Размещено на http://www.allbest.ru/

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Количество TREC в периферических Т-лимфоцитах человека в норме и при иммунопатологических состояниях

14.03.09 - «Клиническая иммунология, аллергология»

Блинова Елена Андреевна

Новосибирск 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт клинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

Аутеншлюс Александр Исаевич доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, руководитель лаборатории физико-химической индикации иммунных процессов;

Лопатникова Юлия Анатольевна кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт улинической иммунологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук старший научный сотрудник лаборатории молекулярной иммунологии.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Государственный научный центр Института иммунологии ФМБА России (г. Москва).

Защита состоится «10» мая 2012 г. на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН

Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Тимус является центральным органом иммунной системы, который создает специфическое микроокружение для созревания и селекции Т-лимфоцитов, несущих Т-клеточный рецептор бв-типа (95% периферических Т-клеток) и гд-типа (5%). Созревание по тимусзависимому пути обеспечивает разнообразие репертуара Т клеток, необходимого для иммунного ответа на большое число антигенов, также этот процесс помогает поддерживать Т-клеточный пул на периферии. С возрастом происходит сокращение объема островков в тимусе, где осуществляется процесс тимопоэза [Steinmann G.G., 1986]. Данное явление было обозначено инволюцией тимуса. В последнее время ее рассматривают как одну из основных причин связанного с возрастом снижения функций иммунной системы.

Т-клеточный гомеостаз в организме определяется балансом между процессами образования лимфоидных клеток и их гибели [Freitas A.A., 2000]. Известно, что у взрослых людей наивные Т-лимфоциты пролиферируют с небольшой интенсивностью: делению на периферии подвергается около 1% клеток, в равной степени CD4⁺ и CD8⁺ [Hazenberg M.D., 2004; Sachsenberg N.,1998]. При многих аутоиммунных заболеваниях, лимфомах, миеломах наблюдается изменение показателей Т-клеточного гомеостаза (общего количества лимфоцитов, соотношения CD4⁺/CD8⁺, CD45RA⁺/CD45RO⁺ лимфоцитов и др.), и механизмы пополнения наивных Т-клеток в этих условиях отличаются от таковых в норме. У человека, несмотря на то, что для наивных CD4⁺ лимфоцитов выявлен поверхностный маркер CD31, точно определить количество клеток, недавно мигрировавших из тимуса довольно трудно, так как CD4⁺CD31⁺ клетки способны к самоподдержанию на низком уровне с сохранением экспрессии CD31 [Kohler S., 2009]. Однако во время созревания в тимусе при перестройке генов Т-клеточного рецептора в тимоцитах образуется последовательность кольцевой ДНК, или TREC, которая присутствует в наивных Т-лимфоцитах периферической крови. Измерение количества TREC методом количественной полимеразной цепной реакции позволяет выявить клетки, недавно вышедшие из тимуса, и, таким образом, оценить функциональную активность тимуса [Douek D.C., 1998; Kong F.K., 1999].

Предполагается, что эта нехромосомная кольцевая ДНК не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. При стимуляции выделенных из пуповинной крови Т-лимфоцитов антителами против CD3 и CD28 антигенов наблюдалось уменьшение относительного количества TREC, поэтому для оценки функциональной активности тимуса необходимо учитывать время жизни наивных клеток и скорость обновления периферического пула Т-клеток [Douek D.C., 1998; Hazenberg M.D., 2003]. В связи с этим представляется актуальным исследовать динамику TREC в зависимости от количества совершенных периферическими Т-лимфоцитами делений в условиях поликлональной активации in vitro.

Низкий уровень TREC выявлен при таких заболеваниях, как вариабельный неклассифицируемый иммунодефицит, кожная Т-клеточная лимфома, рассеянный склероз [Gauzzi V., 2002; Yamanaka K-i., 2005; Hug A., 2003]. При ВИЧ-инфекции на ранней стадии наблюдается увеличение количества TREC в CD4⁺ Т-клетках, что можно объяснить как увеличением гибели зрелых CD4⁺ Т-клеток, так и большей по сравнению со здоровыми донорами продукцией тимуса [Nobile M., 2004]. На поздней стадии ВИЧ-инфекции количество TREC значительно снижается, что может быть обусловлено снижением тимопоэза в следствие дефектов костномозговых предшественников лимфоидной линии [Clark D.R., 2000]; тем не менее после успешной противовирусной терапии оно способно восстановиться до нормальных значений [Steffens C.M., 2001; Franco J.M., 2002]. Кроме того, определение количества TREC используют для оценки вклада тимопоэза в восстановление Т-клеточного пула на периферии после аллогенной трансплантации стволовых кроветворных клеток или костного мозга [Farge D., 2005]. Интересно, что как у детей, так и у взрослых количество TREC достигает границы нормы примерно спустя 6 месяцев после трансплантации [Chen X., 2005; Hazenberg M.D., 2002].

Показано, что при ревматоидном артрите количество CD4⁺ Т-клеток, содержащих TREC, снижено настолько, что у пациентов в 20-30 лет оно соответствует количеству таких клеток у здоровых людей в 50-60 лет. Предположительно, это связано с нарушением генерации новых Т-клеток, экспансией олигоклональных Т-клеток на периферии, что приводит к укорочению теломер и ускоренному старению популяции Т-лимфоцитов в целом [Koetz K., 2000].

