Патогенетичний зв'язок дисбалансу ізоформ синтази оксиду азоту в панкреатичних острівцях підшлункової залози із хронічною пренатальною гіперглікемією

Размещено на http://www.allbest.ru/

Запорізький державний медичний університет

Патогенетичний зв'язок дисбалансу ізоформ синтази оксиду азоту в панкреатичних острівцях підшлункової залози із хронічною пренатальною гіперглікемією

О.В. Ганчева, Ю.М. Колесник, Ю.І. Вородєєва

Нашими попередніми дослідженнями встановлено: хронічна гіперглікемія плода, що змодельована за допомогою експериментального гестаційного діабету (ЕГД) у самиць щурів, призводить у їхніх статевозрілих нащадків до формування гіперліпідемії, гіперхолестеринемії, гіпертригліцеридемії, гіперглікемії, гіперінсулінемії, порушення тесту толерантності до глюкози за діабетичним типом, змін у цитоархітектониці панкреатичних острівців (ПО) зі зменшенням у них чисельності бета-клітин, зниженням концентрації та вмісту інсуліну [1,2]. Описані порушення глюкозного гомеостазу у тварин прогресували з віком і були подібні до лабораторних показників і клінічних симптомів цукрового діабету 2 типу людини [3]. Імовірно, вплив несприятливих пренатальних факторів на плід [4,5], зокрема надлишок нутрієнту глюкози, викликає порушення нормального морфогенезу ПО, синтетичної та секреторної активності p-клітин інсулярного апарату підшлункової залози із розвитком стійких перебудов у глюкозному гомеостазі.

Відомо, що підтримання нормального глюкозного гомеостазу залежить передусім від трьох основних процесів: синтезу і секреції інсуліну p-клітинами, засвоєння глюкози периферичними тканинами, синтезу глюкози печінкою. До порушення синтезу й секреції інсуліну p-клітинами призводять дефекти внутрішньоострівцевих взаємин ендокриноцитів, зміни на рівні p-клітин ПО, інсулінового рецептору або внутрішньоклітинних вторинних месенджерів [6,7]. Серед відомих дефектів p-клітин, що можуть призводити до перебудов глюкозного гомеостазу, слід відзначити порушення кінетики виділення інсуліну та внутрішньоострівцевих паракринних взаємин, зниження інсулінової відповіді на глюкозне навантаження, зменшення популяції р-клітин у ПО. При цьому, незалежно від механізму формування дефекту, спостерігатиметься порушення толерантності до глюкози, розвиток інсулінорезистентності та, як наслідок, стійка гіперглікемія натще [8].

У процесі пошуку можливого «претендента» на роль ключового патогенетичного регулятора паракринних взаємин, котрий бере участь як у фізіологічних, так і патологічних процесах, ми звернули увагу на систему монооксиду азоту (NO). Інтерес до її вивчення зумовлений тим, що широкий спектр загальнобіологічної дії NO включає в себе не тільки регуляторну й захисну дію, але і цілий спектр патологічних реакцій. Нині вже доведено, що з порушенням біосинтезу та метаболізму NO пов'язані такі захворювання, як ішемічна хвороба серця, інфаркт міокарда, артеріальна гіпертензія, бронхіальна астма, нейродегенеративні захворювання (хвороба Альцгеймера, хвороба Паркінсона), цукровий діабет, метаболічний Х-синдром [9,10]. Той безперечний факт, що при цілому ряді захворювань, у патогенезі розвитку котрих наявні порушення вуглеводного та жирового обмінів, виявлені зміни в системі моноксиду азоту [11], безпосередньо балансу та активності ізоформ ферменту синтази оксиду азоту (NOS), що беруть участь в його утворенні, служить для нас ще одним підтвердженням правильності напряму в дослідженнях.

Мета роботи

Вивчити патерн експресії ендотеліальної, індуцибельної та нейрональної NO-синтаз у панкреатичних острівцях підшлункової залози нащадків самок з ЕГД у препубертатному періоді.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження здійснили на 20 самцях щурів лінії Wistar віком 3 місяці, яких поділили на дві групи. До першої групи ввійшли 10 самців щурів, нащадків самиць із нормальною вагітністю, до другої 10 нащадків самиць із ЕГД [12]. Експериментальну частину дослідження виконували в суворій відповідності з національними «Спільними етичними принципами експериментів на тваринах» (Україна, 2001), котрі узгоджуються з положеннями « Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985) і «Положенням про використання тварин у біомедичних дослідженнях».

