Размещено на http://allbest.ru

21

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат

на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Сравнительные аспекты полиморфных вариантов генов Ил-4 и Ил-10 при бронхиальной астме у коренного и пришлого населения Республики Хакасия

14.03.09- клиническая иммунология, аллергология

Андрейчикова Елена Анатольевна

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Росздрава и Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководитель: академик РАМН, профессор, доктор медицинских наук Владимир Александрович Козлов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Васильевич Климов

доктор медицинских наук, профессор Любовь Михайловна Куделя

Ведущая организация: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Государственный научный центр Институт иммунологии» ФМБА России

Защита состоится « » 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в Институте клинической иммунологии по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института клинической иммунологии СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат диссертации разослан "______"___________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного

совета, доктор биологических наук Ольга Тимофеевна Кудаева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бронхиальная астма является одной из актуальных медико-социальных проблем. Это обусловлено, в первую очередь, широкой распространенностью заболевания среди всех возрастных слоев населения. Бронхиальная астма относится к группе мультифакториальных заболеваний, этиология и патогенез которых определяется сложным взаимодействием факторов окружающей среды и генетических факторов (комбинации аллельных вариант генов, ответственных за возникновение предрасположенности к развитию патологии) (Фрейдин М.Б., 2001; Cookson W.O., 2003).

За последние десятилетия изучения генетической основы бронхиальной астмы выявлено значительное число локусов, сцепленных с болезнью, где локализованы гены-кандидаты, продукты которых могут участвовать в трех основных звеньях заболевания: иммунологическом, воспалительном и нейрогенном. Особое внимание уделяется генам семейства цитокинов и цитокиновых рецепторов (Фрейдин М.Б., 2006; Barnes, P.J., 2008). Наличие определенных полиморфных вариантов может приводить к изменению уровня экспрессии данных генов и изменению структуры кодируемых ими белков (Пузырев B.П., 1999; Kips J.C., 2001).

Взаимосвязь полиморфных вариантов генов цитокиной сети с бронхиальной астмой у жителей России изучена несколькими группами исследователей (Казначеев В.А. и др., 2005; Карунас А.С. и др., 2007; Огородова Л.М., 2002; Фрейдин М.Б., 2006; Рамазанова, Н.Н., 2007). Полученные результаты, однако, весьма противоречивы и не дают однозначного ответа на вопрос об их патогенетической роли в развитии астмы.

Допустимо, что для такого сложного заболевания как бронхиальная астма имеет место этническая специфика в детерминации, что доказывается различием некоторых участков сцепления в этнически дифференцированных популяциях. Имеющиеся наблюдения свидетельствуют, что, по-видимому, коренные и некоренные популяции, проживающие в одинаковых климатогеографических и социально-экономических условиях, могут иметь значительные различия в распространенности бронхиальной астмы.

В Республике Хакасия изучения ассоциации полиморфизма генов цитокинов с бронхиальной астмой среди взрослого населения не проводилось. Исходя из всего этого, нами была сформулирована цель исследования.

Цель исследования - охарактеризовать особенности генетического полиморфизма цитокинов и их ассоциацию с развитием бронхиальной астмы у коренного и пришлого населения Республики Хакасия.

Задачи исследования:

1. Оценить количественные показатели иммунного статуса (СD3+, СD4+, СD8+, СD22+, СD56+, IgА, IgМ, IgG, IgЕ), уровни сывороточных концентраций цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 у больных БА Республики Хакасия.

2. Изучить распределение частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов IL-4 (-590С>Т, -33Т>С) и IL-10 (-592С>А, -1082А>G) у больных аллергической бронхиальной астмой и здоровых индивидуумов республики.

3. Провести анализ ассоциации исследованных полиморфных вариантов генов и возможных их сочетаний с риском развития бронхиальной астмы с учетом этнической принадлежности анализируемых групп.

4. Провести анализ ассоциаций исследуемых аллельных вариантов с уровнем продукции соответствующих цитокинов у больных бронхиальной астмой.

5. Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов изученных полиморфных локусов у коренных жителей, с учетом степени тяжести, клиническими и функциональными показателями бронхиальной астмы.

Научная новизна исследования: Впервые получены данные о распределении аллельных вариантов промоторных регионов генов IL-4, IL-10 в точках полиморфизма -590С>T и -33Т>С IL-4, -592С>А и -1082А>G IL-10 в популяции монголоидов Хакасии и проведён сравнительный анализ характера их распределения с другими монголоидными популяциями по данным литературы. Установлено, что генетические факторы риска развития атопической бронхиальной астмы у хакасов ассоциированы с генотипами -33С/Т , -590С/Т гена IL-4 и -592А/А, аллелем А в локусе -592 гена IL-10.

Обнаружена ассоциация аллеля А локусов -592 и -1082 гена IL-10, с такими фенотипическими проявлениями бронхиальной астмы, как тяжесть заболевания, наличие поливалентной сенсибилизации.