В патогенезе атопического дерматита и бронхиальной астмы ключевую роль играют Т-лимфоциты, которые отвечают на антигенную стимуляцию активацией, пролиферацией и синтезом цитокинов. Свидетельством такой репликативной истории клеток является ускоренное сокращение теломерных районов ДНК на концах хромосом [Борисов В.И., 2007]. Актуальным представляется исследование механизмов поддержания периферического пула Т-лифоцитов при данных заболеваниях, и сравнение их с таковыми в норме и при ревматоидном артрите.

Цель исследования: На основе исследования абсолютного и относительного количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов оценить вклад мигрирующих из тимуса наивных клеток в поддержание Т-клеточного пула на периферии в норме, при атопическом дерматите, бронхиальной астме и ревматоидном артрите.

Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные условия для количественного определения TREC методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

2. Изучить динамику TREC-позитивных лимфоцитов в зависимости от числа совершенных CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитами делений при поликлональной активации in vitro.

3. Определить количество TREC в CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитах у здоровых доноров и у больных атопическим дерматитом, бронхиальной астмой, ревматоидным артритом.

4. Оценить число CD31-позитивных Т-клеток и количество TREC в них в норме, при атопическом дерматите, бронхиальной астме и ревматоидном артрите.

Научная новизна. В работе показано снижение количества TREC в зависимости от числа совершенных CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитами делений в условиях поликлональной стимуляции in vitro, что подтверждает предположение о переходе данной молекулы при делении только к одной из дочерних клеток.

В результате исследования впервые охарактеризован вклад мигрирующих из тимуса лимфоцитов в пополнение Т-клеточного пула при патологиях, сопровождающихся укорочением длины теломер в иммунокомпетентных клетках. Установлено, что у пациентов с ревматоидным артритом регистрируется снижение относительного количества TREC-содержащих лимфоцитов и абсолютного количества CD8⁺TREC⁺ клеток в периферической крови. Пациенты с атопическим дерматитом характеризуются уменьшением относительного количества TREC в субпопуляциях CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов на фоне повышенного абсолютного количества клеток в мм³ крови в данных субпопуляциях. Учитывая отсутствие изменений у больных данной категории по содержанию TREC-позитивных клеток среди CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺ лимфоцитов, полученные данные свидетельствуют о большем по сравнению с нормой вкладе периферической экспансии в поддержание Т-клеточного пула.

Впервые показано, что пациенты с длительностью заболевания бронхиальной астмой менее одного года демонстрируют увеличение абсолютного и относительного количества TREC в CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитах по сравнению с донорами и пациентами с давностью заболевания более одного года. В совокупности с повышенным количеством TREC среди CD31-позитивных клеток эти данные говорят о более интенсивном при бронхиальной астме пополнении периферического пула Т-лимфоцитов за счет мигрирующих из тимуса клеток.

Научно-практическая значимость работы. На основе плазмиды pBluskript создан оригинальный стандарт, который позволяет количественно определять молекулы TREC в субпопуляциях Т-лимфоцитов методом ПЦР в режиме реального времени.

Полученные данные расширяют представление об иммунопатогенезе атопического дерматита, бронхиальной астмы и ревматоидного артрита и позволяют визуализировать механизмы пополнения периферического пула Т-клеток. Изменение относительного и абсолютного количества TREC-позитивных клеток в субпопуляциях Т-лимфоцитов указывает на изменение соотношения процессов тимопоэза и периферической экспансии при заболеваниях аллергической и аутоиммунной природы.

Результаты исследования лягут в основу для разработки новых подходов по оценке функциональной активности тимуса при различных патологических состояниях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Количество TREC в CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитах в условиях поликлональной стимуляции in vitro уменьшается в геометрической прогрессии в зависимости от числа совершенных клетками делений, свидетельствуя о том, что данная кольцевая структура не реплицируется в процессе митоза и передается одной из дочерних клеток.

2. Изменения абсолютного и относительного количества клеток, содержащих TREC, а также общего числа CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов отражают изменения соотношения процессов тимопоэза и периферической экспансии в поддержании Т-клеточного пула на периферии при иммунопатологических заболеваниях.

Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (г. Красноярск, 2010), на 14 Международном иммунологическом конгрессе - 14^th International Congress of Immunology (Kobe, Japan, 2010), на XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2011), 8-ой отчетной конференции ГУ НИИ КИ СО РАМН «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике» (г. Новосибирск, 2011). Апробация диссертации состоялась 13 марта 2012г. на семинаре ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 117 страницах машинописного текста, включающего 8 таблиц и 13 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 205 литературных источников, в том числе 196 зарубежных.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук.

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю д.м.н., проф. В.С. Кожевникову за помощь и поддержку, оказанную при работе над диссертацией, к.б.н. М.Л. Филипенко и Е.А. Храпову сотрудникам группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск за участие в разработке стандарта, а также д.м.н., проф. С.В. Сенникову и сотрудникам лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН, особенно к.б.н. А.Н. Силкову за советы и всестороннюю поддержку.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Объекты исследования. В исследовании были использованы мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из периферической крови 50 условно здоровых доноров, а также 38 пациентов с атопическим дерматитом, 62 пациентов с бронхиальной астмой и 41 пациента с ревматоидным артритом, находившихся на лечении в клинике иммунопатологии СО РАМН, г. Новосибирск в стадии обострения основного заболевания.

