Молекулярно-биологические факторы в патогенезе, диагностике и прогнозировании цервикальной неоплазии

p₂ - cтатистическая значимость различий с микроивазивным раком;

p₃ - cтатистическая значимость различий с Ib стадией рака.

При цервикальной интраэпитедиальной неоплазии отмечалась умеренная или выраженная пролиферативная активность - в среднем от 10 до 30% клеток, коррелирующая с нарастанием атипических изменений многослойного плоского эпителия. Систематизация полученных данных показала, что пролиферативная активность при цервикальных неоплазиях, не превышавшая 20,0% клеток, соответствовала CIN I-II, экспрессия PCNA более 20,0% клеток характеризовала CIN III. Цервикальные неоплазии с уровнем пролиферирующих клеток более 29,6%, относились к группе неблагоприятного клинического течения. Таким образом, PCNA при цервикальной интраэпителиальной неоплазии может рассматриваться прогностическим фактором, определяющим вероятную прогрессию CIN.

Определение PCNA в опухолях шейки матки выявило взаимосвязь с клинической характеристикой опухолевого роста - пролиферативная активность раковых клеток в инвазивных опухолях превышала аналогичные параметры по сравнению с микроинвазией. Исследование показало, что наиболее высокие показатели PCNA соответствовали I-III стадиям инвазивного роста, превышая свои значения при внутриэпителиальном раке. Аналогичная направленность отмечена и в отношении показателей пролиферативной активности в зависимости от размеров первичного поражения шейки матки - увеличение числа пролиферирующих клеток отмечалось при поражениях Тis и Т1а и при сравнении последних с опухолями Т1b-T3. Максимально высокие значения PCNA определялись при вовлечении в злокачественный процесс регионарных лимфатических узлов, при этом пролиферирующие раковые клетки пораженных лимфоузлов превышали показатели экспрессии PCNA в первичных опухолях.

Клиническое течение рака шейки матки, связанного с темпами клеточного роста, превышающими 66,8% пролиферирующих клеток, характеризовалось снижением показателей общей пятилетней выживаемости больных по сравнению пациентками, в опухолях которых PCNA не превышал 66,8% клеток: 77,5±6,4% против 94,3±4,1% (р=0,023).

Таким образом, формирование неоплазии и прогрессия рака шейки матки связаны с избыточной пролиферацией клеток в результате нарушения баланса анти- и проапоптозной регуляции поврежденных эпителиоцитов.

5. Экспрессия рецепторов половых гормонов в тканях шейки матки. Доказано, что в инициации цервикальной неоплазии наряду с инфицированием HPV важную роль имеет стероидная регуляция (Auborn K.J. et al.;1991; Woodworth C.D., 1998- 2002; Russo J., 2003).

Исследование обнаружило экспрессию рецепторов эстрогенов и прогестерона во всех образцах здоровых тканей шейки матки (таб. 4).

При цервикальной интраэпителиальной неоплазии отмечено появление рецепторонегативных поражений. Рак шейки матки характеризовался уменьшением частоты сочетанной экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона. Степень экспрессии PgR при раке шейки матки соответствовала отрицательным и низким значениям, не отличаясь от показателей контроля и при CIN. Снижение уровня экспрессии ER до отрицательных значений выявлялось при микроинвазивных карциномах. Инвазивные опухоли отличались увеличением средних значений H-score ER до умеренных показателей, что определялось присутствием среди инвазивных карцином умеренной и высокой экспрессии ER. Снижение уровня стероидной рецепции при неопластических поражениях шейки матки может свидетельствовать о возникновении автономного «самоподдерживающегося» роста за счет локально продуцирующихся ростовых факторов и цитокинов. Необходимо отметить, что HPV-индуцированные поражения шейки матки тесно взаимосвязаны с гиперэстрогенией, сопровождающейся преимущественной конверсией E2 в агрессивный метаболит 16б-ОНE1, который определяет пролонгированный эффект E2 и активирует экспрессию гена Е7 HPV, инициирующего механизмы патологической пролиферации клеток, блокирующего факторы иммунологической защиты и определяющего опухолевую трансформацию клеток (Киселев В.И. и соавт., 2000-2003). При этом становится понятным доминирующее поражение эстроген-чувствительной зоны трансформации цервикального эпителия, где отмечается наиболее высокий уровень экспрессии стероидных рецепторов.

Таблица 4. Экспрессия рецепторов стероидных гормонов

р - статистическая значимость различий по сравнению с контролем;

р₁ - статистическая значимость различий с CIN III;

р₂ - статистическая значимость различий с Ia стадией рака;

р₃ - статистическая значимость различий с II-III стадией рака.

При оценке уровня метаболитов эстрогенов отмечено, что в группах больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки концентрации пролиферативно-нейтрального 2-ОНЕ1 снижались: соответственно 28,0±4,5 нг/мл и 14,5±2,1 нг/мл (p=0,016) против 30,3±2,8 нг/мл в контроле. Указанная динамика содержания 2-ОНЕ1 коррелировала с увеличением уровня пролиферативно-активного 16б-ОНЕ1: 19,7±0,9 нг/мл при CIN и 19,9±1,1 нг/мл при раке шейки матки против 15,8±0,6 нг/мл в контроле (p=0,04 и p=0,025), что сопровождалось уменьшением соотношения 2-OHЕ1/16б-OHЕ1 метаболитов.