Впервые проведено комплексное исследование концентрации противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10) на системном уровне во взаимосвязи с другими показателями иммунного статуса при атопической бронхиальной астмой у коренных жителей Хакасии. Особенностями эндогенной регуляции межклеточных взаимодействий при БА у коренных жителей является: повышением содержания абсолютного и относительного числа СD4+ лимфоцитов, увеличение концентрации ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови, снижение относительного числа СD3+ и СD8+ лимфоцитов. При медикаментозно контролируемом течении болезни, сывороточный уровень ИЛ-4 и ИЛ-10 не отличались у хакасов с БА от контрольных значений.

Теоретическая и практическая значимость работы: Данные, полученные в результате проведенного исследования, расширяют знания в области генетики заболеваний органов дыхания и этно-экологических аспектов аллергологии.

Определение концентрации цитокинов у пациентов с БА позволяет оценить интенсивность атопического воспаления на системном уровне.

Полученные данные об ассоциированности аллельных вариантов генов цитокинов с атопической бронхиальной астмой у хакасов позволяют использовать их в качестве дополнительных скрининговых тестов для выявления генетических факторов риска развития болезни.

Полученные результаты позволят прогнозировать течение бронхиальной астмы. Наличие аллеля А локусов -592 и -1082 гена IL-10 предполагает включение в базисную терапию бронхиальной астмы у хакасов противовоспалительных препаратов (ингаляционных глюкокортикостероидов) в максимально рекомендуемых дозах, длительными курсами.

Положения, выносимые на защиту:

1. В обследованных группах населения больных БА выявляется дисбаланс субпопуляций лимфоцитов, при этом регистрируется сдвиг соотношения Th1/Th2-лимфоцитов в сторону Th2, что поддерживает аллергическое воспаление, эти изменения выражены в большей степени среди пришлых жителей в отличие от коренных.

2. Носительство генотипа -590СТ, -33СТ гена ИЛ-4 и -592АА гена ИЛ-10 является фактором генетической предрасположенности к развитию аллергической БА у хакасов. Аллель -592 А гена ИЛ-10 ассоциирован с тяжелым характером течения БА. Сочетание генотипов -590ТТ/-33ТТ гена ИЛ-4 является маркером пониженного риска развития заболевания.

3. Выявлены достоверные отличия в частотах встречаемости аллелей и генотипов генов ИЛ-4 в точке -33 и -590, ИЛ-10 в области -592 и -1082 у коренных и пришлых жителей, больных БА.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 41 таблицей и 12 рисунками. Список литературы содержит 205 источник, в том числе 28 работ отечественных и 177 зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 11, 12, 13 межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2008, 2009, 2010г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 журнальные статьи, из которых 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной иммунологии НИИКИИ СО РАМН (зав. лаб. - д.м.н., профессор С.В. Сенников).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Работа основана на результатах обследования неродственных индивидуумов, больных аллергической IgЕ-опосредованной (атопической) БА, различной этнической принадлежности, постоянно проживающих на территории Республики Хакасия.

Обследованный контингент подразделяли на две популяции: хакасов (монголоидов или коренных жителей) и европеоидами (пришлое население). Группы больных составили пациенты, имеющие положительные результаты кожных аллергопроб и ранее подтвержденный диагноз бронхиальной астмы (GINA, 2006). Под наблюдением находилось 99 человек: 66 больных БА хакасов и 33 больных европеоидов.

Сбор данных, включал жалобы больного, семейный и аллергологический анамнез производился в личной беседе с больным. Всем больным проводились инструментальные обследования, включающие в себя спирографию, электрокардиографию и рентгенографию. По степени тяжести больных хакасов разделили на 3 группы - легкого течения (25 пациентов), средней тяжести (23 пациентов) и тяжелого течения (18 человек). По ответу на проводимую базисную терапию больных БА разделили на две группы: 1 группа - с контролируемым течением (12 человек), 2 группа - с неконтролируемым (34 человека).

В качестве контроля в работе использовалась выборка практически здоровых лиц, представленная жителями различных районов Республики Хакасия (100 человек), хакасской этнической принадлежности. Все входящие в группу контроля, являлись неродственными индивидуумами. Критериями для включения в контрольную группу являлось отсутствие аллергических заболеваний на момент включения и в анамнезе, наличие у них отрицательных аллергопроб.

Иммунологическое обследование включало определение субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлоуметрии с помощью моноклональных антител фирмы «Оrto Diagnostig» (США).

Определяли субпопуляции Т-клеток, несущие поверхностные антигены CD3+, CD4+, CD8+, рассчитывали иммунорегуляторный индекс-соотношение CD4+/CD8+. Концентрацию иммуноглобулинов (IgА, IgМ, IgG) сыворотки крови определяли методом радиальной иммунодифузии по G. Mancini с помощью стандартных антииммуноглобулиновых сывороток. Содержание общего IgЕ сыворотки крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью стандартного набора реагентов «Вектор-БЕСТ», Новосибирск.

Содержание цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови определяли с помощью меченых моноклональных и поликлональных антител («R&D Systems», США) методом электрохемилюминесценции с использованием прибора «Origen Analyzer» фирмы IGEN (США) и реагентов, приготовленных согласно протоколам [Sennikov S.V. др. 2003].

