (R = 0,51; p = 0,004) (рис.6). При этом процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК прямо пропорционален доле сперматозоидов с морфологически измененной головкой (R = 0,20; p = 0,03).

Это означает, что при использовании методов ЭКО и ПЭ для лечения мужского иммунного бесплодия даже в случаях успешного оплодотворения и нормального дробления зародыша in vitro существует повышенный риск неудачных беременностей.

Рис. 5. Взаимосвязь между процентом сперматозоидов с признаками апоптоза и продукцией в сперме активных форм кислорода

А Б

Рис. 6. Зависимость между наличием АСАТ на сперматозоидах и (А) процентом сперматозоидов с признаками апоптоза и (Б) степенью фрагментация ДНК

Полученные данные позволяют считать гиперпродукцию АФК у мужчин с АСАТ одним из ведущих патогенетических механизмов снижения фертильности при иммунном бесплодии, затрагивающим, в том числе, целостность ДНК гамет. При этом влияние АФК на сперматозоиды может быть осуществлено, как посредством механизма пассивного апоптоза, затрагивающего митохондриальные ферменты и каспазу-9, так и активного Са⁺²-зависимого, куда вовлечена каспаза-8 (у человека - 10) (Saribek B. et al., 2006; Held T. et al., 2006; Hassun F. et al., 2006).

Ранее мы показали (Божедомов В.А. и соавт., 2008; 2009), что мужчин из бесплодных пар с АСАТ повышенный уровень АФК (верхней границей нормы мы считаем значение, превышающее 95% ДИ для фертильных мужчин) имеет место только в 40-74% случаев в зависимости от активности аутоиммунного процесса. А так же нередко (22% случаев) наблюдаются высокие уровни АФК у фертильных мужчин. Это означает, что не всегда цитотоксические эффекты АФК приводят к нарушениям фертильности. Важную роль в защите гамет могут играть антиоксидантные системы (Mostafa T.,et al., 2006; Khosrowbeygi A., Zarghami N., 2007). По нашим данным имеется отрицательная взаимосвязь антиокислительной активности и процента сперматозоидов с признаками апоптоза (r = -0,39; p<0,05). Т.е. недостаточность антиоксидантных систем приводит к гиперпродукции АФК, что в свою очередь вызывает апоптоз сперматозоидов.

Исходя из этих представлений, антиоксиданты могут быть эффективны при лечении мужского иммунного бесплодия. Это предположение подтверждено использованием препарата 3-Окси-6-метил-2-этил-пиридина гидрохлорида (Эмокипин) в/м в стандартной дозе 0,03-0,05 г (3-5 мл 1% раствора) ежедневно 2-3 раза в сутки в фолликулярную фазу цикла партнерши в течение 10-30 дней. Показано, что, влияя на различные звенья иммунопатологического процесса, препарат приводит к уменьшению образования и связывания АСАТ со сперматозоидами (рис.7) и восстанавливает их акросомную реакцию (рис.8).

Эффект наблюдается уже через один месяц терапии. Механизм лечебного воздействия, очевидно, связан не только с описанными ранее антиоксидантными, антигипоксическими, ангиопротекторными свойствами и антиагрегационной активностью 3-Окси-6-метил-2-этил-пиридина гидрохлорида (Регистр лекарственных средств России: энциклопедия лекарств, 2008, С.1014), но и способностью влиять на функцию гистогематических барьеров. Известно, что в основе симпатической офтальмии после травмы глаза и иммунного бесплодия лежат сходные аутоиммунные механизмы (Воробьев А.А. и соавт., 2006; Walsh T., Turek P., 2009).

Рис. 7. Снижение процента прогрессивно-подвижных сперматозоидов, покрытых антиспермальными антителами, при лечении иммунного мужского бесплодия предложенным способом (n = 27)

Рис. 8. Нормализация акросомной реакции сперматозоидов при лечении мужского иммунного бесплодия предложенным способом

Примечания: метод проточной цитофлуорометрии (Nikolaeva M.A. и соавт.,1998); АР сп - сперматозоиды, спонтанно (преждевременно) претерпевшие акросомную реакцию (норма по ESHRE, 1996 - менее 20%); АР инд. - сперматозоиды, претерпевшие акросомную реакцию, после ее индукции ионофором А23187 (норма - не менее 15%).

Использование данного препарата и предложенной схемы лечения стало предметом заявки на получение Патента РФ на изобретение, на что получено положительное решение Роспатента.

С целью установить причины развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов проанализированы клинико-анамнестические данные обследования пациентов их бесплодных пар и фертильных мужчин. Корреляционный анализ показал, что имеется значимая взаимосвязь между результатами MAR IgG-теста с одной стороны, и травмами мошонки (Gamma = 0,47; p = 0,00003) и выполненной ранее варикоцелэктомией (Gamma = 0,42; p = 0,0006).

