Особенности ультраструктурных перестроек кардиомиоцитов миокарда молодых крыс с алиментарным ожирением на фоне введения криоконсервированного препарата кордовой крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАСТРУКТУРНЫХ ПЕРЕСТРОЕК КАРДИОМИОЦИТОВ МИОКАРДА МОЛОДЫХ КРЫС С АЛИМЕНТАРНЫМ ОЖИРЕНИЕМ НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННОГО ПРЕПАРАТА КОРДОВОЙ КРОВИ

Чернявская Е.А., Невзоров В.П., Бабийчук В.Г., Мартынова Ю.В., Кулик В.В.

Резюме. Целью исследования было изучить динамику изменений ультраструктурной архитектоники кардиомиоцитов миокарда молодых крыс с алиментарным ожирением на фоне введения криоконсервированного препарата ядросодержащих клеток кордовой крови. Моделирование алиментарного ожирения осуществляли по методике В, Г. Баранова путем содержания животных на гиперкалорийном рационе. Размороженный препарат ядросодержащих клеток кордовой крови человека, вводили внутрибрюшинно, однократно. В ходе исследования было установлено, что ультраструктурная организация кардиомиоцитов миокарда молодых контрольных животных характеризовалась высокой метаболической активностью э тих клеток. У молодых крыс с алиментарным ожирением развиваю тс я ка та болические процессы, с труктурно проявляю - щиеся в появлении в цитоплазме кардиомиоцитов включений липидов, липофусцина и вторичных лизосом. Через сутки после введения препарата молодым животным с ожирением наблюдается умеренное повышение метаболической и репаративной активности в кардиомиоцитах миокарда, о чем свидетельствует увеличение полисом, рибосом и гранул гликогена, а также снижение количества вторичных лизосом, включений липидов и липофусцина. Описанные изменения сохраняются в отдаленные сроки экспериментальных исследований.

Ключевые слова: алиментарное ожирение, ядросодержащие клетки кордовой крови, кардиомиоциты, митохондрии, крысы.

Summary. The study is important due to insufficient investigation of amniotic membrane transplantation efficiency in bacterial keratitis. The objective was to study in the experiment features of anti-inflammatory action of viable cryopreserved human amniotic membrane on the model of bacterial keratitis using different surgical techniques. Transplantation of viable cryopreserved amniotic membrane was performed in 30 Chinchilla rabbits on the developed model of bacterial keratitis using inlay technique. In one month after transplantation in several rabbits corneal edema infiltration and vascularization were found. At the same depth of the corneal destruction by bacterial infectious process biological covering technique should be preferred as less traumatic surgical intervention, which is accompanied by a lower inflammatory response.

Key words: bacterial keratitis, cryopreserved amniotic membrane, experiment.

Ожирение без преувеличения можно назвать эпидемией мирового масштаба, поскольку количество лиц, как среди взрослого, так и среди детского населения, которые имеют избыточную массу тела, постоянно увеличивается [3]. Ожирение является хроническим полиэтиологическим заболеванием, связанным с влиянием ряда генетических и неврологических факторов, изменением функций эндокринной системы, стилем жизни и пищевым поведением пациента, а также с нарушением энергетического баланса [6]. Особенно неблагоприятным в прогностическом плане является алиментарное ожирение (АО). К наиболее частым болезням, которые ассоциируются с АО относят артериальную гипертензию, нарушение углеводного обмена, сердечную и дыхательную недостаточность и др. [4] Ожирение считается неинфекционной эпидемией XXI века в связи с высоким риском развития сердечно-сосудистой патологии, ранней инвалидизацией и преждевреоригінальні дослідження временной смертью больных [5].

В научной и клинической практике накоплена значительная информация о положительном влиянии кордовой крови, как на разные органы, системы, клеточные культуры, так и на организм в целом. Благодаря своему биохимическому составу кордовая кровь является уникальной субстанцией с разнонаправленной биологической активностью [2].

К настоящему времени исследования, касающиеся изучения механизмов действия препаратов, полученных из кордовой крови на адаптационно-компенсаторные резервы организма экспериментальных животных при АО, отсутствуют. Поэтому большой теоретический и практический интерес представляет возможность коррекции нарушений гомеостаза организма экспериментальных животных при АО с помощью применения криоконсервированного препарата ядросодержащих клеток кордовой крови (ЯСК КК).