Для аналізу стану системи NO в гістологічних зрізах панкреатичних острівців здійснили комплекс гістота імуноцитохімічних досліджень. З метою дослідження патернів експресії ізоформ NOS гістологічні зрізи розподілили на 3 групи: першу групу зрізів інкубували з кролячими IgG до нейрональної NOS (nNOS) (Santa Cruz Biotechnology, USA) у розведенні 1:200; другу групу зрізів інкубували з кролячими IgG до ендотеліальної NOS (eNOS) (Santa Cruz Biotechnology, USA) у розведенні 1:200; третю групу зрізів інкубували з мишачими IgG до індуцибельної NOS (iNOS), кон'югованої з FITC (Santa Cruz Biotechnology, USA) у розведенні 1:200.

Скельця з нанесеними первинними антитілами тримали в полімерних фіксаторах при (Т=+4^оС, 24 години). Потім тричі по 10 хв відмивали фосфатним буфером 0,1 М (рН 7,2). На другому етапі на скельця першої та другої груп наносили вторинні мишачі IgG до повної молекули IgG кроля, кон'юговані з FITC (Santa Cruz Biotechnology, USA) у розведенні 1:200 і тримали при (Т=+37^оС, 45 хв), промивали тричі по 10 хв фосфатним буфером й укладали в суміш гліцерин/фосфатний буфер (9:1). Скельця з третьої групи після триразового промивання у фосфатному буфері укладали в суміш гліцерин/фосфатний буфер (9:1).

Для окремої ідентифікації панкреатичних острівців відмиті від вторинних антитіл зрізи підшлункової залози підфарбовували гематоксиліном (рис. 1А).

Вивчення зрізів, що пофарбовані на ізоформи NOS, здійснювали в ультрафіолетовому спектрі збудження 390 нм за допомогою світлофільтра 38НЕ з високою емісією (Carl Zeiss, ФРН) на мікроскопі AxioImager-M2 (Carl Zeiss, ФРН). Зображення, що отримували за допомогою 8-бітної відеокамери AxioCam-ERc 5s (Carl Zeiss, ФРН), записували у вигляді комп'ютерного файлу. Аналіз зображення здійснювався в напівавтоматичному режимі за допомогою програмного забезпечення з відкритим кодом ImageJ (National Institutes of Health, USA). У мікрозображеннях, котрі отримали при дослідженні ПО, в інтерактивному режимі визначали зони значущої флуоресценції, на яку накладалася «маска». У нашому випадку це дало можливість виключити області екзокринної тканини підшлункової залози та великі судини (рис. 1В). У ході автоматичного цифрового аналізу зображення ПО визначали:

Питому площу імунореактивного матеріалу (ІРМ) до досліджуваної ізоформи NOS (S_IM, %), котру розраховували за формулою:

^SiM=(a^SiM ¦

де aS_IM абсолютна площа флуоресценції, імунореактивної до ізоформи ферменту NOS, мкм²;

S_M абсолютна площа «маски», мкм².

Сумарній вміст імунореактивного матеріалу до ізоформи ферменту у площі «маски» з урахуванням фонового світіння (В_ІМ, Одіф), який розраховували за формулою:

^BiM=^sBiM ^(Ff ¦ ^SmX

де s В_ІМ сумарний вміст флуоресценції в площі «маски», Одіф;

Ff середня фонова флуоресценція, Одіф/мкм2;

S_M абсолютна площа «маски», мкм².

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1А Панкреатичний острівець підшлункової залози щура, підфарбований гематоксиліном

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1В Реакція непрямої імунофлуоресценції з антитілами до eNOS. х400

На підставі цих показників судили про патерн експресії ізоформи NOS, її локалізацію у структурах ПО, визначали сумарний вміст ферменту у площі зрізу ПО та відносну площу ІРМ.

Статистично опрацювали результати методом варіаційної статистики «Statistica 11.0» (StatSoft Іпс, США) за загальноприйнятою методикою. Характер розподілу показників перевіряли з використанням критерію Шапіро-Уїлка. Для порівняння груп із нормальним розподілом даних використовували t-критерій Стьюдента. Дані представлені у вигляді середнього арифметичного та стандартної похибки репрезентативності середнього значення. Статистично значущими вважали відмінності при p_st<0,05.

