12

Размещено на http://www.allbest.ru/

12

Учреждение Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Изучение тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 И IL-6 у мыши и человека

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Яценко Ольга Петровна

Новосибирск 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Сенников Сергей Витальевич.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич;

доктор медицинских наук, профессор Глушков Андрей Николаевич.

Ведущее учреждение: ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, 197110, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, д. 7, Тел.: 8 (812) 235-12-25, тел./факс: 8 (812) 230-49-48

Защита диссертации состоится 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14)

Автореферат разослан 28 cентября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Общее количество генов, обнаруженное в геноме человека, в процессе выполнения проектов по секвенированию всего генома по разным подсчётам не превышает 30-40 тысяч, в то же время база экспрессирующихся последовательностей человека на порядок больше. Причины этого многообразия кроются в посттранскрипционных событиях. Одним из наиболее значимых посттранскрипционных событий является альтернативный сплайсинг пре-мРНК, который, благодаря комбинированию порядка и количества экзонов, позволяет продуцировать различные зрелые транскрипты от одного единственного гена без изменения его геномной организации. Белки, образующиеся вследствие трансляции альтернативно сплайсированных мРНК, могут выполнять как сходные, так и различные функции. Было продемонстрировано, что альтернативный сплайсинг вовлечен в процессинг пре-мРНК генов IL-1в, IL-1б, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, M-CSF, G-CSF, TGF-б, c-kit, LIF, SCF, FasL, онкостатина М, IL-2R, IL-4R, IL-5R IL-6R IL-9R GM-CSF эритропоэтина, некоторых хемокинов (VCAM) и т.д., приводя к образованию тканеспецифических изоформ различной локализации (мембрансвязанных, секреторных, внутриклеточных) и функции [Сенников С.В. и др., 2001].

В этом отношении представляют интерес два иммунорегуляторных медиатора IL-4 и IL-6, имеющие важное значение для регуляции многих клеточных процессов, в том числе гемопоэза и иммунопоэза на разных этапах онтогенетического развития [Chomarat P., 1997; Paul W.E., 1991; Banchereau J., 1991; D'Andrea A, 1995; Ryan D.H., 1994], и для этих медиаторов показано, что их экспрессия происходит с участием альтернативного сплайсинга [Alms W.J., 1996; Kestler D., 1995; Bihl M., 2002]. Ген IL-4 у человека экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной формы, содержащей все 4 экзона и альтернативно сплайсированной, не содержащей 2-го экзона, названной IL-42 [Alms W.J., 1996; Glare E.M., 1999; Seah G.T., 2001]. Образование изоформ мРНК IL-4 у взрослого человека имеет тканеспецифический характер: обычно мРНК IL-42 обнаруживается в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови человека в минорных количествах [Alms W.J., 1996], однако в ряде случаев в МНК периферической крови [Alms W.J., 1996; Atamas S.P., 1996], а также в клетках тимуса и бронхо-альвеолярного лаважа [Atamas S.P., 1996], клеточных линиях B95/8 и HL60 [Klein S.C., 1996] обнаруживается преобладание мРНК IL-42 над полноразмерной формой. Рекомбинантный человеческий белок IL-4д2 (rhIL-42) способен связываться с рецептором IL-4 и ингибировать действие rhIL-4 на иммунокомпетентные клетки [Arinobu Y., 1999; Atamas S.P., 1996]. Для гена IL-6 показано существование у человека пяти сплайс-вариантов мРНК IL-6: hIL-6 мРНК, hIL-6alt мРНК, hIL-6?2 мРНК, hIL-6?2,4 мРНК и hIL-6?4 мРНК [Bihl M.,2002; Kestler D.,1995]. Данных об их экспрессии мало, а сведения по биологической активности противоречивы. Остаётся невыясненным имеет ли сплайсинг мРНК генов IL-4 и IL-6 особенности в различных тканях на разных этапах онтогенеза и как их экспрессия может меняться под действием других регуляторных молекул. Систематизированные данные по тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов мРНК могут прояснить физиологическую роль альтернативных вариантов этих цитокинов.