В связи с вышеизложенным, целью исследования было изучить динамику изменений ультраструктурной архитектоники кардиомиоцитов миокарда молодых крыс с моделированным АО на фоне введения ЯСК КК.

Материалы и методы

Исследования выполнены на белых 6 месячных беспородных крысах-самцах. Эксперименты на животных проведены в соответствии с Общими принципами работы на животных, одобренными 1-м Национальным конгрессом по биоэтике (Киев, Украина, 2001) и согласованными с положением Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, Франция, 1985).

Все животные были разделены на 3 группы: 6 месячные интактные крысы;6 месячные контрольные крысы с моделью АО; 6 месячные крысы с АО на фоне применения ЯСК КК. Забор материала у экспериментальных животных осуществлялся на следующие сутки, а также через месяц после введения ЯСК КК.

Моделирование АО осуществляли по методике В.Г. Баранова путем содержания животных на гиперкалорийном рационе [1]. Наличие ожирения определялось по достоверному увеличению весоростового показателя - индекса Ли, который является точным математическим показателем степени ожирения у крыс и определяется по формуле:

инсулин кровь ожирение миокард

Длина от носа до анального отверстия, (в см)

Величина индекса более 300 свидетельствует о наличии ожирения.

Препарат представляет собой взвесь криоконсервированных ЯСК КК в аутоплазме с концентрацией стволовых CD34+ клеток 2 - 4х10⁵ в 1 мл. Размороженный препарат ЯСК КК человека, вводили внутрибрюшинно, однократно в дозе 3x10⁵ CD34+ клеток на килограмм веса животных.

Животных выводили из эксперимента путем декапитации на следующие сутки и через месяц после введения ЯСК КК, производя забор кусочков ткани миокарда для электронно-микроскопического исследования.

Предварительную фиксацию проводили в глютарово-формальдегидном фиксаторе при температуре 4°С в течении 5-6 часов. Затем кусочки миокарда переносили в 1%-ный забуференный раствор четырехокиси осмия на 3-4 часа при температуре 4°С для окончательной фиксации. В дальнейшем ткань обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали в смеси эпоксидных смол (эпон-аралдит) и заключали в блоки по стандартным методикам. Полимеризацию блоков проводили в термостате при 60°С в течении двух суток.

Из полученных блоков, на ультрамикротоме УМТП-ЗМ, изготавливали ультратонкие срезы, монтировали их на электролитические сеточки и, после контрастирования цитратом свинца, изучали под электронным микроскопом ЭМВ-100 БР при ускоряющем напряжении 75 кв.

Результаты. Обсуждение

Электронно-микроскопическое исследование кардиомиоцитов интактных животных показало, что их ядра имели вытянутую форму, а также типичную локализацию в саркоплазме. Ядерная мембрана была с множественными мелкими деформациями. Ядерный хроматин находился преимущественно в деконденсированной форме и его гранулы равномерно распределялись по площади среза ядра. Довольно часто встречались ядра, мембрана которых образовывала глубокие инвагинации. Очаги разрыхления и лизиса отсутствовали. Перинуклеарные пространства имели постоянную ширину. В перинуклеарной области кардиомиоцитов располагались цистерны саркоплазматического ретикулума и Т-системы, заполненные тонковолокнистой субстанцией средней электронной плотности. Наблюдался полиморфизм форм и размеров митохондрий: одни из них содержали неравномерно контрастированный матрикс (рис. 1), другие электронноплотный с многочисленными кристами.

Матрикс митохондрий обладал, в целом, мелкозернистой структурой и средней электронной плотностью. Отдельные кардиомиоциты имели митохондрии, находящиеся в стадии деления, о чём свидетельствует их "гантелевидная" форма и перетяжки. Митохондрии, как с электронно-плотным матриксом, так и с электронно-прозрачным, содержали большое количество параллельно ориентированных крист. В саркоплазме кардиомиоцитов молодых животных включения липидов и липофусцина, а также вторичные лизосомы обнаруживались очень редко.

