Розподіл алельних варіантів за A69314G поліморфізмом гена TNAP у хворих на гострий коронарний синдромом у курців і тих, що не курять

Резюме

Наведено результати вивчення A69314G поліморфізму гена TNAP серед 118 хворих на гострий коронарний синдромом (ГКС) і 110 практично здорових осіб (контрольна група) у курців і тих, що не курять. Виявлено, що в курців із А/G+G/G генотипом ризик виникнення ГКС майже в 3,4 раза вищий, ніж у гомозигот за основним алелем А/А (Р=0,045; ОЯ=3,393). Як в осіб із А/А генотипом (Р=0,032), так і в

Ключові слова: тканиннонеспецифічна лужна фосфатаза (ШАР), поліморфізм генів, гострий коронарний синдром.

Вступ

Неорганічний пірофосфат (РРі) слугує потужним фізіологічним фактором, що захищає судинну стінку від кальцифікації. Основним ферментом, що розщеплює РРі з утворенням неорганічного фосфату (Рі) у позаклітинному просторі, є тканиннонеспецифічна лужна фосфатаза (ШАР). Таким чином, безпосередньо ТНАР є активатором кальцифікації в судині [7, 9, 10, 11]. Ген TNAP знаходиться в одній хромосомі. На сьогодні відомо близько 3500 однонуклеотидних поліморфізмів гена TNAP. Більшість робіт з вивчення поліморфізмів даного гена присвячено його асоціації з розвитком гіпофосфатазії [5, 6, 8]. Що стосується зв'язку А69314G поліморфізму гена TNAP із розвитком гострого коронарного синдрому (ГКС), то ця проблема досліджується нами вперше.

Куріння відноситься до основного модифікованого фактору ризику розвитку серцево- судинної патології. Доведено, що серед тих чоловіків, що курять, гострий коронарний синдром виникає у два рази частіше, ніж у тих, що не курять. В Україні майже 90 % летальних випадків від серцево-судинної патології в осіб чоловічої статі віком до 45 років пов'язано з курінням [2]. Саме куріння вважається причиною кожної 5-ї смерті пацієнтів старше 35 років [1].

Мета дослідження. Провести аналіз зв'язку А69314G поліморфізму гена TNAP із розвитком ГКС в осіб, що курять, і тих, що не курять.

Матеріал і методи. У роботі використано венозну кров 118 хворих на ГКС середнім віком 55,91±0,89 року, яких госпіталізовано в кардіологічне відділення Сумської міської клінічної лікарні № 1.

Дослідження проводили з дотриманням основних положень Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину, Гельсінкської декларації Всесвітньої медичної асоціації про етичні принципи проведення наукових медичних досліджень за участю людини (1964, з подальшими доповненнями, включаючи версію 2000 р.) та Наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. Усі пацієнти підписали інформовану угоду на участь носіїв мінорного алеля А/G+G/G (Р=0,032) за А69314G поліморфізмом встановлено достовірний зв'язок між розвитком ГКС та курінням.

Діагноз гострого інфаркту міокарда та нестабільної стенокардії встановлювали на підставі даних клінічних, електрокардіографічних та біохімічних досліджень згідно з рекомендаціями експертів ВООЗ, а також відповідно до рекомендацій європейського та американського товариств кардіологів [3, 4]. Контрольна група складалася зі 110 осіб, у яких відсутність серцево- судинної патології підтверджували шляхом збору анамнестичних даних, запису електрокардіограм, вимірювання артеріального тиску та дослідження ряду біохімічних показників крові. Контрольна група і група хворих на ГКС не відрізнялися за співвідношенням осіб різної статі (P=0,294 за х²- критерієм) та за середнім віком (P=0,103).

Визначення А69314G (rs3200255) поліморфізму гена TNAP проводили за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції з подальшим аналізом довжини рестрикційних фрагментів.

Для генотипування венозну кров набирали в стерильних умовах у моновети об'ємом 2,7 мл з калієвою сіллю етилендіамінтетраоцтової кислоти ("Sarstedt", Німеччина), що слугувала антикоагулянтом. Кров заморожували і зберігали при температурі -20 С. ДНК з неї виділяли, використовуючи набори "Изоген" (Росія). Ампліфікацію ділянки гена, що містить сайт А69314G поліморфізму, проводили за допомогою пари специфічних праймерів: прямого (sence) 5' CCTAATTCTGGGCCCACAAA 3' і зворотного (antisense) - 5' CCTTCCACCAGCAAGAAGAA 3'. Для ампліфікації брали 50-100 нг ДНК і додавали до суміші, що містила 1 мкл 10-кратного PCR- буферу, 1,5 мМ сульфату магнію, 200 мкМ суміші чотирьох нуклеотидтрифосфатів, по 20 pM кожного з праймерів і 1,0 ОД Taq-полімерази ("Thermo Scientific", CША), об'єм доводили до 25 мкл деіонізованою водою. Ампліфікація фрагмента 9-го екзона складалася з 30 циклів: денатурація - 94°С (50 с), гібридизація праймерів - 60,0°С (45 с) і елонгація - 72°С (1 хв). Потім 6 мкл продукту ампліфікації інкубували при 37 С протягом18 годин із 3 ОД рестриктази ВспІ (Neil) ("Thermo Scientific", США) у Tango-буфері такого складу: 10 мМ трис-HCl (pH 8,5), 10 мМ хлориду магнію 100 мМ хлориду калію і 0,1 мг/мл альбуміну. Наявність у 69314-й позиції гена TNA- P аденіну перешкоджає рестрикції, а при заміні аденіну на гуанін рестриктаза ВспІ (NGI) розщеплює ампліфіковану ділянку (довжина - 308 п.о) на два фрагменти: 185 і 123 пар основ.