Проведенный анализ выявил наиболее часто встречающиеся варианты коэкспрессии стероидных рецепторов, c-erb-B2, bcl-2, в сочетании с показателями индекса массы тела и метаболитами эстрогенов (таб.6). Учитывая возможность модуляции экспрессии стероидных рецепторов посредством продукции цитокинов и факторов роста, становится понятной частая встречаемость изменений экспрессии стериодных гормонов, bcl-2, c-erb-B2 в самых разных сочетаниях. В процессе неопластической трансформации координированное действие этих регуляторов в большинстве случаев нарушается, что может быть как следствием, так и одной из причин формирования неоплазии.

Взаимодействие ауто/паракринной регуляции при участии ростовых факторов, онкопротеинов и эндокринных механизмов при поражениях шейки матки преобладало в группе с благоприятным течением CIN - сочетание ER и PgR с умеренной экспрессией bcl-2 при низкой экспрессии или отсутствии c-erb-B2 на фоне нормальных показателей индекса массы тела 26,6±1,0 и соотношения 2-ОНЕ1/16б -ОНЕ1, равного 1,66±0,12.

В 8,8±1,9% случаев поражений шейки матки, связанных с умеренной и высокой степенью экспрессии ER, онкогены c-erb-B2, bcl-2, p53mut не выявлялись. В развитии этого варианта неоплазии, вероятно, превалировали эндокринные механизмы, на что указывают высокие средние значения индекса массы 34,4±1,5 тела и увеличение содержания 16б-OHЕ1 с уменьшением соотношения 2-OHЕ1/16б-OHЕ1 метаболитов до 1,10±0,09. Рецидивирующее течение CIN у пациенток этой группы отмечалось в 35,0±10,7% (7 наблюдений), что отличалось от группы благоприятного прогноза.

Таблица 6. Взаимосвязь экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, индекса массы тела и метаболитов эстрогенов

Примечание: жирным шрифтом выделены значения, имеющие статистически значимые различия. р - достоверность значимых различий по сравнению с группой ER+PgR+; р₁ - достоверность значимых различий по сравнению с группой ER-PgR+; р₂ - достоверность значимых различий по сравнению с группой ER-PgR-.

Отсутствие экспрессии стероидных рецепторов в сочетании с гиперэкспрессией c-erb-B2 и bcl-2 у больных с дефицитом веса - индекс массы тела 20,5±0,5, и низкими показателями соотношения 2-ОНЕ1/16-ОНЕ1 - 0,36±0,21, доминировало в большинстве случаев 65,0±10,7% (13) неблагоприятного клинического прогноза и сочеталось с традиционно негативными характеристиками. Выявленные в этой группе тенденции связаны с доминирующим влиянием автономной регуляции в биологически агрессивных поражениях шейки матки.

Экспрессия рецепторов половых гормонов при цервикальной неоплазии взаимосвязана с экспрессией онкогенов, клинико-патологическими параметрами, особенностями клинического течения и может быть использована в прогнозе клинического течения заболевания.

6. Многофакторный корреляционный анализ иммунобиологических и клинических параметров эпителиальных дисплазий и рака шейки матки. Проведенный многофакторный корреляционный анализ подтвердил выявленные взаимосвязи между молекулярно-биологическими параметрами и традиционными клинико-морфологическими факторами прогноза, что свидетельствует о наличии патогенетических механизмов формирования цервикальной неоплазии (рис. 5, 6).

Выводы

1. При цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки с различной частотой обнаруживаются 16, 18, 31, 33, 35, 45 типы HPV. Наиболее распространенными при цервикальной интраэпителиальной неоплазии является 16 тип HPV, при раке шейки матки - 16 и 18 типы HPV.

2. Развитие цервикальной интраэпителиальной неоплазии не имеет прямой связи с идентификацией типа вируса папилломы человека. Сочетание 16 типа HPV с хламидийным инфицированием при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и 18 типа HPV с вирусом герпеса при раке шейки матки имеет прогностическое значение и, как правило, ассоциировано с неблагоприятным вариантом клинического течения.

3. Латентная папилломавирусная инфекция шейки матки характеризуется снижением в цервикальной слизи концентрации провоспалительных цитокинов IL-1в и TNF, предопределяя возникновение локальной иммуносупрессии и возможность перехода в клиническую стадию, что требует коррекции иммунных нарушений и биоценоза.

4. Аналитическим критерием тяжести поражения при цервикальной интраэпителиальной неоплазии является увеличение локальной продукции TGFв: концентрация TGFв в цервикальной слизи 150-240 пкг/мл соответствует CIN I-II, TGFв 240-500 пкг/мл CIN III.