Рис. 1. Ультраструктура кардиомиоцитов интактных молодых крыс. х37000. Контрастировано цитратом свинца

У молодых крыс с моделью АО в субмикроскопи ческой архитектонике кардиомиоцитов присутствовали дистрофические и деструктивные изменения органелл. Матрикс ядер имел низкую электронную плотность. На фоне интактных животных возрастало количество глыбок конденсированного хроматина, которые концентрировались в области саркоплазмы, прилежащей к ядерной мембране. Деконденсированный хроматин располагался в центральной части матрикса ядра. Эта область матрикса ядра обладала низкой электронной плотностью. Ядерная мембрана образовывала мелкие и глубокие инвагинации. Наблюдалось разрыхление мембраны и очаги её разрушения. Встречались ядра с тотально разрушенными ядерными мембранами. В саркоплазме располагалось небольшое количество органелл, полисом, рибосом, гранул гликогена. Изменения митохондрий носили полиморфный характер. Часть имела электронно-прозрачный матрикс, в котором располагались единичные, разрыхлённые кристы, а в саркоплазме других обнаруживались очаги лизиса наружных мембран и крист (рис. 2). Довольно часто обнаруживались дегенеративно измененные митохондрии, с гомогенизированным матриксом и тотально разрушенными кристами.

Рис. 2. Ультраструктура кардиомиоцитов молодых крыс с АО. Очаговый лизис наружных мембран митохондрий. х37000. Контрастировано цитратом свинца.

В саркоплазме кардиомиоцитов присутствовали мелкие и крупные включения липидов и липофусцина, вторичные лизосомы, которые располагались вблизи пластинчатого цитоплазматического комплекса Г ольджи.

На следующие сутки после введения молодым крысам с АО препарата ЯСК КК в субмикроскопической архитектонике кардиомиоцитов присутствовали, как дистрофические, так и деструктивные нарушения органелл и мембран. Сохранялась низкая электронная плотность матрикса ядер кардиомиоцитов. Несколько снижалось количество глыбок конденсированного хроматина, концентрирующихся на ядерной мембране. Деконденсированный хроматин и рибосомы располагались в центральной части матрикса ядра, которая обладала низкой электронной плотностью. Ядерная мембрана с мелкими и глубокими инвагинациями была разрыхлена и имела очаги разрушения. Сохранялось большое количество ядер с тотально разрушенными ядерными мембранами. Перинуклеарные пространства неравномерно расширялись и имели вид электронно- прозрачных вакуолей. В саркоплазме располагалось небольшое, в сравнении с группой молодых интактных животных, количество органелл, полисом, рибосом и гранул гликогена. В целом митохондрии содержали укороченные и дезорганизованные кристы. Обнаруживались митохондрии с большим количеством крист и чётко контурированными наружными мембранами (рис. 3).

Рис. 3. Ультраструктура кардиомиоцитов молодых крыс с АО на следующие сутки после введения ЯСК КК. Плотно упа-кованные кристы митохондрий. х43000. Контрастировано цитратом свинца.

В саркоплазме кардиомиоцитов молодых крыс с АО через сутки после введения препарата сохранялись мелкие и крупные включения липидов и липофусцина, а также вторичные лизосомы. Саркоплазматическая мембрана имела разрыхленный вид и очаги разрушения.

Рис. 4. Ультраструктура кардиомиоцитов молодых крыс с АО через месяц после введения ЯСК КК. Мелкие инвагинации ядерной мембраны. х 34 000. Контрастировано цитратом свинца

Снижается степень набухания митохондрий и возрастает количество крист, что свидетельствует о некотором уменьшении глубины выраженности митохондриальной дисфункции. Также в кардиомиоцитах практически отсутствуют тотальные разрушения внутриклеточных мембран и наблюдается умеренное повышение метаболической и репаративной активности, свидетельством чего является увеличение количества полисом, рибосом и гранул гликогена, а также снижение числа вторичных лизосом, включений липидов и липофусцина. Однако полного восстановления типичной субмикроскопической архитектоники кардиомиоцитов не наступает.