Метод получения мононуклеарных клеток периферической крови. К венозной крови, стабилизированной с гепарином, добавляли 10% желатин, и инкубировали в термостате 30 минут при 37°C. Полученную в результате лейковзвесь разбавляли забуференным физиологическим раствором с EDTA (ЗФР-EDTA) и центрифугировали в градиенте фиколл-верографина. Кольцо мононуклеарных клеток собирали и двукратно отмывали ЗФР-EDTA. Осадок суспендировали в ЗФР-EDTA, подсчитывали количество клеток в камере Горяева и хранили в FBS c 10% DMSO в морозильной камере при -80° C.

Протокол культивирования Т-лимфоцитов периферической крови. МНК, полученные из периферической крови, ресуспендировали в 2 мл среды RPMI-1640, дополненной 0,3 мг/мл L-глютамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мкг/мл тиенама. Затем окрашивали витальным красителем CFSE (конечная концентрация 2 мкМ) 15 минут в темном месте при комнатной температуре, центрифугировали в течение 5 минут при 1 200 об/мин. Избыток красителя удаляли полной средой, содержащей 10% инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS). Окрашенные клетки помещали в лунки 6-луночного планшета из расчета 1,5-2 млн клеток на 1 мл полной среды с 10% FBS и культивировали в присутствии и отсутствии активаторов (1 мкл/мл анти-CD3 антител и 50 ед/мл IL-2). По мере необходимости (по состоянию культуры) клетки рассаживали и добавляли 50% среды с таким же составом. На 7 сутки культивирования клетки собирали, осаждали в течение 5 минут при 1 200 об/мин, ресуспендировали в ЗБФ-EDTA и подсчитывали количество клеток в камере Горяева.

Метод сортировки субпопуляций (CD4⁺ и CD8⁺, CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺) Т-лимфоцитов. Для сортировки использовали 2-4 млн клеток на одну пробу. МНК метили анти-CD3-FITC и анти-CD4-PE (и анти-CD31-APC) 20 минут, затем отмывали 1 мл ЗФР-EDTA. Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 1 000 об/мин, осадок ресуспендировали в 350 мкл ЗФР-EDTA, NaN₃ и 3% FBS. Сортировку клеток проводили на сортере FACS Aria (Becton Dickinson, США). По параметрам прямого и бокового светорассеивания выделяли лимфоцитарную область. По каналу флуоресценции соответствующего флуорохрома определялись гейты отдельных субпопуляций клеток, которые подвергались сортировке. Чистота выделенных субпопуляций Т-лимфоцитов составляла 90-98%.

Определение количества TREC методом количественной ПЦР в режиме реального времени. ПЦР проводили в приборах “IQ Cycler 5” (Bio-Rad) и CFX-96 (Bio-Rad) с детекцией результатов амплификации в режиме реального времени. Геномную ДНК выделяли из субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов набором «Проба-ГС» («ДНК технология»).

Реакционная смесь в объеме 25 мкл содержала 5 мкл элюата с ДНК, 2 ед. Hot Start Taq ДНК-полимеразы. Концентрация dNTP составляла 200 мкМ, концентрация праймеров и зонда - 0,2 мкМ каждого. Реакционный буфер содержал 67 мМ трис-HCl (pH 8,8 при 25єС), 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 3 мМ MgCl₂. Режим термоциклирования: 1 шаг - денатурация и активация полимеразы: 3 минуты 95єС, затем 2 шаг - амплификация 35-50 циклов: 20 секунд 95єС, 15 секунд 60єС, 30 секунд 72єС. Последний 3 шаг составлял 10 секунд 15єС. Измерение уровня флюоресценции проводили на каждом цикле при температуре 60єС. полимеразный дерматит бронхиальный

Кольцевые молекулы TREC, образующиеся при реаранжировке Т-клеточного рецептора б, амплифицировали в режиме реального времени с использованием методики TaqMan. Последовательность прямого праймера для TREC дREC-шJб имела следующий вид 5?-CCCTTTCAACCATGCTGACAC-3?, обратного праймера - 5?-GGGTGCAGGTGCCTATGC-3?, флуоресцентного зонда - FAM~TCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACTCCTG-BHQ1 [Komanduri K.V., 2007]. В качестве референтного гена использовали ген «домашнего хозяйства» CCR5, который кодирует один из рецепторов в-хемокинов, преимущественно экспрессирующийся на Т-клетках. Специфические праймеры и флуоресцентный зонд для гена CCR5: 5?-TACCTGCTCAACCTGGCCAT-3? (прямой), 5?-TTCCAAAGTCCCACTGGGC-3? (обратный), FAM~TTTCCTTCTTACTGTCCCCTT CTGGGCTC-BHQ1 [Halnon N.J., 2005]. Синтез и очистка олигонуклеотидов были осуществлены группой олигонуклеотидного синтеза под руководством Рябинина В.А., ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск.

Для определения количества молекул TREC и количества клеток (половина от вносимого количества ДНК) использовали серию разведений стандартов 10¹-10⁵ с теми же праймерами и зондами, а также условиями амплификации. В качестве негативного контроля выступала деионизированная вода. Все образцы, все разведения стандарта и негативный контроль раскапывались в 96-луночную плашку в дублях отдельно для определения количества молекул TREC и вносимого количества ДНК. Значение определяли в прилагавшейся к прибору программе (Bio-Rad iQ5 или Bio-Rad CFX Manager) по пороговому циклу Ct и калибровочной прямой, полученной с помощью серии разведений стандарта. Результаты представляли в виде количества молекул TREC на 10⁶ CD4⁺- или CD8⁺-клеток или абсолютного количества TREC в мм³.