Для генотипирование индивидов использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови, с использованием комплекта реагентов для выделения нуклеиновых кислот «Проба НК» научно-производственной фирмы ООО «ДНК- технология» (г.Москва).

Исследованы полиморфные варианты генов цитокинов: ИЛ-4 -590С>Т, -33Т>С и ИЛ-10 -592С>А, -1082А>G. Генотипирование аллельных вариантов осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации (ПДРФ - анализ), используя последовательности праймеров и параметры температурных циклов, описанные в литературе и учитывая рекомендации производителя использованного в работе амплификатора “PTC-200 DNA Engine” фирмы MJ Research (США) (табл.1).

Таблица 1

Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген	Полиморфизм	Структура праймеров	Фермент рестрикции	Литература
ИЛ-4	-590С>T	5'-tatggacctgctgggacccaaacta-3' 5'-tgatctggggctccttctctgcatag-3'	BsIF	Gervaziev Y.V et al., 2006
	-33T>С	5'-tttccctcggtttcagcaattttaaatc-3' 5'-ctagcaggaagaacagagggggaagc-3'	BstMA
ИЛ-10	-592С>A	5'-atccaagacaacactactaa-3' 5'-taaatatcctcaaagttcc-3'	Rsa	Alamartine E. et al., 2003
	-1082A>G	5'-tctgaagaagtcctgatgtcactg-3' 5'-actttcatcttacctatccctacttcc -3'	Mnl	Lowe P.R et al., 2001.

Обработка цифрового материала результатов исследования проводилась в соответствии с общепринятыми методами статистики, с использованием прикладного рабочего пакета статистического анализа «Statistica v.6.0» на персональном компьютере «Petntium IV 1700» в рабочей среде «Windows XP». Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, применялись непараметрический критерий U-test Манна-Уитни [C. Гланц, 1999]. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий чІ Пирсона. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для анализа ассоциации аллелей и генотипов с риском развития БА рассчитывали отношения шансов (ОШ) с 95%-ными доверительными интервалами (ДИ). астма ген бронхиальный этнический

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика результатов иммунологического обследования пациентов с БА

Анализ распределения субпопуляционного состава лимфоцитов выявил статистически значимое уменьшение количества CD3+ -лимфоцитов в группе коренных жителей с БА 67,54(56-75)% в отличие от индивидуумов без БА 76,73(61-79)%. Что возможно, свидетельствует о снижении суммарного содержания Т-лимфоцитов за счет миграции этих клеток в очаг повреждения, либо с подавлением дифференцировки Т-клеток, либо с селективным апоптозом наиболее зрелых Т-лимфоцитов.

Концентрация иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов была изменена неравномерно. Анализ относительного количества CD4+-лимфоцитов показал, что у больных хакасов происходит достоверное повышение данного показателя до 53,18(49-61)%, в отличие от контроля 42,0(36-51)% (р<0,05).

Снижения CD8+клеток, у хакасов с патологией составляла 15,72(3-30)%, а в контрольной группе 28,73(4-33) (р< 0,05), что соответственно приводит к увеличению ИРИ, у пациентов с БА 3,36(1,3-20,3)% и 1,46(1,24-3,4)% в контроле (р < 0,05). Высокое содержание Т-хелперов периферической крови может быть обусловлено замедлением их элиминации (Jang A.S, 2000).

Бронхиальная астма сопровождается нарушением процессов клеточной гибели. Дефект апоптоза является ключевым звеном в развитии заболевания (Невзорова В.А., 2001). У больных БА происходит снижение апоптотической гибели (Majno G., 1995).

У больных БА хакасов, в отличие от здоровых, отмечен дефицит NK клеток (CD56+) 8,86(4-15)% и 13,27(6-15)% соответственно (р< 0,05). Эффекторные функции NK- клеток заключаются в уничтожении клеток-мишеней, продукции ИФН-г и других цитокинов.

Таким образом, дефицит NK клеток может приводить к развитию острых респираторных инфекций (в особенности вызванных риновирусом или респираторно-синцитиальным вирусом) (Tan W.S., 2005), которые, как известно, индуцируют обострение воспалительного процесса у больных БА.

Содержание В-лимфоцитов (CD 22+) выше у больных БА хакасов в отличие от здоровых 14,18(10-20) и 12,8(11-14) соответственно (р< 0,05).

Отмечено изменение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови у больных БА хакасов: достоверно увеличено содержание IgА, IgМ и IgG, а концентрация IgЕ у больных БА значительно превышала значения в контрольной группе. Таким образом, изменения, выявленные у больных БА хакасов, соответствуют современным представлениям о том, что при БА наблюдается избыточная активация В-лимфоцитов и развитие IgЕ- опосредованных реакций (Laffer S. еt аl, 2001).

Анализируемые группы больных отличаются между собой по содержанию отдельных субпопуляций лимфоцитов периферической крови. У европеоидов отмечается достоверное снижение CD3+ 64,8(54-72)% в отличие от хакасов с БА 67,54(56-75)%.