Результати та їх обговорення

У ході дослідження розподілу експресії ізоформ NOS в ПО у щурів першої контрольної групи встановили, що максимальна відносна площа ІРМ була притаманною для eNOS, водночас як найбільший вміст ферменту був характерним для 1NOS (табл. 1).

Аналіз розподілу експресії ізоформ ферменту NOS у щурів другої групи нащадків самиць із ЕГД препубертатного віку дав змогу встановити багато відмінностей. Так, патерн експресії nNOS відрізнявся вірогідно більшим вмістом ферменту в ПО на 77% (p_st<0,05), у той час як відносна площа ІРМ до nNOS вірогідно не відрізнялась від показників контрольної групи (табл. 1).

Патерн експресії еNOS у щурів нащадків самиць із ЕГД, мав найбільші відмінності та характеризувався суттєвим збільшенням обох досліджуваних показників. При цьому відносна площа експресії еNOS та її вміст на 38% (p_st<0,05) і 90% (p_st<0,05), відповідно перевищували показники контрольної групи (табл. 1 ).

Експресія 1NOS форми ферменту в щурів другої групи відрізнялась вірогідним, у порівнянні із показником контролю, збільшенням площі ІРМ до 1NOS на 45% (Pst<0,05), у той час як вміст ферменту відповідав показнику контролю.

Порівняльний аналіз розподілу усіх трьох ізоформ NOS в ПО засвідчив: у контрольних щурів найбільша площа ферменту була характерна для еNOS, у той час як вміст ІРМ був найбільшим для 1NOS. На відміну від контролю, хронічна гіперглікемія плода призводить до зміни характеру експресії ферментів і характеризується більшим вмістом ІРМ до nNOS, площі ІРМ до 1NOS та максимальними, порівнюючи зі всіма показниками експресії ізоформ, значеннями площі та вмісту ІРМ до еNOS (табл. 1).

Таблиця 1

Експресія ізоформ NOS у панкреатичних острівцях підшлункової залози щурів (M±m)

Примітки: ¹ вірогідна (p_st<0,05) різниця в порівнянні з відповідним показником контрольної групи;

² вірогідна (p_st<0,05) різниця в порівнянні з відповідним показником nNOS;

³ вірогідна (p_st<0,05) різниця в порівнянні з відповідним показником eNOS.

Такі високі показники експресії саме ендотеліальної форми ферменту NOS у нащадків самиць з ЕГД, на нашу думку, пов'язані із значною синтетичною та секреторною активністю бета-клітин і відповідному до підвищених потреб збільшенню кровопостачання ПО. Підтвердженням цього факту є результати попереднього дослідження [1,2], в котрому встановили, що у нащадків самок з ЕГД у різні вікові періоди спочатку на тлі еуглікемії розвивається гіперінсулінемія, підвищення рівня С-пептиду із порушенням толерантності до глюкози, а надалі гіперглікемія натще на тлі швидкого та надмірного збільшення загальної маси щурів. Слід також відзначити, що віковий морфогенез ПО у тварин у пубертатному періоді (4-місячний вік) характеризувався вищими показниками площі ПО та вмісту в ньому інсуліну [1,2].

У ході численних експериментальних та епідеміологічних досліджень, котрі здійснені іншими науковцями, виявлений зв'язок між захворюваністю на цукровий діабет 2 типу, ожирінням, метаболічним синдромом у дорослому житті та патологією внутрішньоутробного періоду розвитку [4,5]. Це пояснюється тим, що організм плода у пренатальному періоді є дуже чутливим до дії факторів як внутрішнього, так і зовнішнього середовища. Різного роду зовнішні впливи на плід, такі як гіпоабо гіперглікемія, білкова недостатність, пренатальний стрес, можуть призводити до нейроендокринних змін дизрегуляторного характеру і надалі до порушення контролю гомеостазу глюкози на рівні P-клітин панкреатичних острівців [4,5]. При цьому прояв захворювань може спостерігатися не тільки відразу після народження або в перші роки життя, але і в зрілому віці на тлі стресу, адинамії, переїдання, ендокринних патологій.

Імовірно, порушення харчування плода в останньому триместрі вагітності порушує не тільки нормальне програмування функції p-клітин, але й змінює баланс експресії ізоформ NOS у ПО підшлункової залози, що, на нашу думку, на початку життя має компенсаторний характер, але згодом може стати причиною формування цукрового діабету у зрілому віці.