Изготовление стандарта. Разработка и изготовление стандартов для TREC и CCR5 на основе плазмиды pBluskript осуществлялись на базе группы фармакогеномики под руководством Филипенко М.Л., институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск. Были использованы стандартные методики: элюция нуклеиновых кислот из полиакриламидного геля, экстракция ДНК смесью фенол-хлороформа, трансформация бактерий E. coli Т-вектором со встроенными фрагментами, микро- и макровыделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток.

Сиквенс встроившегося фрагмента TREC дREC-шJб

5?GGGTGCAGGTGCCTATGCATCACCGTGCACAGGAGTGGGCACCTTTACAAAAACCAGAGGTGTCAGCATGGTTGAAAGGGG3? (82 основания)

Сиквенс встроившегося фрагмента гена CCR5

5?TACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGACCTGTTTTTCCTTCTTACTGTCCCCTTCTGGGCTCACTATGCTGCCGCCCAGTGGGACTTTGGAAA3? (92 основания)

Статистическая обработка. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ “Statistica 6.0” [Боровиков В.П., 1997]. Методы описательной статистики применялись на предварительном этапе сопоставления показателей различных групп. На основании варьирования показателя, численности выборок, а также закономерности распределения использовали непараметрические методы представления данных в виде медианы и интерквартильного размаха (25%-75%). Сравнение вариационных рядов осуществлялось с помощью непараметрического U критерия Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Оптимизация реакции ПЦР в режиме реального времени для определения количества TREC в популяциях Т-лимфоцитов. В начале работы необходимо было оптимизировать реакцию ПЦР в режиме реального времени. Экспериментальным путем была подобрана концентрация термостабильной Taq ДНК-полимеразы, специфических праймеров и флюоресцентных зондов для гена CCR5 и молекулы TREC, образующейся при реаранжировке генов б-цепи TCR. Эффективность подобранных концентраций оценивали после проведения реакции ПЦР в режиме реального времени по отсутствию неспецифических продуктов амплификации и димеров праймеров при электрофоретическом разделении ампликонов в 8% ПААГ (рис. 1).

Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% ПААГ

Примечание: М - маркер молекулярного веса ДНК MspI гидродизат pBluescript (710 пн, 489 пн, 404 пн, 328 пн, 242 пн, 190 пн, 157 пн, 147 пн, 110 пн, 67 пн, 57 пн, 34 пн, 26 пн).

Для того чтобы подтвердить специфичность реакции, помимо электрофоретического разделения продуктов амплификации после ПЦР, измеряются их кривые плавления [Nolan T., 2006]. При этом вместо технологии TaqMan используется интеркалирующий флюоресцентный краситель SYBR Green, уровень флюоресценции которго возрастает при связывании двуцепочечной ДНК. Прибор измерял уровень флюоресценции в образцах на каждый градус, начиная с 55єС и до 95єС, и автоматически определял количество пиков и соответствующую им температуру плавления ампликонов. Кривая плавления продуктов реакции ПЦР для гена CCR5 имела один единственный пик с температурой плавления 79єС, и в случае TREC - пик с температурой плавления 78єС.

Был проведен еще один дополнительный эксперимент, в котором подтверждается специфичность выбранных праймеров (рис. 2). В реакцию ПЦР в режиме реального времени в качестве образцов использовали ДНК, выделенную из линий опухолевых клеток BRO и K562, а также из МНК, CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов. Клетки опухолевой линии меланомы человека BRO и опухолевой линии хронической миелоидной лейкемии человека К562 были получены из Онкологического центра РАМН (г. Москва). Эти клетки характеризуются отсутствием поверхностных маркеров В- и Т-лимфоцитов, следовательно, в них не происходила VDJ-рекомбинация.

Рис. 2. Относительное количество TREC в образцах опухолевых линий, МНК и субпопуляций Т-клеток

Примечание: Unkn-1 - опухолевая линия BRO, Unkn-2 - опухолевая линия K562, Unkn-3 - МНК, Unkn-4 - CD4+ лимфоциты, Unkn-5 - CD8+ лимфоциты. На диаграмме представлено среднее значение и стандартная ошибка.

При анализе количества TREC, нормализованного относительно количества CCR5, оказалось, что в линиях опухолевых клеток в небольшом количестве амплифицируется неспецифический продукт, возможно, за счет достаточно большого количества внесенной геномной ДНК. Образцы, где использовалась ДНК, выделенная из МНК и чистых субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов, содержат гораздо большее количество TREC. Относительное количество TREC в МНК отличается от такового в CD4⁺- и CD8⁺-клетках, вследствие того, что в состав этого клеточного пула помимо Т-лимфоцитов входят еще моноциты. Именно они влияют на количество вносимой в реакцию ДНК, и уменьшают истинное количество TREC. CD4⁺- и CD8⁺-лимфоциты демонстрируют сопоставимый уровень TREC.