Количество CD8+ -лимфоцитов у больных БА европеоидов также ниже в отличие от лиц хакасской этнической принадлежности с БА 12,4(2-24) и 15,72(3-30)% соответственно (р< 0,05). Вместе с тем, отмечаются и общие закономерности в показателей иммунного статуса у больных БА хакасов и европеоидов: содержание CD4+-, CD22+-лимфоцитов, CD56+ , ИРИ, иммуноглобулинов класса М. Концентрация общего IgЕ в сыворотке крови у больных БА хакасов регистрировались достоверно выше в отличие группы европеоидов с БА 448,32(84,2-1256,1)МЕ/мл и 311,70(102,4-985,5)МЕ/мл (р<0,05) соответственно. В обеих исследуемых популяциях у больных БА выявляются однотипные изменения показателей иммунного статуса, характерные для больных бронхиальной астмой.

ИЛ-4 - один из основных пусковых медиаторов воспаления Тh2-типа. Исследование цитокинового профиля в сыворотке крови коренных жителей больных БА выявило повышение среднего уровня ИЛ-4 в отличие от группы контроля 60,78(5,8-132,2)пг/мл и 19,4(2,3-24,6)пг/мл соответственно (р<0,01). При сравнении уровня ИЛ-4 у больных БА, различающихся по этнической принадлежности, выявил повышение его у коренных жителей в отличие от пришлых 60,785(5,8-132,2) пг/мл и 30,49(6,3-45,6)пг/мл соответственно (р<0,01). К противоспалительным механизмам относится локальное и системное действие интерлейкина-10, направленное на ингибирование продукции провоспалительных цитокинов. Известно, что IL-10 продуцируется другой иммунорегуляторной субпопуляцией Т-клеток - Tr1, а также дендритными клетками, Тh2-лимфоцитами и др [Lan R.Y., 2005; Mocellin S., 2003;]. Полученные результаты отражают повышенную активность Tr1-клеток, что, возможно, связано с их участием в регуляции аллергического воспаления.

Отмечается достоверное увеличение ИЛ-10 в группе хакасов с БА в отличие от контроля 1383,5(23,8-2171,2)пг/мл и 63,55(3,56-83,5)пг/мл соответственно; р<0,05). Средний уровень ИЛ-10 у больных БА европеоидов превышал значения у хакасов с БА, 1436,57(15,4-2563,3)пг/мл и 1383,5(23,8-2171,2)пг/мл соответственно.

Таким образом, выявленные отклонения в цитокиновом профиле, свидетельствуют о дисбалансе иммунных реакций в сторону избыточной активации Th-2 пути, что соответствует классическим представлениям об иммунопатогенезе атопического воспаления [Leung D.Y.M., 2004]. Вместе с тем, у больных хакасской этнической принадлежности выявлены некоторые особенности в содержании цитокинов аллергического воспаления в сравнении с больными БА европеоидами. На фоне проводимой иммуносупрессорной терапии сывороточные концентрации цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10 в группах больных коренной национальности с контролируемым течением БА достоверно снижаются и достигают значений, не отличающихся от здоровых доноров (рис. 1).

Рис.1 Сывороточные уровни ИЛ-4 (А) и ИЛ-10 (Б) при контролируемом ГКС и неконтролируемом течении БА у хакасов и в группе контроля

Примечание: * р<0,05

Проводимая базисная фармакотерапия у данной категории больных была представлена высокими дозами ИГКС или сочетанием их системными ГКС.

Изучение полиморфных вариантов генов цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-10

Распределение аллельных вариантов гена ИЛ-4 в позиции -590С>Т и -33Т>С среди жителей Хакасии. Анализ распределения генотипов в точке -590 гена ИЛ-4 среди 100 здоровых коренных жителей Республики Хакасии, выявил преобладание гомозиготного Т/Т и гетерозиготного C/Т варианта (37% и 45% соответственно), над гомозиготным С/С (18%). Частота аллелей С и Т - 40% и 60%. В сопоставлении с данными по популяциям различных регионов Земного шара, распределение частоты генотипов полиморфизма -590С>Т гена ИЛ-4 у коренных жителей Республики Хакасия близко к северомонголоидным популяциям Евразии (Noguchi E et al., 1998; Lee, S.G., 2004; Freidin M.B., 2002).

Проведенный нами анализ частоты аллелей и генотипов в локусе -590 этого гена среди коренных жителей РХ с бронхиальной астмой (61 человек), показал, что частота гетерозиготного генотипа С/Т у пациентов с БА 60,7% что выше, в отличие от группы контроля 45% (чІ = 3,72; р=0,03; OШ=1,88; 95% ДИ 1-3,6 (табл. 2).

В этой связи генотип С/Т полиморфного локуса -590 гена ИЛ-4 можно рассматривать как кандидатный ген аллергической БА, в хакасской популяции.