Корреляция между степенью выраженности варикоцеле и наличием АСАТ зависит от использованного метода оценки аутоиммунных реакций и класса АСАТ: была несущественной при определении антител класса IgG и IgA на подвижных сперматозоидах методом MAR (Gamma = -0,15 и 0,08; p>0,05), но достоверной при оценке IgA на всех живых гаметах методом ПЦМ (Gamma = 0,23; p = 0,001). Разделив пациентов из бесплодных пар на случаи первичного и вторичного нарушения фертильности, установили, что корреляция статистически значима только в группе мужчин с первичными нарушениями фертильности (Gamma = 0,31; p = 0,0005); при вторичном бесплодии такая закономерность отсутствует (Gamma = 0,14; p>0,05).

Абсолютный риск развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов самый большой после перенесенных травм мошонки и достигает 78% (рис.9). Самый низкий, из числа анализируемых, при нормогонадотропной форме обс-труктивной азооспермии - 23%. Но различия между группами по распростра-ненности иммунного бесплодия статистически не достоверны (p>0,05). Более того, распространенность АСАТ в группе мужчин, у которых перечисленные факторы риска снижения фертильности отсутствуют, так же высока - 41%.

Чтобы количественно охарактеризовать относительный риск появления АСАТ и развития иммунного бесплодия при наличии перечисленных потенциальных патогенетических факторов, было проведено сравнение частоты обнаружения этих факторов у фертильных мужчин, пациентов из бесплодных пар без АСАТ на сперматозоидах (MAR IgG = 0%) и с иммунным бесплодием по ВОЗ (MAR IgG>50%). Между группами без АСАТ и с иммунным бесплодием различия статистически значимы для орхита (ОШ = 4,0; p_хи<0,001), субклини-ческих травм мошонки (ОШ = 1,9; p_хи<0,001) и варикоцелэктомии в анамнезе (ОШ = 1,1; p_хи<0,05).

Рис. 9. Выявление аутоиммунных реакций против сперматозоидов при различных факторах риска развития мужского бесплодия, %

Примечание: выделенные группы отличаются наличием только одного указанного фактора риска; пациенты, имеющие сочетание нескольких факторов риска в анализ не включены.

Это означает, что ведущим патогенетическим фактором развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов является нарушение целостности гемато-тестикулярного барьера (ГТБ), что согласуется с данными исследований, выполненных раньше (Райцина С.С., 1985; Чичинадзе Н.К., 1991; Божедомов В.А. и соавт., 1991-2004; Srinivas M. et al., 1999 и др.). Однако, в отличие от многих авторов (Heidenreich A., et al., 1994; Mazumdar M.D., Levine A.S., 1998; Walsh T., Turek P., 2009), мы не обнаружили доминирования эпидидимита и обструкции, как основных провоцирующих факторов развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов. Не ясной остается и роль в появлении АСАТ варикоцеле, что требует продолжения исследований.

Одним из факторов, приводящих к повреждению ГТБ, образованию АСАТ и иммуному бесплодию могут быть и различные инфекции (Евдокимов В. и соавт., 2000; Божедомов В. и соавт., 2004; Gubin D., et al., 1998; Comhaire F., et al., 1999). Предполагают существование иного, чем повреждение ГТБ, механизма развития антиспермального иммунитета, который связан со способностью многих бактерий, вирусов и грибов прикрепляться к мембране сперматозоидов: по мнению S.Mazumdar и A.S.Levine (1998), эти «частички» в дальнейшем могут служить как антигены или гаптены, запуская аутоиммунные реакции. На возможности перекрестных реакций указывает ассоциация иммунного бесплодия с определенными гаплотипами HLA (Walsh T., Turek P., 2009). Это верно для хламидийной инфекции - излечение приводит к снижению доли АСАТ IgG-позитивных сперматозоидов (p<0,01), уменьшению концентрации лейкоцитов (p<0,05) и улучшению подвижности (p<0,001). Но бактериальный простатит категории II не является независимым фактором, приводящим к развитию аутоиммунных реакций, потому, что исчезновение воспалительного процесса и бактериоспермии не приводит к снижению количества АСАТ даже у пациентов без орхита и травм мошонки в анамнезе (табл.3). Это согласуется с данными М.Marconi et al. (2009). Сохранение повышенных уровней АФК после лечения можно объяснить тем, что они являются не результатом воспаления, а следствием разрушения неполноценных сперматозоидов и клеток сперматогенеза, которые являются одним из главных источников АФК в сперме (Aitken R.et al., 1998; Tremellen K., 2008).

Факторами развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов на фоне инфекций является увеличение содержания в периферической крови доли и количества CD19+, CD16+ и CD8+ клеток, относительно повышенная продукция интерферонов (ИФН). При этом повышение экспрессии HLA-антигенов I и II классов на сперматозоидах у пациентов с АСАТ не наблюдается.