Висновки

Хронічна гіперглікемія плода внаслідок гестаційного діабету матері призводить до порушення співвідношення патернів експресії нейрональної, ендотеліальної та індуцибельної ізоформ NOS у панкреатичних острівцях підшлункової залози, характеризується підвищеним вмістом ІРМ до nNOS, збільшенням площі ІРМ до 1NOS та максимальними, порівнюючи зі всіма показниками експресії ізоформ, значеннями площі та вмісту ІРМ до еNOS.

Перспективи подальших досліджень полягають у тому, що встановлений взаємозв'язок дисбалансу експресії ізоформ синтази монооксиду азоту в ПО з пренатальною гіперглікемією та порушенням функції інсуліноцитів у препубертатному віці вимагає вивчення розподілу експресії ферменту в більш віддалені вікові періоди та на тлі сформованої ендокринної патології.

Список літератури

1. Колесник Ю.М. Роль гестационного диабета у крыс линии Вистар в метаболических нарушениях у потомства / Ю.М. Колесник, О.В. Ганчева, А.М. Камышный // Запорожский медицинский журнал. 2005. Т 30. №3. С. 107.

2. Грекова Т А. Влияние пренатальной гипергликемии на состояние альфа-, бета-, дельтаи амилинсинтезирующих клеток островков Лангерганса самцов крыс в возрастной динамике / Т.А. Грекова, Ю.М. Колесник, О.В. Ганчева // Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи (Дев'яті Данилевські читання): матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю. Харків, 2010. С. 31-32.

3. Consensus Statement Updated on Management of Hyperglycemia in Type 2 Diabetes // Diabetes Care. 2008. №31. Р. 1-11.

4. Абрамов А.В. Особенности влияния хронического пренатального стресса на структурно-функциональную организацию бета-эндокриноцитов / А.В. Абрамов, М.А. Тихоновская, Ю.М. Колесник // Клінічна та експериментальна патологія. 2004. Т 3. №2. С. 176-179.

5. Macrosornia despite good glycemic control in type I diabetic pregnancy; results of a nationwide study in The Netherlands / M. Evers, H.W. Valk, B.W.L. Mol et al. // Diabetologia. 2002. Vol. 45. №3. P. 1484-1489.

6. Ozanne S.E. Metabolic programming in animals / S.E. Ozanne // Brit. Med. Bull. 2001. Vol. 60. Р 143-152.

7. Birth weight, type 2 diabetes, and insulin resistance in Pima Indian children and young adults / D. Dabella, R.L. Hanson, G. Imperatore et al. // Diabetes Care. 1999. Vol. 22. №6. Р 944-950.

8. Development of P-cell mass in fetuses of rats deprived of protein and/оf energy in last trimester of pregnancy / E. Berlin, M. Gangnerau, G. Bellon et al. // Amer. J. Physiol. 2002. Vol. 283. №3. R623-R630.

9. Effect of magnesium on vascular reactivity in NOS inhibitioninduced hypertension / F. Basral, U.S. Nasircilar, G. Kofer et al. // Magnes Res.2015. Vol. 28. №2. Р. 64-74.

10. Nitric oxide synthase in diabetic rat testicular tissue and the effects of pentoxifylline therapy / M.F. Sonmez, E. Kilif, D. Karabulut et al. // Syst Biol Reprod Med.2016. Vol. 62. №1. Р. 22-30.

11. Heterozygous eNOS deficiency is associated with oxidative stress and endothelial dysfunction in diet-induced obesity / M.I. Ali, X. Chen, S.P. Didion // Physiol Rep. 2015. Vol. 3. №12. el2630.

12. Патент 17281 Україна, МПК G09 №23/28. Спосіб моделювання гестаційного діабету у щурів лінії Вістар для вивчення його наслідків для нащадків / Ю.М. Колесник, І.Ф. Белєнічев, А.В. Абрамов та ін. № u 2006 03504; заявл. 31.03.06 ; опубл. 15.09.06. Бюл. №9.