Ампліфікати вивченого фрагмента гена TNA- P після рестрикції розділяли в 2,5 % агарозному гелі, що містив 10 мкг/мл бромистого етидію. Горизонтальний електрофорез (0,13А; 200V) проводили протягом 25 хв. Візуалізацію ДНК після електрофорезу здійснювали за допомогою трансілюмінатора ("Біоком", Росія). пірофосфат ген кальцифікація

Статистичний аналіз проводили з використанням програми SPSS-17. При цьому достовірність відмінностей визначали за х²-критерієм. Значення P<0,05 вважали достовірним.

Результати дослідження та їх обговорення

Генотипування хворих на ГКС за A69314G поліморфізмом гена TNAP дало змогу встановити частоту окремих варіантів цього гена в курців і тих, що не курять. Нами встановлено, що серед хворих на ГКС тих, що не курять, осіб із А/А генотипом було 73,4 %, а з А/G+G/G генотипом - 26,6 %. Розподіл генотипів (А/А і А/G+G/G) у хворих на ГКС курців становив 64,8 % і 35,2 % відповідно. Таким чином, у хворих на ГКС частота генотипів за досліджуваним поліморфізмом (А/А і А/G+G/G) достовірно не відрізнялася серед курців і тих, що не курять (х²=1,027; P=0,311).

Розподіл генотипів за А69314G поліморфізмом гена TNAP у курців і тих, що не курять, подано в табл. 1. Серед тих, що не курять, практично здорових осіб із А/А генотипом було 82,7 %, а з А/G+G/G генотипом - 17,3 %. Розподіл алельних варіантів серед хворих на ГКС, що не курили, становив 73,4 % і 26,6 % відповідно. Отже, в осіб, що не курять, не виявлено достовірного зв'язку між А69314G поліморфізмом гена TNAP і розвитком ГКС (х²=1,831; P=0,176). Серед курців у групі контролю гомозигот за основним алелем А/А було 86,2 %, а носіїв мінорного алеля А/ G+G/G - 13,8 %. У хворих на ГКС, що курять, хворих із ГКС співвідношення поліморфних варіантів було 64,8 % і 35,2 % відповідно. Таким чином, у курців із ГКС частіше трапляється AG- +GG генотипи, А69314G поліморфізму гена TNAP (х²=4,310; P=0,038), ніж у контролі.

Застосування методу логістичної регресії дало можливість підтвердити цей висновок. У результаті проведених нами розрахунків встановлено, що ризик виникнення ГКС у курців, що були носіями мінорного алеля (А/G+G/G), майже в 3,4 раза вищий, ніж у гомозигот за основним алелем А/А (Р=0,045; OR=3,393) (табл. 2).

Поділ двох груп - дослідної і контрольної - на дві підгрупи залежно від факту куріння (курці й ті, що не курять) дав можливість проаналізувати вплив А69314G поліморфізму гена TNAP на розвиток ГКС у курців і тих, що не курять. У контрольній групі осіб, що не курять, з генотипом А/А було 82,7%, а з генотипом А/G+G/G - 17,3%; а тих, що курять, з різними варіантами генотипів (А/А і А/G+G/G): 86,2% і 13,8% відповідно. Отримані дані свідчать про відсутність статистично значимих відмінностей у розподілі алельних варіантів за вивченим поліморфізмом між особами, що курять і не курять, у контрольній групі (х² = 0,190; P = 0,663). Серед хворих на ГКС тих, що не курять, з генотипом А/А було 73,4%, з генотипом А/G+G/G - 26,6%; а курців 64,8% і 35,2% відповідно. Отже, не виявлено статистично значимих відмінностей у розподілі генотипів між особами-курцями і тими, що не курять, серед хворих на ГКС (х² = 1,027; P = 0,311).

У результаті проведених розрахунків встановлено відмінність у підгрупах пацієнтів, утворених за окремими алельними варіантами SNP (табл. 3). Серед гомозигот за основним алелем А/ А осіб контрольної групи тих, що не курять, було

Таблиця 1 Частота генотипів А69314С поліморфізму гена TNAP у хворих на гострий коронарний синдром, у курців і тих, хто не курять

Distribution of the allelic variants according to the А693^ P olymorphism of gene TNAP in smoking and non-smoking patients with acute coronary syndrome

I.A. Rozumenko, V.Yu. Harbuzova, A.V. Ataman