Изучение антипролиферативной активности экстракта из травы люцерны посевной на моделях in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение антипролиферативной активности экстракта из травы люцерны посевной на моделях in vitro

ВСТУПЛЕНИЕ

экстракт трава люцерна цитотоксический

В последнее время повышенный интерес вызывают изофлавоны: генистеин, даидзеин, глицитеин, что обусловлено возможным положительным действием этих веществ на организм, а также перспективами создания новых на их основе высокоактивных лекарственных препаратов, обладающих противовоспалительной, антиканцерогенной, противовирусной, антипаразитарной или бактерицидной активностью. Так известно, что в люцерне посевной кроме генистеина и даидзеина присутствуют изофлаво- ны биоханин А и формононетин, которые также представлены в виде гликозидов ононина и сиссортина [1, 2, 4, 13]. Изофлавоны являются нестероидными миметиками эстрогенов, называемых фитоэстрогенами. Хорошо известна антиканцерогенная активность генистеина [5, 18], в том числе и в лечении рака молочной железы [15]. Генистеин представляет собой ингибитор тирозинкиназы, который ингибирует пролиферацию как эстроген-позитивных, так и эстроген-негативных линий клеток рака молочной железы [5, 14]. Пищевые изофлавоны рассматриваются как возможная альтернатива гормональным препаратам в лечении множества заболеваний. Они способны подавлять рост опухолей у животных [11] и усиливать действие таких агентов, как моноклональные антитела против фактора роста эпителия [9] и селен [8]. Считается, что изофлавоны могут вызывать гибель клеток рака также посредством мобилизации способности присутствующих в опухоли ионов меди генерировать активные продукты окисления [17] благодаря влиянию на экспрессию генов супрессора опухоли в раковых клетках [6]. Однако необходимо помнить, что фитоэстрогены способны подавлять активность некоторых изоформ цитохромов Р450, что может модифицировать действие других лекарственных веществ. Кроме того, недавние исследования свидетельствуют, что генистеин способен усиливать рост опухоли простаты и инициировать процессы метастазирования во вторичные органы вследствие усиления пролиферации и снижения апоптоза раковых клеток [10]. Генистеин способен индуцировать экспрессию фермента ароматазы, присутствующей в клетках рака молочной железы. Этот фермент отвечает за биосинтез эстрогенов, и его экспрессия может способствовать росту клеток опухоли [16]. Кроме того, было показано, что даже низкие дозы генистеина, поступающие с пищей, способны препятствовать проявлению терапевтического действия антиракового агента тамоксифена, являющегося антагонистом рецептора эстрогенов [7].

Представленные литературные данные свидетельствуют о неоднозначности эффектов изофлавоноидов, в связи с чем данное исследование представляет особый интерес. Основанием для этого исследования послужил богатый фитохимический состав экстракта из травы люцерны посевной (ЭТЛП), а в особенности наличие в составе изофлавоноидов. ЭТЛП, полученный на кафедре фармакогнозии НФаУ под руководством проф. В. Н. Ковалева, по результатам хроматографического и фитохимического исследований [1, 2] кроме изофлавоноидов содержит такие фенольные соединения как гидроксикоричные кислоты, кумарины, эуфлавоноиды и дубильные вещества.

Целью исследования было изучение влияния экстракта из травы люцерны посевной на пролиферацию опухолевых гормонозависимых клеток на моделях in vitro для оценки возможного цитотоксического противоопухолевого эффекта.

Таблица ИЗМЕНЕНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК В КУЛЬТУРЕ IN VITRO ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭКСТРАКТА ИЗ ТРАВЫ ЛЮЦЕРНЫ ПОСЕВНОЙ В РАЗЛИЧНЫХ ДОЗАХ, %