5. Благоприятными факторами прогноза при цервикальной интраэпителиальной неоплазии являются отсутствие p53mut, умеренный уровень bcl-2, менее 10,0% клеток, низкая экспрессия c-erb-B2 (+), низкий уровень PCNA, не превышающий 29,6% клеток, экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона.

6. Неблагоприятными факторами клинического течения цервикальной неоплазии являются следующие:

- сочетание умеренной экспрессии рецепторов эстрогенов (++), отсутствие онкобелков p53mut, bcl-2, c-erb-B2, ИМТ, превышающим 34,4 и соотношение 2ОНЕ1/16б-ОНЕ1 от 1,48 до 1,1;

- отсутствие экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, коэкспрессия c-erb-B2(+++) и bcl-2, более 10,0% клеток, ИМТ менее 20,5 и соотношение 2ОНЕ1/16б-ОНЕ1 менее 1,0.

7. Клинико-морфологические факторы прогноза цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки имеют прямую корреляционную зависимость с инфицированием шейки матки, продукцией цитокинов, регуляцией апоптоза, пролиферации клеток, рецепторами стероидных гормонов и метаболизмом эстрогенов на основании чего предложена гипотетическая схема формирования цервикальной неоплазии.

8. Высокой прогностической значимостью в клиническом течении цервикальной неоплазии обладают инфицирование HPV HR, увеличение экспрессии p53mut и bcl-2, микстинфицирование CT и HPV HR, высокая пролиферативная активность, увеличение локальной продукции TGFв, гиперэкспрессия онкогена c-erb-B2, снижение экспрессии рецепторов эстрогенов, повышение концентрации 16б-ОНЕ1 и локальное увеличение содержания IL-1в.

9. Дифференцированный алгоритм ведения цервикальной интраэпителиальной неоплазии внедрен в клиническую практику: при CIN I - коррекция биоценоза и устранение местной иммуносупрессии; при CIN II-III - петлевая эксцизия шейки матки с проведением пред- и послеоперационной терапии. Определены рациональные критерии постлечебного мониторинга (HPV-тестирование, цитологическое исследование, определение молекулярно-биологических факторов).

Практические рекомендации

1. При проведении HPV-тестирования у больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки рекомендуется использование мультипраймерных тест-систем для одномоментной детекции нескольких онкогенных типов при одной постановочной реакции, при этом генотипирование отдельных типов HPV нецелесообразно.

2. Пациенток с латентной папилломавирусной инфекцией следует относить к группе высокого риска по возникновению предрака и рака шейки матки, что требует обязательного диагностического мониторинга.

3. Дифференциально-диагностическим критерием степени тяжести поражения шейки матки при цервикальной интраэпителиальной неоплазии может быть определение содержания TGFв в цервикальном секрете - концентрация менее 150 пкг/мл свидетельствует об отсутствии клинически значимых изменений, 150-240 пкг/мл - соответствует CIN I-II, более 240 пкг/мл - CIN III.

4. При составлении прогноза клинического течения цервикальной неоплазии необходимо учитывать следующие факторы. Благоприятные - отсутствие экспрессии онкопротеинов p53mut, c-erb-B2, экспрессия bcl-2, умеренная пролиферативная активность клеток, наличие рецепторов эстрогенов и прогестерона, низкий уровень 16б-ОНЕ1. Неблагоприятные - микстинфицирование шейки матки HPV с хламидийной или герпетической инфекцией, гиперэкспрессия p53mut, c-erb-B2, отсутствие bcl-2, высокая пролиферативная активность клеток, отсутствие рецепторов половых гормонов, высокий уровень 16б-ОНЕ1.

5. При планировании тактики ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией рекомендуется использовать такие иммуногистохимические показатели как: сочетание экспрессии онкопротеинов 53mut, bcl-2, c-erb-B2, значения PCNA, наличие рецепторов эстрогенов и прогестерона, уровень 16б-ОНЕ1. При неблагоприятном прогнозе заболевания следует предпочесть деструктивное и хирургическое лечение; при благоприятном - возможно консервативное ведение пациенток с CIN I, деструктивное и хирургическое лечение при CIN II-III.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пономарева Ю.Н. Сравнительная оценка продукции провоспалительных цитокинов при различных заболеваниях шейки матки // Сборник научных работ «Проблемы биорегулирующей терапии в эксперименте и клинике». - Чита, 2002. - С. 104-105.

2. Витковский Ю.А., Белокриницкая Т.Е., Пономарева Ю.Н. Дифференциально-диагностические критерии дисплазии и рака шейки матки // Сибирский онкологический журнал. - 2002. - №3. - С. 33-35.

3. Пономарева Ю.Н., Широков В.А. Эпидемиологические аспекты рака шейки матки // Материалы региональной научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Рак репродуктивных органов: профилактика, диагностика, лечение». - Томск, 2002. - С. 105.

4. Белокриницкая Т.Е., Витковский Ю.А., Пономарева Ю.Н. Роль цитокинов в патогенезе нарушений иммунитета и гемостаза у больных тяжелыми дисплазиями и раком шейки матки // Вопросы онкологии. 2003. Т. 49, № 1. С. 51-54.