Таблица 2

Распределение генотипов и частот аллелей полиморфизма в локусе -590 гена ИЛ-4 у здоровых доноров и больных БА

Исследуемые группы	Аллели	Генотипы
	С абс.(%)	Т абс.(%)	С/С абс.(%)	С/Т абс.(%)	Т/Т абс.(%)
Европеоиды	1.С БА n=33	14(21)	52(79)	4(12)	6(18)	23(70)
Хакасы	2. С БА n=61	55(45)	67(55)	9(15)	37(60)	15(25)
	3.Без БА n=100	81(40)	119(60)	18(18)	45(45)	37(37)
Критерии различий, чІ (р1-2)	10,5(0,0006)*		15,56 (0,0008)*	18,09 (0,0002)*
Критерии различий, чІ (р2-3)	0,65(0,2)	0,29 (0,3)	3,72(0,03)*	2,66(0,1)
Примечание: * - обозначены статистически значимые различия между группами , р?0,05.

Известно, коренные и некоренные популяции, проживающие в одинаковых климатогеографических и социально-экономических условиях, имеют значительные различия в полиморфизме генов цитокинов влияющих на патогенез БА. Что доказывает сравнительный анализ полиморфизма сайта -590 гена ИЛ-4 между пациентами с БА коренными и пришлыми.

При анализе частот генотипов и аллелей в области -590 среди европеоидов преобладает «дикий» гомозиготный генотип Т/Т, среди хакасов гетерозиготный С/Т (р<0,001).

В изученных популяциях доминирует встречаемость аллеля Т но среди европеоидов аллель Т встречается достоверно чаще 79%, в отличие от хакасов 55% ( р<0,001).

При анализе полиморфизма промоторной области гена ИЛ-4 в точке -33 среди здорового коренного населения Республики Хакасия показано преобладание гомозиготного Т/Т и гетерозиготного С/Т генотипов (36% и 46% соответственно) над гомозиготным С/С (18%). Частота аллелей Т и С -59% и 41% соответственно.

В опубликованных работах по изучению распределения частоты встречаемости аллелей и генотипов данных локусов гена IL-4 в сопоставлении с данными по популяциям различных регионов Земного шара, у коренных жителей Республики Хакасия распределение частоты генотипов и аллелей близко к северомонголоидным популяциям Евразии (Elliott K., 2001; Choi E.H., 2002; Lee S.G., 2004; Suzuki I., 2000). Следовательно, полученные нами данные свидетельствуют о сходстве частот аллельных вариантов гена ИЛ-4 в позиции -33 и -590 с монголоидным популяциями.

Результаты сравнительного анализа показали достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа С/Т 65,2% (чІ = 5,86; р = 0,02; OШ =2,20; 95% ДИ 1,56-4,17) среди больных БА хакасов в отличие от здоровых 46%. Можно допустить ассоциацию данного генотипа с предрасположенностью к аллергической форме БА в хакасской популяции (табл. 3).

Так же показана расовая специфика в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -33С>Т гена ИЛ-4. У хакасов преобладал генотип С/Т 65,2% и 21,2% у европеоидов (р< 0,001), а у европеоидов Т/Т 69,8% и 22,7% у хакасов (р<0,001). У европеоидов доминировала частота аллеля Т - 80% и 55% у хакасов (р<0,001).

Таблица 3 Распределение генотипов и частот аллелей в промоторной области -33 гена ИЛ-4 у доноров и больных БА

Исследуемые группы	Аллели	Генотипы
	Т n (%)	С n (%)	Т/Т n (%)	С/Т n (%)	С/С n (%)
Европеоиды	1.С БА n=33	53(80,3)	13(19,7)	23(69,8)	7(21,2)	3(9,0)
Хакасы	2.С БА n=66	73(55,3)	59(44,7)	15(22,7)	43(65,2)	8(12,1)
	3.Без БА n=100	118(59)	82(41)	36(36,0)	46(46,0)	18(18,0)
Критерии различий, чІ(р1-2)	11,88(0,0006)*	20,51 (0,0001)*	16,95 (0,0004)*	0,21(0,6)
Критерии различий, чІ (р2-3)	0,44(0,5)	3,29(0,07)	5,86 (0,02)*	1,04(0,3)
Примечание: *-обозначены статистически значимые различия между группами,р<0,05

Бронхиальная астма относится к группе заболеваний трактующихся как экологически обусловленных.

Одним из факторов заставляющим реализовать генетическую предрасположенность к манифесту БА является проживание в городе, что увеличивает риск заболевания в 2 раза (Черняк Б.А., 2008).

Анализ распространенности частот аллелей у хакасов, зависимости от места проживания, выявил: что у городских жителей преобладает частота аллеля С в локусах -590 и -33 гена ИЛ-4 среди пациентов с БА в отличие от здоровых (чІ = 4,18 ; р = 0,04; OШ =1,92; 95% ДИ 1,02-3,62) и (чІ = 6, 33; р = 0,01; OШ =2,24; 95% ДИ 1,19-4,23) соответственно (табл.4).

Можно предположить, что носительство аллеля С в полиморфных областях -590С>Т и -33Т>С гена ИЛ-4 у лиц хакасской национальности, проживающих в городах с индустриальной загрязненностью и интенсивным автомобильным движением, является фактором риска аллергической БА.