При отсутствии антител способных специфически связывать изоформы или метода анализа мРНК in situ для оценки уровней экспрессии широко применяется метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Учитывая трудности получения образцов тканей от человека, представляется возможным в ряде экспериментов исследовать особенности экспрессии генов на животных. Оптимальной моделью для исследований в иммунологии является мышь, которая имеет значительное сходство с человеком в геномной организации иммунной системы. Использование мышиной модели допустимо для изучения спектра сплайс-вариантов мРНК, так как имеющиеся в литературе данные о механизмах сплайсинга, говорят о том, что он происходит однотипно у человека и мыши в случае некоторых мРНК интерлейкинов [Thanaraj T.A., 2003; Sorek R., 2003]. Изучение тканеспецифического распределения различных сплайс-вариантов мРНК цитокинов в онтогенезе может во многом поменять наши взгляды на регуляцию иммунных и дифференцировочных процессов.

В связи с вышеизложенным актуальным представляется изучение роли альтернативного сплайсинга в экспрессии генов IL-4 и IL-6 как ключевых цитокинов в регуляции иммунных процессов.

Цель работы: поиск новых сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 и изучение особенностей их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза у мыши и человека.

Задачи исследования:

Изучить экспрессию в клетках мышей сплайс-вариантов мРНК IL-4 и влияние митогенной стимуляции на уровень их транскрипции.

Исследовать тканеспецифичность в экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 на разных этапах онтогенеза мышей.

Выявить в клетках мышей сплайс-варианты мРНК IL-6 и изучить особенности их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза.

Изучить спектр сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 в фетальных тканях человека и оценить уровень их экспрессии в тимусе, печени и селезёнке.

Исследовать влияние цитокинов in vitro на спектр экспрессируемых мРНК IL -4 в МНК периферической крови здоровых людей.

Изучить спектр сплайс-вариантов мРНК IL -6 в различных тканях человека.

Научная новизна работы.

Впервые продемонстрировано наличие специфических мРНК IL-4д2, IL-6д3 и IL-6д5 в клетках мыши и выполнено систематизированное исследование экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 в различных тканях мыши. Установлено, что кинетика экспрессии сплайс-вариантов IL-4 при митогенной стимуляции аналогична в клетках мыши и человека. Впервые продемонстрирована экспрессия мРНК IL-4аlt3 и мРНК IL-6д2д4 в мононуклерных клетках человека. Доказан тканеспецифический характер экспрессии мРНК IL-4 и IL-6 в фетальных тканях человека.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

В работе продемонстрировано, что экспрессия генов IL-4 и IL-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга. При этом у мышей альтерантивно сплайсированные варианты мРНК этих генов экспрессируются как минорные варианты, а у человека наблюдается тканеспецифическая экспрессия сплайс-вариантов, которая имеет качественные и количественные различия. Полученные результаты расширяют представления об экспрессии генов цитокинов клетками различных органов и тканей, позволяют глубже понять взаимосвязи внутри цитокиновой сети и их взаиморегуляцию. В частности в период фетального развития человека экспрессия альтернативных сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 может быть доминантной, что отражает особенности тканеспецифической регуляции гистогенеза. Представленные в работе факты экспрессии генов цитокинов в виде нескольких форм существенно дополняют представления о структуре и функционировании цитокиновой сети. Эти данные позволяют иначе взглянуть на организацию цитокин-опосредованных взаимодействий, поскольку механизм альтернативного сплайсинга также активно используется генами рецепторов IL-4 и IL-6. Из полученных данных можно сделать предположение о возможности непосредственного участия изоформ цитокинов в иммунорегуляции. Выяснение спектра экспрессии генов цитокинов в различных тканях также может быть полезным для определения роли изоформ в норме и патологии.

Положения, выносимые на защиту.

1.Экспрессия генов IL-4 и IL-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга, причем характер экспрессирующих последовательностей имеет как качественные, так и количественные различия.

2. Экспрессия мРНК IL-4 и IL-6 в клетках человека имеет тканеспецифический характер.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Новосибирск, 2002г.), 2) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 3) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010г.), 6) Семинаре экспериментального отдела НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2011г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Личный вклад автора

Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии НИИКИ СО РАМН и группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 147 источников, из них 137 зарубежных, 10 - отечественных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Материалом для исследований данной работы стали образцы тканей мышей (СBAC57BL/6J)F1, (DBA/2JC57BL/6J)F1 и человека (кровь условно-здоровых доноров, фетальные ткани).