Таблица 3

Изменения спермограммы у пациентов с хроническим бактериальным простатитом и аутоиммунными реакциями против сперматозоидов (MAR IgG>10%) через 1 мес после завершения антибиотикотерапии, M+/-SD и n

Показатели	Исходно	Пролечены	Улучшение/всего	P
Концентрация, млн/мл	67,9+70,2	68,5+66,9	11/26	>0,05
Подвижность категории А, %	16,7+11,9	20,8+14,8	17/26	>0,05
Патологических форм, %	71,0+15,4	73,6+14,8	8/26	>0,05
Лейкоциты спермы, млн/мл	0,67+1,14	0,14+0,39*	13/26	<0,05
Активные формы кислорода, мV	2,79+4,13	2,26+2,81	18/26	>0,05
АСАТ (MAR IgG), %	57,7+38,7	54,1+40,6	13/26	>0,05

В целом, полученные данные и анализ публикаций дает основание считать, что аутоиммунные реакции против сперматозоидов, за исключением случаев клинического и субклинического орхита, не причина, а следствие плохого качества спермы, вызванного многими эндо- и экзогенными факторами. В первую очередь, генетическими, поскольку АСАТ в больших количествах имеются при первичных нарушениях фертильности и отсутствует очевидная взаимосвязь между различными традиционными патологическими состояниями и развитием аутоиммунных реакций.

Лечение мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов следует проводить в случае существенного снижения количественных показателей спермограммы, нарушения акросомальной реакции и избыточного апоптоза гамет, нарушения проникновения сперматозоидов в цервикальную слизь и оплодотворения яйцеклетки. Ведение мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов предусматривает устранение всех потенциальных этиопатогенетических факторов (инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле, обтурация, перегревание и др.), снижение продукции АСАТ, удаление АСАТ, связанных со сперматозоидами, и вспомогательные репродуктивные технологии. При лечении иммунного бесплодия целесообразно применять препараты с антиокидантным механизмом действия.

Выводы

1. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов снижают фертильность пропорционально доли подвижных гамет покрытых АСАТ. Наличие антител только на неподвижных гаметах и свободных АСАТ в семенной плазме является физиологическим механизмом, обеспечивающим элиминацию поврежденных и мертвых сперматозоидов, и оказывает слабое влияние на фертильность.

2. Преобладающими этиологическими факторами развития аутоиммунных реакций против сперматозоидов являются орхит (АР = 78%, ОШ = 4,0), механические травмы мошонки (АР = 59%, ОШ = 1,84), варикоцеле (АР = 54%, ОШ = 1,1).

3. Патогенез иммунного бесплодия связан с повреждением гемато-тестикулярного барьера и нарушением иммунопривилегированности гамет. Инфекционно-воспалительные заболевания приводят к появлению АСАТ в результате иммуноопосредованных механизмов.

4. Существует прямая зависимость между процентом АСАТ-позитивных сперматозоидов и долей мужских гамет с признаками апоптоза (фрагментация ДНК) и/или нарушенной акросомной реакцией. Важную роль в нарушении функций сперматозоидов на фоне аутоиммунных реакций является гиперпродукция активных форм кислорода и снижение антиокислительных свойств спермиоплазмы.

5. Препараты с выраженным антиоксидантным действием, стабилизирующие мембраны на фоне избытка активных радикалов, способствуют освобождению гамет от антител и восстановлению их функций.

6. Ведение мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов предусматривает устранение всех возможных этиопатогенетических факторов (инфекции репродуктивного тракта, варикоцеле, обтурация, перегревание и др.), снижение продукции АСАТ, удаление АСАТ, связанных со сперматозоидами, и вспомогательные репродуктивные технологии.

Практические рекомендации

Определение АСАТ является обязательным при обследовании мужчин из бесплодных пар, в т.ч. при подготовке к ЭКО и ПЭ.

Для оценки фертильности должны применяться прямые методы определения АСАТ на поверхности подвижных сперматозоидов (MAR и IBT).

У пациентов с АСАТ должны проводиться исследования продукции АФК, акросомной реакции и целостности хроматина сперматозоидов.

Обнаружение АСАТ только на неподвижных сперматозоидах и/или в семенной плазме не связано со снижением реальной фертильности и не требует лечения.

Профилактика аутоиммунных реакций против сперматозоидов предусматри-вает избегание травматизации яичка, инфекционно-воспалительных заболеваний и непрходимости семявыносящего тракта.

При лечении мужского иммунного бесплодия могут применяться препараты с антиоксидантным, антигипоксическими, ангиопротекторными свойствами и антиагрегационной активностью (например, 3-Окси-6-метил-2-этил-пиридина гидрохлорид).