Анотація

гестаційний діабет підшлунковий залоза

Мета роботи вивчити патерн експресії ендотеліальної, індуцибельної та нейрональної NO-синтаз у панкреатичних острівцях підшлункової залози нащадків самок з експериментальним гестаційним діабетом (ЕГД) у препубертатному періоді (вік 3 місяці). Дослідження здійснені на 10 самцях щурів нащадків самок із нормальною вагітністю та 10 нащадках самок з ЕГД. Для аналізу стану системи монооксиду азоту в гістологічних зрізах панкреатичних острівців досліджували експресію нейрональної, індуцибельної та ендотеліальної ізоформ синтази оксиду азоту. У ході дослідження встановили, що в контрольних щурів найбільша площа ферменту була характерною для ендотеліальної ізоформи, водночас як вміст імунореактивного матеріалу до ферменту (ІРМ) був найбільшим для індуцибельної. Хронічна гіперглікемія плода призводить до зміни характеру експресії ізоформ і характеризується більшим вмістом ІРМ до nNOS, площі ІРМ до 1NOS і максимальними, порівнюючи зі всіма показниками експресії лізоформ, значеннями площі та вмісту ІРМ до еNOS. На нашу думку, порушення гомеостазу глюкози у плода в останньому триместрі вагітності змінює співвідношення патернів експресії ізоформ NOS у ПО підшлункової залози, що може стати ймовірною причиною формування цукрового діабету у зрілому віці.

Аннотация

Патогенетическая связь дисбаланса изоформ синтазы оксида азота в панкреатических островках поджелудочной железы с хронической пренатальной гипергликемией

О.В. Ганчева, Ю. М. Колесник, Ю. И. Вородеева

Цель работы изучить паттерн экспрессии эндотелиальной, индуцибельной и нейрональной NO-синтаз в панкреатических островках поджелудочной железы потомков самок с экспериментальным гестационным диабетом (ЭГД) в препубертатном периоде (возраст 3 месяца). Исследования проведены на 10 самцах крыс потомков самок с нормальной беременностью и 10 потомках самок с ЭГД. Для анализа состояния системы монооксида азота в гистологических срезах панкреатических островков исследовали экспрессию нейрональной, индуцибельной и эндотелиальной изоформ синтазы оксида азота. В ходе исследования установлено, что у контрольных крыс наибольшая площадь фермента была характерной для эндотелиальной изоформы, в то время как содержание иммунореактивного материала фермента (ИРМ) было максимальным для индуцибельной. Хроническая гипергликемия плода приводит к изменению распределения изоформ в панкреатических островках, отмечается большее содержание ИРМ к nNOS, увеличение площади ИРМ к 1NOS и максимальные, по сравнению со всеми показателями экспрессии изоформ, значения площади и содержания ИРМ к еNOS. По нашему мнению, нарушение гомеостаза глюкозы у плода в последнем триместре беременности меняет соотношение паттернов экспрессии изоформ NOS в ПО поджелудочной железы, что может стать вероятной причиной формирования сахарного диабета в зрелом возрасте.

Ключевые слова: изоформы синтазы оксида азота, панкреатические островки, гестационный диабет, экспрессия.

Annptation

Pathogenetical linkage of the Nitric oxide synthase isoforms disbalance in pancreatic islets with chronical prenatal hyperglycemia

O. V. Gancheva, Yu. M. Kolesnyk, Yu. I. Vorodeeva

The aim was to study patterns of the nNOS, iNOS and eNOS expression in pancreatic islets in prepubescent male offsprings of female rats with experimental gestational diabetes mellitus.

Materials and methods. The study was carried out in 10 prepubescent male offsprings of female rats with normal pregnancy and in 10 prepubescent male offsprings of female rats with experimental gestational diabetes mellitus. The expression of nNOS, iNOS and eNOS was evaluated in histological slices of pancreatic islets.

Results. It was found that the largest area of enzyme expression of eNOS was detected in control animals. On the other hand the immunoreactive material enzyme was maximal for iNOS. Chronic fetal hyperglycaemia affects the allocation of NOS isoforms in pancreatic islets. Higher immunoreactive material enzyme and nNOS contain, increase of iNOS area and the most significant increase of contain and area of fluorescence of eNOS compared with other expression indexes were detected. We believe the affection of glucose homeostasis in fetus during the last trimester of the pregnancy changes the relation of patterns of the expression ofNOS isoforms, and it can lead to the formation of metabolic violation in adults.

Key words: NOS isoforms, Pancreatic Islets, Gestational Diabetes Mellitus, Expression.

Размещено на Allbest.ru