Таблица 4

Распределение алелей и генотипов в полиморфном локусах -33 и -590 гена ИЛ-4 в группе хакасов городских жителей, больных БА и здоровых

Локус	Исследуемые группы	Аллели n(%)	Генотипы n(%)
		Т	С	Т/Т	С/Т	С/С
-33	1. С БА n=28	24(42,9)	32(57,1)	3(10,7)	18(64,3)	7(25,0)
	2. Без БА n=67	84(62,7)	50(37,3)	28(41,8)	28(41,8)	11(16,4)
-590	3. С БА n=28	29(51,8)	27(48,2)	6(21,4)	17(60,7)	5(17,9)
	4. Без БА n=67	48(35,8)	86(64,2)	10(14,9)	28(41,8)	29(43,3)
Критерии различий, ч І (р1-2)	6,33(0,01)*		2 4,01(0,04)*	0,95(0,3)
Критерии различий, чІ (р 3-4)	4,18(0,04)*	0,59(0,4)	2 2,84(0,09)
Примечание: * - обозначены статистически значимые различия между группами, р<0,05

Распределение аллельных вариантов гена ИЛ-10 в позиции -592С>А и -1082А>G среди здоровых лиц и больных аллергической бронхиальной астмой. ИЛ-10 является потенциальным противовоспалительным медиатором. Было показано, что увеличение продукции ИЛ-10 сдвигает баланс Th1/ Th2 в сторону увеличения эффектов Th2 цитокинов и приводит к развитию механизмов патогенеза астмы (Jung M. еt аl, 2004). В случае полиморфизма гена ИЛ-10 в локусе -592С>А, у здорового населения Хакасии, нами показано преобладание гомозиготного С/С и гетерозиготного С/А вариантов (31% и 53% соответственно) над гомозиготным А/А (16%).

Частота аллелей С и А - 57% и 43% соответственно. Данные по распределению частот аллелей полиморфизма -592С>А гена ИЛ-10 хакаской популяции занимают промежуточное положение между кавказоидными популяциями Европы и монголоидными популяциями (Kang-Hsi Wu еt аl, 2005; Chatterjee R. еt аl 2005; Trajkov D. еt аl 2008) .

При анализе распространенности генотипов по маркеру -592С>А гена ИЛ-10 обнаружено преобладание гомозигот А/А среди больных БА хакасов в сравнении с группой контроля (ОШ=2,27; 95% ДИ 1,07-4,88; р<0,05) табл. 5.

Таблица 5 Распределение генотипов и частот аллелей полиморфизма в точке -592 гена ИЛ-10 у коренных жителей РХ

Исследуемые группы	Аллели n(%)	Генотипы n(%)
	С	А	С/С	С/А	А/А
Без БА n=100	115(57,5)	85(42,5)	31(31,0)	53(53,0)	16(16,0)
С БА n=66	59(44,7)	73(55,3)	13(19,7)	33(50,0)	20(30,3)
чІ ( р)	5,23(0,01)*	2,61(0,1)	0,14(0,7)	4,79(0,01)*
Примечание: * - обозначены статистически значимые различия между группами, р<0,05.

Анализ частот встречаемости аллелей в изучаемых группах позволил выявить преобладание носителей аллеля А среди пациентов, страдающих БА, в сравнении со здоровыми лицами (ОШ=1,67; 95% ДИ 1,07- 2,61; р<0,05). Таким образом, носительство аллеля А и гомозиготного генотипа А/А полиморфного локуса -592 гена ИЛ-10 является фактором риска формирования аллергической БА в хакасской популяции.

Показана расовая специфика в распределении частот генотипов полиморфного участка -592С>А гена ИЛ-10 у больных БА коренного и пришлого населения Хакасии: отмечается достоверное преобладание гомозиготного генотипа С/С среди европеоидов 57,6%, у хакасов 19,7% соответственно (чІ = 14,43; р<0,001) и гомозиготного А/А среди хакасов 30,3% у европеоидов 12,1% (чІ = 3,916; р < 0,05). У европеоидов больных БА преобладал аллель С - 73% , а у хакасов аллель А - 55% (чІ = 13,92; р < 0,001).

При сравнении частот аллелей данного локуса в зависимости от тяжести БА получены достоверные различия. Нами показало, что в группе больных БА с тяжелым течением заболевания отмечалась тенденция к увеличению встречаемости аллеля А 68,7% в сравнении с 42,5% в группе контроля (ч²=6,32; р=0,01, OШ=2,93; 95% ДИ=1,60-6,19) (табл. 6).