Неизвестное количество TREC и вносимой ДНК в образцах определялось по калибровочным прямым, построенным по серии разведений соответствующего стандарта для TREC и CCR5. Тангенс угол наклона калибровочной прямой составлял не более -3,2 с коэффициентом корреляции R²>0,98, что соответствовало общепринятым значениям [Nolan T., 2006]. Разница в пороговом цикле Ct между дублями составляла не более 0,5 цикла. Все перечисленные критерии необходимы для стандартизации анализированных данны. Таким образом, оптимизация реакции ПЦР является ключевым этапом в исследовании, она позволяет достичь высокой чувствительности, специфичности и воспроизводимости данного метода.

Взаимосвязь количества TREC и возраста. С возрастом происходит инволюция тимуса и уменьшается количество островков, где происходит процесс тимопоэза. Это, в свою очередь, сказывается на количестве наивных Т-клеток, выходящих из тимуса. Во многих исследованиях показано, что концентрация TREC в пуле Т-клеток довольно хорошо отражает этот процесс [Douek D.C., 1998; Zhang L., 1999; Донецкова А.Д., 2010]. Количество TREC определяли в субпопуляциях CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов у 40 условно здоровых доноров (мужчины и женщины) методом ПЦР в режиме реального времени. Был выбран возрастной диапазон от 22 до 62 лет. С возрастом, действительно, наблюдается уменьшение количества TREC в Т-лимфоцитах на периферии, что говорит о снижении функциональной активности тимуса.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Изменение количества TREC для CD4⁺-клеток (А) и для CD8⁺-клеток (Б) при культивировании in vitro с поликлональной активацией и без активации. Примечание: для каждой переменной отображены: среднее, стандартная ошибка и стандартная девиация; * - отличие по уровню TREC в Т-лимфоцитах до культивирования и после культивирования с поликлональной активацией р<0,01.

В обеих субпопуляциях Т-лимфоцитов уровень TREC значительно снизился в поликлонально стимулированных клетках, которые активно пролиферировали в течение 7 суток (p<0,01). В клетках, культивируемых без активации анти-CD3 антителами и IL-2, относительное количество TREC осталось практически на том же уровне.

Предполагается, что TREC не реплицируется в митозе и в процессе деления клетки переходит лишь к одной из дочерних клеток. Как меняется количество TREC в популяциях CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов при культивировании in vitro в зависимости от числа совершенных делений, было установлено с помощью витального красителя CFSE. В течение 7 дней стимулированные анти-CD3 антителами и IL-2 Т-лимфоциты в среднем совершили 6-7 делений. Перед выделением ДНК и последующим определением количества TREC клетки сортировали на неделившиеся и прошедшие 1, 2 и 3 деления субпопуляции CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов. Наибольшее количество TREC демонстрировали неделившиеся клетки («0» точка). Затем уже на первом делении это количество снижалось и значительно падало на 2 и 3 делениях. Так как возраст доноров варьировал от 24 лет до 41 года, то исходное количество TREC сильно различалось в группе. Поэтому, чтобы установить зависимость между уровнем TREC и количеством совершенных Т-лимфоцитами делений, все полученные значения были нормализованы по количеству TREC в неделившихся клетках (рис. 5). Теоретическая кривая построена на основе предположения, что молекула TREC при делении клетки не разрушается внутриклеточными ферментами нуклеазами, но и не реплицируется, а переходит лишь к одной из дочерних клеток.

Рис. 5. Динамика относительного количества TREC в зависимости от количества пройденных Т-лимфоцитами делений in vitro

Примечание: «0» делению соответствуют неделившиеся клетки; за 1 принято число TREC в неделившихся клетках. Представлен средний результат по 5 донорам.

Кривые по динамике уровня TREC в зависимости от количества делений имеют схожий вид для субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов и близки к предсказанной теоретической кривой. То, что уровень TREC в CD4⁺-клетках снижается несколько быстрее, чем в CD8⁺-клетках, можно объяснить тем, что CD4⁺ лимфоциты больше подвержены активационному апоптозу. После 7 суток культивирования происходит снижение количества CD4⁺-клеток с 44,5±5,4 % до 35,7±6,5 % и увеличение CD8⁺-клеток с 20,8±2,3 % до 44,4±3,6 % (критерий Манна-Уитни p<0,01). При этом суммарный уровень апоптоза в культуре для CD4⁺ лимфоцитов повысился с 0,24 % до 1,12 % (p<0,05), тогда как для CD8⁺ лимфоцитов наблюдалась лишь тенденция к его увеличению с 0,45 % до 0,77 % (p=0,07). В зависимости от количества совершенных делений процент клеток, находящихся в апоптозе постепенно увеличивался и достигал максимума на 5 делении (табл. 1). Несмотря на это, однофакторный дисперсионный анализ не выявил зависимости между уровнем апоптоза и числом совершенных Т-лимфоцитами делений (для CD4⁺ F=2,18 p=0,063; для CD8⁺ F=0,75 p=0,59). Достоверных различий между субпопуляциями CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов по количеству клеток, находящихся в фазе апоптоза, в зависимости от числа совершенных ими делений выявлено не было. Исключение составляют CD4⁺-клетки, поделившиеся 3 раза, для которых уровень апоптоза имел тенденцию к увеличению по сравнению с CD8⁺-клетками.

Таблица 1. Количество CD4⁺ и CD8⁺ клеток, находящихся в фазе апоптоза (%), в зависимости от числа совершенных Т-лимфоцитами делений in vitro

ME (P25-P75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%). «0» соответствует неделившимся клеткам. * - отличие от неделившихся клеток p<0,05, # - отличие между популяциями CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов p=0,053 (критерий Манна-Уитни).