Лечение хламидиоза способствует уменьшению доли прогрессивно подвижных АСАТ-позитивных сперматозоитов у мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидами. Хронический бактериальный простатит не связан с появлением АСАТ, поэтому данный фактор может не учитываться.

Система ведения бесплодных мужчин с аутоиммунными реакциями против сперматозоидов предусматривает:

клинико-лабораторное обследование до начала терапии, включающее определение АСАТ на подвижных сперматозоидах (методы MAR и IBT), продукции АФК, АР и дисперсии хроматина/фрагментации ДНК;

устранение всех этиопатогенетических факторов (обтурация, ИРТ, варикоцеле, перегревание и др.);

консервативная терапия, направленная на снижение уровней АСАТ и улучшение количественных показателей спермограммы;

при отсутствии успеха консервативной терапии - вспомогательные репродуктивные технологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Божедомов В.А., Николаева М.А., Ушакова И.В., Мингболатов А.Ш., Александрова Л.М., Липатова Н.А., Голубева Е.Л., Теодорович О.В., Сухих Г.Т. Роль процессов свободно-радикального окисления в патогенезе мужского иммунного бесплодия//Андрология и генитальная хирургия, 2010, №4.- С.62-66.

2. Божедомов В.А., Мингболатов А.Ш., Николаева М.А., Сухих Г.Т. Способ лечения иммунного бесплодия // Заявка на выдачу патента Российской Федерации на изобретение. Регистрационный №2010111433/15 (016111), положительное решение от 03.02.2011.

3. Божедомов В.А., Николаева М.А., Голубева Е.Л., Ушакова И.В., Липатова Н.А., Александрова Л.М., Логинова Н.С., Матвеева Н.К., Мингболатов А.Ш., Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т. Этиопатогенез аутоиммунных реакций против сперматозоидов // IV Международный конгресс по репродуктивной медицине / Под ред. Г.Т. Сухих, Л.В. Адамян.- М., 2010.- С.267-277.

4. Божедомов В.А., Мингболатов А.Ш., Александрова Л.М., Торопцева М.В., Николаева М.А., Теодорович О.В. Лечение мужского аутоиммунного бесплодиия: консервативная терапия или ЭКО И ПЭ? // Всероссийский конгресс «Амбулаторно-поликлиническая практика - новые горизонты», Москва, 29 марта-2 апреля, 2010.- С.45-46.

5. Божедомов В.А., Липатова Н.А., Мингболатов А.Ш., Ушакова И.В., Торопцева М.В., Голубева Е.Л., Александрова Л.М., Сухих Г.Т. Роль оксидативного стресса сперматозоидов в патогенезе мужского бесплодия // Материалы Международного конгресса по андрологии / Пятого конгресса Профессиональной ассоциации андрологов России 16-23 мая 2010, Тунис, Сусс.- С.83.

6. Божедомов В.А., Николаева М.А., Голубева Е.Л., Ушакова И.В., Липатова Н.А., Александрова Л.М., Логинова Н.С. Логинова, Н.К.Матвеева, Мингболатов А.Ш., Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов: данные обследования 3329 мужчин из бесплодных пар.// Материалы ХХ международной конференции Российской ассоциации репродукции человека «Репродуктивные технологии сегодня и завтра», 6-8 сентября 2010 г., Нижний Новгород, 2010.- С.58.

7. Божедомов В.А., Николаева М.А., Мингболатов А.Ш., Голубева Е.Л., Ушакова И.В., Липатова Н.А., Александрова Л.М., Логинова Н.С. Логинова, Н.К. Матвеева, Файзуллин Л.З. Мужское иммунное бесплодие: новые данные о патогенезе и возможностях лечения.// Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и дитя», 28 сентября - 1 октября 2010 г., Москва, 2010.- С.316-317.

8. Божедомов В.А., Николаева М.А., Мингболатов А.Ш., Голубева Е.Л., Ушакова И.В., Липатова Н.А., Александрова Л.М., Логинова Н.С., Матвеева Н.К., Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов: эпидемиология, этиопатогенез, диагностика, лечение // Тезисы II урологической конференции ФМБА: Актуальные вопросы урологии, 14-15 октября 2010 г.- С.45-47.

9. Божедомов В.А., Николаева М.А., Мингболатов А.Ш., Голубева Е.Л., Ушакова И.В., Липатова Н.А., Александрова Л.М., Логинова Н.С., Матвеева Н.К., Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т. Аутоиммунные реакции против сперматозоидов: эпидемиология, этиопатогенез, диагностика, лечение // Материалы форума «Мужское здоровье и долголетие»; 9-я международная медицинская выставка. Москва, 16-17 февраля 2011.- С.20-21.

Размещено на Allbest.ru

...