Через месяц после введения ЯСК КК субмикроскопическая архитектоника кардиомиоцитов молодых крыс с АО в основном имела признаки высокой метаболической активности на уровне внутриклеточных мембран и органелл. Небольшая часть кардиомиоцитов сохраняла изменения, характерные для умеренно выраженного дистрофического процесса. Матрикс ядер кардиомиоцитов сохранял низкую электронную плотность. Глыбки конденсированного хроматина располагались преимущественно в области, прилежащей к ядерной мембране. В матриксе ядра определялось умеренное количество рибосом и гранул деконден- сированного хроматина. Ядерная мембрана образовывала небольшое количество глубоких и мелких инвагинаций и содержала мелкие очаги разрыхления. Деструкции ядерной мембраны практически отсутствовали (рис. 4). Перинуклеарные пространства имели участки локального расширения, имеющего вид электронно-прозрачных везикул.

В сравнении с группой молодых крыс с АО количество органелл, рибосом, гранул гликогена в кардиомиоцитах существенно возрастало. Тем не менее, саркоплазма обладала низкой электронной плотностью. Большая часть митохондрий имела множество параллельно ориентированных крист и чётко контурируе- мую наружную мембрану. В препаратах нередко наблюдались митохондрии с локальным просветлением матрикса, имеющие "гантелевидную" форму с перетяжками. В кардиомиоцитах этой группы экспериментальных животных сохранялась значительная потеря электронной плотности саркоплазмы. В ней иногда выявлялись включения липидов, липофусцина и вторичные лизосомы. Цистерны саркоплазматического ретикулума и Т-системы были расширены, имели различную форму и размеры, а также были заполнены электронно- прозрачной субстанцией.

Таким образом, у молодых крыс с АО через месяц после введения ЯСК КК уровень дистрофических процессов в кардиомиоцитах существенно снижается, что структурно подтверждается отсутствием очагов деструкции мембран и крист митохондрий, саркоплазматического ретикулума, саркоплазматической мембраны, а также уменьшением в саркоплазме количества включений липидов и липофусцина.

Выводы и перспективы дальнейших разработок

1. Ультраструктурная организация кардиомиоцитов миокарда молодых контрольных животных свидетельствует о высокой метаболической активности этих клеток.

2. У молодых крыс с АО развиваются катаболические процессы, структурно проявляющиеся появлением в цитоплазме кардиомиоцитов включений липидов, липофусцина и вторичных лизосом.

3. Через сутки после введения ЯСК КК у молодых крыс с АО в кардиомиоцитах наблюдается умеренное повышение метаболической и репаративной активности, за счет увеличения количества полисом, рибосом и гранул гликогена, а также снижения количества вторичных лизосом, включений липидов и липофусцина.

4. У молодых животных с АО через месяц после введения ЯСК КК уровень дистрофических процессов в кардиомиоцитах существенно снижается, что структурно выражается в отсутствии очагов деструкции мембран и крист митохондрий, саркоплазматического ретикулума, саркоплазматической мембраны, а также уменьшением в саркоплазме количество включений липидов и липофусцина.

В дальнейших исследованиях планируется провести гистохимическую оценку состояния коллагеновых и эластических волокон в тканях миокарда молодых и старых животных с АО на фоне введения криоконсервированного препарата ЯСК КК.

Список литературы

1. Баранов В.Г. Чувствительность к инсулину, толерантность к глюкозе и инсулиновая активность крови у крыс с алиментарным ожирением / В.Г. Баранов, Н.Ф. Баранов, М.Ф. Беловинцева //Проблемы эндокринологии.- 1972. - Т.6. - С.52-58.

2. Динамика ультраструктурных перестроек кардиомиоцитов миокарда молодых крыс в процессе развития и прогрессирования неврогенной артериальной гипертензии /Л.В. Бабийчук, В.П. Невзоров, О.Ф. Невзорова [и др.] // Харківська хірургічна школа.-2012.-№5(56).- С.24-29.

3. Лещенко И.В. Ендокринна функція підшлункової залози у щурів за умов експериментального ожиріння /И.В. Лещенко, В.Г. Шевчук, О.А. Савченюк [и др.]// Фізіологічний журнал.- 2014.-Т.60,№1.-С.41-48.

4. Лупанов В.П. Ожирение как фактор риска развития сердечно-сосудистых катастроф/ В.П. Лупанов //Российский медицинский журнал.- 2003. - Т.11, №6. - С. 331-337.

5. Перетолчина Т.Ф. Ожирение и морфофункциональные изменения сердца/ Т.Ф. Перетолчина, С.Ю. Дашу- тина, С.С. Барац //Кардиология.- 2005. - №7.- С. 66-68.

Размещено на Allbest.ru