Количество TREC при ревматоидном артрите. В исследование была включена группа пациентов с РА, n=30 и группа здоровых доноров, n=15. При РА наблюдалось достоверное сокращение по сравнению с донорами числа клеток, содержащих TREC, в популяциях CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов (табл. 2).

Таблица 2. Относительное количество TREC в популяциях CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов при ревматоидном артрите

ME (P25-P75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%), M±SD - среднее и стандартная девиация; * - отличие от группы доноров p<0,05 (Критерий Манна-Уитни).

Используя данные об абсолютном количестве лимфоцитов в мм³ периферической крови, было определено абсолютное количество CD4⁺ и CD8⁺ клеток, по которому уже определяли содержание TREC-позитивных клеток (рис. 6). Группа пациентов с РА состояла из 22 человек со средним возрастом 50±8,9 лет, в донорскую группу вошли 8 человек со средним возрастом 50±10,9 лет.

Рис. 6. Абсолютное количество TREC-содержащих клеток в мм3 в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах при ревматоидном артрите

Примечание: для каждой переменной отображены: медиана, квартильный размах (25% и 75% перцентили), размах (минимум, максимум); * - отличие от группы доноров p<0,05 (критерий Манна-Уитни).

При РА абсолютное количество CD8⁺-клеток в мм³ составляло 254 (184-335 и достоверно не отличалось от донорского значения - 387 (289-416); при этом абсолютное количество CD4⁺ лимфоцитов было повышенным 563 (443-746) по сравнению с донорами - 349 (332-517) - (p<0,05 критерий Вальда-Вольфовица). Все значения приведены в виде медианы с указанием в скобках 25 и 75 перцентилей. Достоверные отличия между пациентами с РА и донорами были выявлены по абсолютному количеству TREC-содержащих клеток среди CD8⁺ лимфоцитов. Учитывая изменение соотношения числа наивных клеток к клеткам памяти с существенным преобладанием последних, гомеостатическую пролиферацию CD4⁺ лимфоцитов, накопление субпопуляции Т-лимфоцитов, утративших маркер CD28, и укорочение теломер на концах хромосом в лимфоцитах, полученные данные говорят о большем по сравнению с нормой вкладе пролиферации периферических лимфоцитов в поддержание пула Т-клеток.

Количество TREC при бронхиальной астме. Уровень TREC в субпопуляциях CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов был определен у 52 пациентов с бронхиальной астмой, при этом 27 пациентов имели атопическую форму БА со средним значением сывороточного IgE 539±72,2 и 25 пациентов - неатопическую форму БА со средним значением IgE 111±20,0. Поскольку достоверных отличий по содержанию TREC в Т-лимфоцитах не было обнаружено, то все пациенты были объединены в одну группу, средний возраст которой был 43±13,8 лет. Контрольная группа доноров состояла из 21 человека и имела средний возраст 43±12,0 лет. На миллион CD4-позитивных клеток у больных БА приходилось 4800 (2200-15000) молекул образующейся при реаранжировке TCR эписомальной ДНК, в CD8-позитивных клетках - 5540 (2100-12830) молекул, что примерно соответствовало донорским значениям: 5300 (1740-11200) и 7000 (927-11700) молекул TREC соответственно.

Однако уровень TREC в субпопуляциях CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов менялся в зависимости от длительности заболевания. Более высокие значения наблюдались у пациентов, для которых диагноз БА был верифицирован от нескольких дней до 1 года, тогда как у пациентов, страдающих данным заболеванием больше 1 года, уровень TREC был существенно снижен (рис. 7).

Рис. 7. Зависимость между количеством TREC в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах при бронхиальной астме и длительностью заболевания

На этом основании группа пациентов с БА была разбита на 2 подгруппы в зависимости от длительности заболевания: «менее одного года» (n=17) и «более одного года» (n=32). Достоверные различия по количеству TREC в CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитах наблюдались между подгруппами пациентов, болеющих менее и более одного года (табл. 3). Кроме того, уровень TREC в обеих Т-клеточных субпопуляциях у пациентов, болеющих БА менее одного года, был достоверно повышен по сравнению с донорскими значениями. Подгруппа больных с длительностью заболевания более одного года не отличалась по содержанию молекул TREC в CD4⁺- и CD8⁺-клетках от доноров.

Таблица 3. Относительное количество TREC в популяциях CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитов при бронхиальной астме.

ME (P25-P75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%), M±SD - среднее и стандартная девиация; * - отличие от группы доноров, # - отличие между подгруппами больных БА p<0,05 (Критерий Манна-Уитни).

При БА абсолютное количество CD8⁺ лимфоцитов в мм³ также, как и в случае РА, достоверно не отличалось от донорского значения: 391 (246-570) против 351 (212-391). Зато наблюдалось увеличение абсолютного числа CD4⁺ лимфоцитов в мм³, 555 (374-806) по сравнению с 333 (250-351) у доноров (p<0,05 критерий Манна-Уитни). Однако различий по абсолютному количеству TREC-позитивных CD4⁺ и CD8⁺-клеток между группами пациентов с БА и доноров не было выявлено. После разделения больных, страдающих БА, на подгруппы в зависимости от длительности заболевания характер распределения абсолютного количества Т-клеточных субпопуляций, содержащих TREC, напоминал таковой для относительного количества TREC. А именно: наблюдалось достоверное увеличение абсолютного количества TREC-позитивных как CD4⁺, так и CD8⁺ лимфоцитов у пациентов, длительность данного заболевания которых составляла менее 1 года, по сравнению с пациентами, страдающими БА более 1 года, и группой доноров (рис. 8).