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования были проведены на базе кафедры токсикологии Познаньского медицинского университета (Польша) им. Кароля Марцинковского под руководством проф. М. Муриуса. В эксперименте использовали гормонозависимые клеточные культуры опухолевых клеток человека линий MCF-7 (эстроген- позитивная ER+ и прогестеронпозитивная PR+ аденокарцинома протоков молочной железы человека), MDA-MB-231(рак молочной железы), SiHa (клетки чешуйчато-клеточной карциномы шейки матки). Клетки культивировали при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5 % СО₂ в среде ДМЕМ, содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамин (2 мМ), смесь антибиотиков PISIG (производства Sigma). Клетки после размножения культивировали в пластиковых матрацах площадью 25 см² в течение 1 недели со сменой среды каждые 3 дня, и по достижении монослоя производили пересев на 24-луночные планшеты с плотностью 8000 клеток на лунку. Пролиферативную активность клеток в культуре на планшетах под влиянием экстракта люцерны посевной в различных дозах оценивали с помощью Alamar blue теста [12] и выражали в условных единицах флуоресценции (УЕФ). Alamar Blue-анализ основан на преобразовании резазурина во флуоресцентное вещество резоруфин при снижении жизнеспособности клеток. Активный компонент индикатора (резазурин) является нетоксичным, проникающим через мембраны веществом синего цвета (нефлуоресцентным). При попадании в клетку резарузин преобразуется в резоруфин, который обладает яркой флуоресценцией в красной области. Живые клетки способны непрерывно преобразовывать резарузин в резоруфин, тем самым формируя количественный сигнал. Клетки культивировали в среде на основе ДМЕМ с добавлением гормонов (как стимуляторов клеточной пролиферации) и без содержания гормонов (в параллельном опыте) в течение 72 часов. После этого производили измерение интенсивности флуоресценции на детекторе биолюминесценции Xenogen. Контролем служили клетки, которые культивировали в средах с гормонами и без гормонов (в параллельных опытах) после добавления индикатора Alamar blue. Исследования влияния ЭТЛП на пролиферацию клеток в культуре выполняли в два независимых эксперимента с 4-мя образцами для каждой концентрации. Для определения действия ЭТЛП на рост колоний клеток опухолевых культур были выбраны концентрации: 5; 1; 0,2; 0,04 и 0,0008 мкг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты показывают, что при культивировании в среде с добавлением гормонов под действием ЭТЛП в исследованном интервале концентраций (5, 1, 0,2, 0,04 и 0,0008 мкг/мл) происходит однонаправленное ингибирование роста колоний клеток всех используемых линий: SiHa (клетки чешуйчато-клеточной карциномы шейки матки), MCF-7 и MDA-MB-231 (рак молочной железы) по сравнению с контролем, о чем свидетельствует выраженное уменьшение биофлюоресценции в ячейках под влиянием исследуемого экстракта. Цитотоксический эффект носит дозозависимый характер. Ингибирование роста колоний более 50 % по результатам Alamar blue теста для клеток MCF-7 отмечено в дозах 5 мкг/мл и 1 мкг/мл при культивировании в среде с добавлением гормонов.

Результаты угнетения пролиферации клеток в культурах по сравнению с контролем представлены в таблице.

В то же время для клеток SiHa в среде с гормонами антипролиферативный эффект зарегистрирован во всех исследуемых дозах, однако наиболее значимым он был в дозировке 1 мкг/мл (94,26 %). Максимальное ингибирование роста и пролиферации под влиянием ЭТЛП в дозе 1 мкг/мл наблюдалось и со стороны клеточной культуры MDA-MB-231 (88,65 %), в связи с чем доза ЭТЛП 1 мкг/мл на данных клеточных моделях оценена как эффективная.

Напротив, при культивировании клеток MDA-MB- 231 в среде без гормонов отмечались неоднозначные изменения: умеренная стимуляция пролиферации в дозах 0,2 и 0,04 мкг/мл (заместительное эстрогеноподобное действие изофлавоноидов люцерны); отсутствие влияния ЭТЛП в дозе 0,04 мкг/мл на пролиферацию клеток МСF-7 в среде без гормонов, стиму-

ляция пролиферации в дозах 0,2, 0,04, 0,0008 мкг/мл. Похожие результаты относительно активности изо- флавоноидов встречаются в литературе [11]. Следует отметить достоверное подавление пролиферации SiHa под действием ЭТЛП в дозе 1 мкг/мл при совместном культивировании в среде без гормонов за счет конкурентного антиэстрогенного действия изофла- воноидов люцерны.