Таблица 6

Распределение частот аллелей полиморфного локуса -592 гена ИЛ-10 в группах больных с различным течением БА и контроля у коренных жителей

Аллели	Контрольная группа n (%)	Хакасы с БА n (%)
		легкое	средней тяжести	тяжелое
С	115(57,5)	25(59,5)	16(34,8)	10(32,3)
А	85(42,5)	17(40,5)	30(65,2)	22(68,7)*

Примечание: * - обозначены статистически значимые различия между группами, р<0,05

Показатели нарушения ФВД коррелировали с тяжестью заболевания. Уровень ОФВ₁ является признаком, характеризующим тяжесть бронхиальной астмы. Отмечено преобладание аллеля А в точке -592 гена ИЛ-10 (р<0,001) при более низких показателях ОФВ1 (< 60%), и аллеля С при ОФВ1>80% (р<0,001) табл. 7.

Таблица 7

Распределение частот аллелей в промоторном регионе -592 гена ИЛ-10 в зависимости от показателей ОФВ₁

Аллель	ОФВ1< 60% n(%)	ОФВ1 60-80% n(%)	ОФВ1> 80% n(%)
С	9(25)	19(41,3)	33(68,8)*
А	27(75)*	27(58,7)	15(31,2)

Примечание: * обозначены статистически значимые различия, р < 0,001

Результаты проведенного нами исследования доказывают наличие ассоциации аллеля А в локусе -592 гена ИЛ-10 с тяжестью течения БА в хакасской популяции.

Известно, что продукция провоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами у больных БА взаимосвязана с экспозицией аллергена и IgE-ответом (Воробьев А.А., 2006). Установлена ассоциация аллеля А в точке -592 гена ИЛ-10 с валентностью сенсибилизации. При моновалентной сенсибилизации чаще встречался аллель С (68,8%), при поливалентной аллель А (69,1%), соответственно ( р < 0,001). Таким образом, носительство аллеля А полиморфизма -592С>А гена ИЛ-10 предрасполагает к поливалентной сенсибилизации у лиц хакасской национальности.

При оценке частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -1082А>G гена ИЛ-10, у здоровых коренной национальности, нами показано значительное преобладание частоты гомозиготного А/А (54%) и гетерозиготного G/A(39%) вариантов над гомозиготным G/G(7%). Частота аллелей G-26% и А-74% соответственно. Наши данные по распределению частот аллелей полиморфизма гена ИЛ-10 А-1082G жителей Республики Хакасии занимают промежуточное положение между европейскими и азиатскими популяциями (Crawley E. еt аl, 1998; Turner D.M. еt аl, 1997).

При изучении полиморфизма промоторного региона гена ИЛ-10 в точке (-1082) нами получены следующие результаты: у коренного населения Республики Хакасия с БА преобладает гетерозиготный А/G и гомозиготный А/А вариант (40% и 49,3% соответственно) над гомозиготным G/G (10,7%). Распределение частот аллелей и генотипов в группах хакасов с аллергической БА и здоровых лиц не имело статистических различий (р>0,05).

При исследовании обнаружены особенности распределения частот генотипов и в точке -1082 гена ИЛ-10 у больных БА хакасов и европеоидов проживающих на одной территории: у пришлых преобладал гетерозиготный генотип А/G (54,5%), а у коренных гомозиготный А/А (49,3%) р< 0,001.

Это обстоятельство представляется важным в связи с тем, что закономерности распространения БА также имеет свои особенности в популяциях различающегося национального состава. Возможно, такая специфика обусловлена различиями в частотах “патогенетически значимых” аллелей генов-кандидатов заболеваний.

При анализе распределения частот аллелей в области -1082 гена ИЛ-10 в зависимости от скоростных показателей ФВД (ОФВ1) выявлены различия (табл. 8). Отмечалось преобладание аллеля А при показателях ОФВ1<80% (р<0,05), т.е. носительство аллеля А -1082 определяет выраженную обструкцию дыхательных путей.

Таблица 8

Распределение генотипов и частот аллелей полиморфизма гена ИЛ-10 локуса -1082 в зависимости от показателей ФВД

Генотипы, аллели	ОФВ1 < 59% n(%)	ОФВ1 60-79% n(%)	ОФВ1 > 80% n(%)
А	27(75)*	35(76,1)*	28(58,3)
G	9(25)	11(23,9)	20(41,7)

Примечание: * - обозначены статистически значимые различия между группами, р<0,05.

При оценке ассоциации различных комбинаций изучаемых генотипов с риском развития БА у хакасов, страдающих данной патологией, было обнаружено значительное различие в частотах комбинации генотипов -33СТ/ -592АА полиморфных областях -33Т>С гена ИЛ-4 и -592С>А гена ИЛ-10 в группе больных с БА и в контрольной выборке. Что указывает на рисковую значимость данного сочетания генотипов в развитии БА, у хакасов 22,7% и 7% соответственно в группе контроля (чІ = 8,81; р < 0,01; ОШ =3,63; 95%ДИ 1,02 - 8,28).

Так, комбинация генотипов -590ТТ / -33ТТ гена ИЛ-4 встречалась статистически значимо реже в группе хакасов с БА 10% в отличие от здоровых 33% (чІ = 5,34; р<0,05; OШ=0,39; 95% ДИ 0,07-0,33). Данная комбинация генотипов указывает на протективное значение в отношении развития БА в хакасской популяции.