Рис. 8. Абсолютное количество TREC-содержащих клеток в мм3 в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах у пациентов, страдающих БА менее и более одного года.

Примечание: * - отличие от группы доноров, # - отличие между подгруппами больных БА p<0,05 (Критерий Манна-Уитни).

Увеличение абсолютного числа TREC свидетельствует об усилении функциональной активности тимуса на начальных стадиях заболевания. У пациентов с давностью больше одного года, уровень TREC в CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитах возвращается в пределы нормы. Возможно, это связано с тем, что они находились на базисной терапии с применением глюкокортикостероидов, которые оказывают воздействие на различные процессы в организме и в том числе могут приводить к снижению тимопоэза.

Количество TREC при атопическом дерматите. Принято различать две формы атопического дерматита (АД) в зависимости от количества IgE в сывортке крови: аллергическую и неаллергическую. В исследование было включено 18 пациентов с аллергической формой и средним значением уровня IgE 786±62,8, а также 8 пациентов с неаллергической формой и средним значением уровня IgE 36±8,3. Однако достоверных отличий по числу Т-лимфоцитов, содержащих TREC, между этими формами выявлено не было, и пациенты с повышенным и нормальным уровнем IgE были объединены в одну группу, к которой была подобрана соответствующая группа здоровых доноров (n=22).

Таблица 4. Относительное количество TREC в CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитах при атопическом детматите.

ME (P25-P75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%), M±SD - среднее и стандартная девиация; * - отличие от группы доноров p<0,05 (Критерий Манна-Уитни).

Интересно, что при АД в CD8⁺-клетках уровень TREC был достоверно снижен по сравнению с оппозитной группой, а для CD4⁺-клеток наблюдалась лишь тенденция к снижению (p=0,08). Одной из причин уменьшения уровня TREC в Т-лимфоцитах является клеточная пролиферация, обусловленная либо гомеостатическими механизмами, либо стимуляцией антигенами.

Абсолютное количество Т-лимфоцитов в мм³ при АД было достоверно повышено в обеих субпопуляциях (p<0,05 критерий Манна-Уитни) и составило 668 (532-937) для CD4⁺-клеток и 456 (323-710) для CD8⁺-клеток, тогда как доноры демонстрировали 252 (215-351) и 249 (201-324) соответственно. Несмотря на это, достоверных отличий по абсолютному количеству Т-лимфоцитов, содержащих молекулу TREC, не было выявлено ни для CD4⁺-клеток, ни для CD8⁺-клеток (рис. 9). Возраст контрольной группы из 6 здоровых доноров составлял 26±2,1 лет, и для группы пациентов с АД - 26±1,8 лет, соответственно.

Рис. 9. Абсолютное количество TREC-содержащих клеток в мм3 в CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитах при атопическом дерматите.

Примечание: для каждой переменной отображены: медиана, квартильный размах (25% и 75% перцентили), размах (минимум, максимум).

Хроническая стимуляция Т-лимфоцитов при АД приводит к увеличению числа активированных и пролиферирующих клеток, а также к уменьшению длины теломер во всех Т-клеточных субпопуляциях. Поэтому снижение относительного количества TREC на фоне неизмененного абсолютного количества TREC-позитивных клеток указывает на больший вклад периферической экспансии в поддержание Т-клеточного пула.

Количество TREC в субпопуляциях CD31-позитивных Т-лимфоцитов в норме и при иммунопатологических заболеваниях. Молекула CD31, известная также как PECAM-1, относится к семейству иммуноглобулинов, экспрессируется не только на поверхности тимоцитов и наивных Т-лимфоцитов, но и тромбоцитов, моноцитов, гранулоцитов и эндотелиальных клеток. Показано, что она участвует в регуляции процессов адгезии, миграции и активации Т-клеток [Jackson D.E., 2003]. В последнее время некоторые исследователи рассматривают CD31 в качестве маркера недавно мигрировавших из тимуса CD4⁺-клеток. Чтобы посмотреть, насколько чувствительным является этот маркер, было определено число CD4⁺ и CD8⁺ 31-позитивных лимфоцитов и количество TREC в них в периферической крови 10 условно здоровых доноров и пациентов с иммунопатологическими заболеваниями (РА, АД и БА).

Различные авторы говорят о том, что у человека доля CD31-позитивных CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов снижается с возрастом и коррелирует с объемом тимуса, определенным с помощью неконтрастной компьютерной томографии [Junge S., 2007; Tanaskovic S., 2010]. В настоящем исследовании количество CD8⁺CD31⁺ клеток у доноров составляло примерно 60% от всей популяции CD8⁺ лимфоцитов, тогда как количество CD4⁺CD31⁺ клеток варьировало с возрастом и после 40 лет составляло около 30% популяции CD4⁺ лимфоцитов. Четкой связи между возрастом и количеством CD4⁺CD31⁺ клеток не наблюдалось. Также не было выявлено достоверных отличий по содержанию CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺ клеток в периферической крови между группами пациентов с РА, БА, АД и подобранными по возрасту к ним группами доноров.