Таким образом, анализ сравнительной эффективности ЭТЛП показал наиболее выраженный цитотоксический эффект на клетках культур SiHa и менее выраженный на клетках линии MCF-7 и MDA-MB-231, что может объясняться культуральными и морфологическими особенностями данных клеток [4].

В дальнейшем целесообразно более детальное изучение экстракта люцерны посевной с целью выяснения механизмов действия его компонентов.

ВЫВОДЫ

1. Исследуемый экстракт из травы люцерны посевной проявляет антипролиферативное действие на модели in vitro в культуре гормонозависимых опухолевых клеток человека линий MCF-7, MDA-MB-231, ЯШ.

2. При культивировании клеток в среде, содержащей гормоны, экстракт из травы люцерны посевной умеренно подавляет пролиферацию клеток. В то же время воздействие экстракта на рост и пролиферацию опухолевых клеток в культуральной среде без добавления гормонов неоднозначно.

3. Цитотоксический эффект экстракта из травы люцерны посевной в отношении опухолевых клеток в эксперименте in vitro носил дозозависимый характер и был наиболее выражен в дозе 1 мкг/мл. Полученный эффект может объясняться конкурентным связыванием изофлавоноидов люцерны с рецепторами эстрогензависимых клеток и подтверждать противоопухолевое действие фитоэстрогенов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ

1. Ковальов С. В. Дослідження фенольного комплексу з трави люцерни посівної / [С. В. Ковальов, А. М. Ковальова, Р. Ф. Єрьоменко та ін.] // Фар- мац. часопис. - 2008. - № 2 (6). - С. 27-30.

2. Ковальов С. В. Кількісне визначення фенольних сполук у траві люцерни посівної / С. В. Ковальов, Р. Ф. Єрьоменко, Л. М. Малоштан // Фармаком. - 2008. - № 4. - С. 35-38.

3. Тараховский Ю. С. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина / Ю. С. Тараховский, Ю. А. Ким, Б. С. Абдрасилов, Е. Н. Музафаров. - Пущино: Sуnchrobook, 2013. - 310 с.

4. Шевченко В. Е. Картирование протеома лизата линии опухолевых клеток MCF-7 для идентификации потенциальных маркеров рака молочной железы / [В. Е. Шевченко, М. А. Таипов, С. В. Ковалев и др.] // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2012. - № 2. - С. 5-10.

5. Akiyama T. Genistein, a specific inhibitor of tyrosine- specific protein kinases / [T. Akiyama, J. Ishida, S. Na- kagawa et al.] // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. - Р. 5592-5595.

6. Chen Y. MicroRNAs 221/222 and genistein-mediated regulation of ARHI tumor suppressor gene in prostate cancer / [Y. Chen, M. S. Zaman, G. Deng et al.] // Cancer Prev. Res. - 2011. - Vol. 4. - Р. 76-86.

7. Du M. Low-dose dietary genistein negates the therapeutic effect of tamoxifen in athymic nude mice / [M. Du, X. Yang, J. A. Hartman et al.] // Carcinogenesis. - 2012. - Vol. 33. - Р. 895-901.

8. Hamdy S. M. Prevention of rat breast cancer by genistin and selenium / [S. M. Hamdy, A. K. Latif, E. A. Drees et al.] // Toxicol. Ind. Health. - 2011. - Vol. 28. - Р. 746-757.

9. Lattrich C. Additive effects of trastuzumab and ge- nistein on human breast cancer cells / [C. Lattrich, J. Lubig, A. Springwald et al.] // Anticancer Drugs.2011. - Vol. 22. - Р. 253-261.

10. Lazarevic B. Efficacy and safety of short-term geni- stein intervention in patients with localized prostate cancer prior to radical prostatectomy: a randomized, placebo-controlled, double-blind Phase 2 clinical trial / [B. Lazarevic, G. Boezelijn, L. M. Diep et al.] // Nutr. Cancer. - 2011. - Vol. 63. - Р. 889-898.

Размещено на Allbest.ru