ВЫВОДЫ

1. У больных БА хакасов в отличие от здоровых выявлены: дисбаланс в содержание CD3+, CD4+, CD8+-лимфоцитов периферической крови, снижение CD56+ клеток, увеличение содержания В-лимфоцитов (CD22+) и иммуноглобулинов основных классов (A, M, G, E) в сыворотке крови. У больных БА европеоидов достоверное снижение содержания субпопуляций лимфоцитов - CD3+, CD8+ в сыворотке крови в отличие от хакасов. В обеих популяциях у больных БА выявляются однотипные изменения, свидетельствующие о нарушенной регуляции иммунного ответа.

2. В выборке больных БА коренной национальности отмечается достоверное повышение концентрации ИЛ-4 и ИЛ-10 в сыворотке крови показателей средней популяционной нормы, причем у больных БА хакасов содержание ИЛ-4 достоверно превышает значения больных европеоидов. При медикаментозно контролируемом течении болезни, сывороточные уровни ИЛ-4 и ИЛ-10 не отличались у хакасов с БА от контрольных значений.

3. Установлено, что исследованные молекулярно-генетические маркеры генов ИЛ характеризуются расовой специфичностью. У коренных жителей Республики Хакасии распределение аллельных вариантов гена ИЛ-4 ( в локусах -33 и -590) соответствует монголоидным популяциям, а ИЛ-10 (-592 и -1082) занимают промежуточное положение между европеоидными и монголоидным популяциями.

4. Показано, представители популяций европейского и азиатского происхождения, проживающие в Хакасии, имеют очевидные отличия в генетических маркерах предрасположенности к аллергической бронхиальной астме. Частоты аллельных вариантов генов ИЛ-4 в точке -33 и -590, ИЛ-10 в области -592 и -1082 у больных БА коренных жителей достоверно различаются с пришлыми, больными БА.

5. Факторами риска развития атопического бронхиальной астмы в популяции хакасов являются наличие в геноме пациента генотипа СТ в промоторных зонах гена ИЛ-4 -590С>Т и -33Т>С, аллеля А и генотипа АА полиморфного участка -592С>А гена ИЛ-10.

6. Носительство аллеля С полиморфных областях -590 и -33 гена ИЛ-4 у лиц хакасской национальности, проживающих в городах, является фактором риска развития аллергической БА.

7. Выявлено, что генетическим маркером пониженного риска возникновения аллергической бронхиальной астмы у хакасов является сочетание генотипов ТТ / ТТ полиморфных локусах -590 и -33 гена ИЛ-4.

8. Установлено, что аллель А полиморфного локуса -592 гена ИЛ-10, у лиц коренной национальности с БА, ассоциированы с выраженным нарушением функции внешнего дыхания, тяжестью заболевания и с валентностью сенсибилизации (у носителей данного генотипа достоверно чаще встречается поливалентная сенсибилизация). А носительство аллеля G в точке -1082 гена ИЛ-10 предрасполагает легким нарушениям ФВД и течения заболевания.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исследование полиморфизма генов ИЛ-4 и ИЛ-10 у больных бронхиальной астмой / А.А. Пискунов, Е.А. Андрейчикова, А.Н. Силков, А.С. Жовмер, С.В.Сенников, В.А. Козлов // Омский научный вестник. - 2007. - №3(61). - С.202-204.

2. Состояние системного иммунитета у коренного населения с бронхиальной астмой в Хакасии / Е.А. Андрейчикова, В.А. Козлов // ЧЙ ежегодная межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицины». - Абакан. - 2008. - С. 92-96.

3. Полиморфизм гена интерлейкин 4 у коренных жителей республики Хакасия, больных аллергической бронхиальной астмой / Е.А. Андрейчикова // ЧЙЙ ежегодная межрегиональная научно-практическая конференция «Вопросы сохранения и развития здоровья Республики Хакасия». - Абакан. - 2009. - С. 54-56.

4. Популяционные особенности полиморфизма генов цитокинов (IL-4, IL-10) у коренных жителей Республики Хакасия больных аллергической бронхиальной астмой / Е.А. Андрейчикова, Ю.А. Сенникова, А.А. Пискунов, С.В. Сенников, В.А. Козлов // Цитокины и воспаление. - 2009. - № 4. - С. 37-40

5. Состояние системного иммунитета у больных аллергической бронхиальной астмой Республики Хакасия / Е.А. Андрейчикова, Ю.А. Сенникова, В.А. Козлов // Медицинская иммунология. - 2009. - № 2 . - С.273-278

6. Изменения цитокинового статуса у пациентов с бронхиальной астмой / Е.А. Андрейчикова // ЧЙY ежегодная межрегиональная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы медицины». - Абакан. - 2011. - С. 92-96.

7. Сравнительные аспекты аллельного полиморфизма гена IL-4 у коренных и пришлых жителей Республики Хакасия больных аллергической бронхиальной астмой / / Е.А. Андрейчикова, А.А. Пискунов, С.В. Сенников, В.А. Козлов // Бюллетень СО РАМН. - 2011. - № 4 . - С.56-59

Размещено на Allbest.ru

...