Количество TREC в субпопуляции CD4⁺CD31⁺CD45RA⁺ клеток в 8-18 раз превышает количество этих молекул в CD4⁺CD31^-CD45RA⁺ лимфоцитах [Kimmig S., 2002; Junge S., 2007]. В данной работе было определено количество TREC среди CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺ Т-лимфоцитов у 10 доноров в возрасте от 23 до 46 лет. Корреляционный анализ выявил обратную зависимость между количеством содержащих TREC CD31-позитивных CD4⁺ и CD8⁺ клеток и возрастом (рис. 10). Подобная зависимость между количеством TREC-позитивных CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺ Т-лимфоцитов и возрастом регистрировалась у пациентов с РА, АД, БА.

Рис. 10. Зависимость между количеством TREC в CD31-позитивных клетках и возрастом.

Примечание: коэффициент корреляции: для CD4+CD31+ r=-0,71, p<0,05; для CD8+CD31+ r=-0,65, p<0,05.

Снижение количества TREC в CD31-позитивных клетках с возрастом дает основание предполагать наличие ГП наивных клеток с сохранением на поверхности маркера CD31. Кроме того, чем старше становится человек, тем более у него выражен такой тип гомеостатической пролиферации.

По уровню TREC в CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺ клетках пациенты с РА и АД также не отличались от соответствующих им по возрасту групп доноров (табл. 5). Известно, что размер пула наивных Т-клеток меньше при РА, чем у доноров [Ponchel F., 2002]. Следовательно, полученные результаты говорят лишь о том, что доля недавно мигрировавших из тимуса лимфоцитов и уровень TREC в них при РА сопоставимы с донорскими значениями, но если оценить абсолютное количество 31-позитивных CD4⁺- и CD8⁺-клеток и абсолютное количество TREC в них, то, возможно, будут получены различия. В случае АД существенных изменений в компартменте наивных Т-лимфоцитов не описано, поэтому полученные данные свидетельствуют о находящейся в пределах нормы функциональной активности тимуса.

Таблица 5. Количество TREC в CD31-позитивных CD4⁺ и CD8⁺ Т-лимфоцитах в норме и при иммунопатологических заболеваниях

ME (P25-P75) - медиана и квартили распределения признаков (25-75%), M±SD - среднее и стандартная девиация; * - отличие от группы доноров p<0,05 (Критерий Манна-Уитни).

При БА уровень TREC в субпопуляции CD4⁺CD31⁺ лимфоцитов был достоверно повышен, тогда как в субпопуляции CD8⁺CD31⁺ лимфоцитов он имел тенденцию к увеличению по сравнению с таковым у доноров (p=0,06). В cвязи с тем, что для данного заболевания данные об изменении соотношения числа наивных Т-клеток к клеткам памяти отсутствуют, и в данном исследовании показано, что относительное количество CD31-позитивных CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов сопоставимо с донорскими значениями, увеличение количества TREC происходит в основном за счет стимуляции процесса тимопоэза.

Выводы

1. Разработанный оригинальный стандарт и подобранные концентрации специфических праймеров, термостабильной Taq ДНК-полимеразы позволяют определять количество TREC в субпопуляциях Т-лимфоцитов методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

2. При стимуляции in vitro анти-CD3 антителами и IL-2 доля TREC-позитивных Т-лимфоцитов уменьшается пропорционально числу совершенных делений, что свидетельствует о переходе TREC только к одной из дочерних клеток при делении.

3. По сравнению со здоровыми донорами при ревматоидном артрите регистрируется снижение доли TREC-позитивных клеток среди CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов и абсолютного количества содержащих TREC CD8⁺ лимфоцитов, что, учитывая неизмененное общее число CD8⁺-клеток, указывает на больший по сравнению с нормой вклад пролиферации периферических лимфоцитов в поддержание Т-клеточного пула.

4. Пациенты с атопическим дерматитом характеризуются уменьшением относительного количества TREC в Т-лимфоцитах с сохранением абсолютного количества TREC-позитивных клеток на уровне донорских значений, что, учитывая повышенное абсолютное количество CD4⁺- и CD8⁺-клеток, свидетельствует о большем вкладе периферической экспансии в поддержание пула Т-лимфоцитов.

5. По сравнению с больными бронхиальной астмой с давностью заболевания более одного года и донорами пациенты с длительностью бронхиальной астмы менее одного года демонстрируют повышенное абсолютное и относительное количество TREC-позитивных клеток среди CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов, что указывает на более интенсивное пополнение периферического пула Т-лимфоцитов за счет мигрирующих из тимуса наивных клеток.

6. При бронхиальной астме регистрируется увеличение количества TREC в CD31-позитивных клетках, что свидетельствует о роли тимопоэза в поддержании Т-клеточного пула при данной патологии. Напротив, пациенты с ревматоидным артритом и атопическим дерматитом не отличаются от доноров по содержаниюу TREC-позитивных CD4⁺CD31⁺ и CD8⁺CD31⁺ лимфоцитов, что указывает на отсутствие выраженных изменений тимопоэза у больных данной категории.

7. Определение абсолютного и относительного количества TREC в субпопуляциях CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов, числа CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов в мм³ крови, а также числа CD31-позитивных клеток и уровня TREC в них позволяет дифференцировать вклад различных механизмов (тимопоэза и периферической экспансии) в поддержание периферического пула Т-клеток при иммунопатологических состояниях.