Животные. В работе использовались интактные животные, полученные из НИЛ ЭБМ Томского Научного Центра СО РАМН и лаборатории экспериментальных животных (моделей) ГУ НИИ КИ СО РАМН, а также особи иммунизированные эритроцитами барана и самки в I, II и III триместрах беременности. Иммунизацию эритроцитами барана проводили внутрибрюшинно в дозе 4х10⁹, 2х10⁸ или 4х10⁵ в 0.5мл RPMI-1640, селезёнку забирали через 24 часа. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, эмбрионов - ингаляцией эфира. Выделенные от мышей селезенки и костный мозг гомогенизировали шприцем, ресуспендировали в среде RPMI-1640, подсчитывали количество клеток и оценивали их жизнеспособность. митогенный интерлейкин тимус

МНК выделяли на градиенте фиколла-урографина плотностью 1,082. Выделенные клетки использовали для культивирования или помещали в лизирующий раствор (1х10⁶ кл.) и хранили при -20⁰С до использования.

Для изучения тканеспецифической экспрессии на холоду были взяты следующие ткани мыши: печень, тимус, ткань легкого, лимфатические узлы, плейеровы бляшки, стенка кишечника, ткань мышцы, плацента и эмбриональные ткани: печень эмбриона на 11 и 15 сутки и мозг эмбриона после 14 суток гестации. Выделенную от каждой мыши ткань замораживали в жидком азоте и хранили при -70⁰С до использования.

Культивирование спленоцитов и МНК костного мозга мыши in vitro. Клетки в количестве 5х10⁶ культивировали в чашках Петри в среде RPMI-1640, дополненной 2 мМ L-глутамином, 5%-ной инактивированной фетальной телячьей сывороткой, 50 мкМ в-2-меркаптоэтанолом и гентамицином (80 мкг/мл), в течение 48 ч в СО₂-инкубаторе при 37^оС. Растворы митогенов добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: Конканавалин А (КонА) из расчета 10 мкг/ 1 млн. клеток, ЛПС E.сoli 055:B5 - 30 мкг/ 1 млн. клеток.

Ткани человека. Образцы фетальных тканей человека были получены из абортивного материала при прерывании беременности по социальным показаниям в сроке 20-24 недели. Фетальные ткани исследовали на отсутствие основных инфекций (герпес 2 типа, гепатиты В и С, цитомегаловирус, ВИЧ, реакция на Hbs-Ag и RW). Исследования с фетальными тканями одобрены Локальным этическим комитетом и проводились при наличии информированного согласия женщин. У всех доноров периферической крови было получено информированное согласие на процедуру забора биологического материала и разъяснены цели исследования.

Выделение и культивирование МНК периферической крови проводили стандартными методами [Boyum A., 1968; Силков А.Н., 2007]. Растворы цитокинов и КонА добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: КонА из расчета 10 мкг/ 1 млн. клеток, rhIL-2 - 10 нг/мл, rhIL-4 - 5 нг/мл, rhIL-IL-4д2 - 100 нг/мл, rhIFNг - 3 нг/мл, rhIL-18 - 40 нг/мл, rhIL-10 15 нг/мл, эритропоэтин - 5U/мл. В качестве контроля использовали культуры МНК без цитокинов с КонА и без него. Жизнеспособность клеток не изменялась в процессе культивирования и составляла не менее 98% по окраске трипановым синим.

Выделение суммарной клеточной РНК и получение кДНК. Суммарную РНК выделяли по методу Chomozynski P. и Sacchi N. [Chomozynski P., 1987]. Качество суммарной РНК оценивали электрофорезом в 1,5% агарозном геле, количество определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 нм. РНК хранили при -70^oC до момента использования. кДНК получали из 1 мкг суммарной РНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) с использованием 5 мкМ d(рT)₁₈ праймера и 100 ед. акт. MoMLV РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ИХБФМ СО РАН) в 20 мкл буфера, содержащего 20 мM Tris-HCl, pH 8,3, 2мM MnCl₂, 5 мM дитиотреитол, 100 мM KCl, 400 мкM dNTP.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили в объеме 20 мкл реакционной смеси с 1 ед.акт. Taq- полимеразы (ИХБФМ СО РАН). Амплификационная смесь содержала 2 мкл (~50 нг) кДНК в качестве матрицы, 200 мкM раствор dNTP, в стандартном буфере, содержащем 67 мМ трис-HCI (рН 8.9), 16 мМ сульфат аммония, 1,5 мМ МgС1₂, 0,05% Tween-20, 20 пкМ каждого праймера для амплификации. Условия ПЦР: денатурация 95C - 3 мин; затем 40 циклов по 7сек при 95C, 7 сек при 62C и 12 сек при72C. Заключительный цикл элонгации - 3 мин при 72C. Для усиления чувствительности и специфичности выполнялась «вложенная» ПЦР с продуктом первого раунда ПЦР в качестве матрицы.

Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры были синтезированы в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и имели последовательности, представленные в таблице 1. Дизайн праймеров был проведен с помощью программы «PrimerPremier» на основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в базе данных GeneBANK.

Конкурентную ПЦР выполняли как описано ранее [Auboeuf D., 1997]. Конкурентные стандартные ДНК для определения количества кДНК IL-4 и IL-42 были получены амплификацией геномной ДНК фага Т7 с праймерами, специфичными для исследуемых кДНК, с использованием низкой температуры отжига на первых циклах.

Продукты реакции амплификации (10 мкл) подвергали разделению электрофорезом в 6% полиакриламидном геле или в 1,5%-м агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5мг/мл) и визуализировали ДНК под УФ-светом. Изображение фиксировали с помощью CD-камеры Watec AD-901 (Watec Co., LTD, Япония). Количество ДНК высчитывали по плотности полос с помощью программы ScionImage [http://www.scioncorp.com]. Строили график линейной регрессии, откладывая по оси ординат логарифм отношений количества конкурентной ДНК к исследуемой кДНК, а по оси абсцисс логарифм начальных концентраций конкурентной ДНК, в которых она добавлялась в ПЦР. Определяли точку эквивалентности, в которой логарифм отношений количества конкурентной ДНК к кДНК был равен 0, и изначальное количество исследуемой кДНК соответствовало начальному количеству конкурентной ДНК. По результатам трех повторных измерений для каждой кДНК высчитывали среднее значение, а также стандартную ошибку среднего.

Исследование уровня экспрессии мРНК ИЛ-4 и ИЛ-4д2 в ткани тимуса, печени и селезёнки 24-недельных фетусов проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (РТ-ПЦР) на приборе ICyclerIQ (Bio-Rad Laboratories, США) с применением интеркалирующего флуоресцентного агента SYBR Green I. Амплификацию всей серии образцов проводили одновременно, по две точки на каждый образец кДНК, анализ проводили два раза. Нормировку количества кДНК, взятой в анализ проводили, измеряя количество кДНК рибосомного белка S26 человека.

Секвенирование. Продукты амплификации элюировали из геля как описано ранее [Маниатис Т., 1984]. Секвенирование проводили по методу Сэнгера с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Amersham) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводили на автоматическом ДНК секвенаторе ABI310. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ VectorNTI (Informatics).

Таблица 1 Последовательности дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров

мРНК	обозначение	последовательность	длина фрагментов (п.о.)
mIL-4	Out-UIL4	5-gcatctcttgataacttaattgtc-3	IL-4 - 498
	Out-RIL4	5-gttaaagcatggtggctcag-3
mIL-4	IL-4m-n	5-tggatgtgccaaacgtcc-3	264
	IL-4m-r	5-gctctttaggctttccaggaag-3
mIL-4д2	IL-4m-d	5-caggagaagggaacaccac-3	254
	IL-4m-r	5-gctctttaggctttccaggaag-3
mIL-6	U1	5-cgctatgaagttcctctctgc-3	IL-6 - 640, IL-6?3 - 582, IL-6?5 - 526
	R3	5-ctaggtttgccgagtagatctc-3
hIL-6	6hum1	5'- cgaaagagaagctctatctccc -3'	IL-6 - 711 IL-6д2 - 520 IL-6д2,4 - 373
	6hum2	5'- tgcccattaacaacaacaatc -3'
hIL-4	MFIL-4up	5'-gaagatgcatatgcacaagtgcgatatcacctacc-3'	390
	MFIL-4 rew	5'- gaaggatcctcagctcgaacactttgaatatttc -3'
	HIL-4e2	5'- cgagttgaccgtaacagacat -3'	IL-4 - 239 IL-4д2 - 213
	HIL-4e1/3	5'- cagagcagaagaacacaaatg -3'
	HIL-4R	5'- tggcttccttcacaggacagg -3'
hIL-4	AIL-4U	5'-caaaactttgaacagcctcacag-3'	IL-4 - 288 IL-4д2 - 240 IL-4alt3 - 215
	AIL-4R	5'- ctctggttggcttccttcacag-3'
RPS26	m350	5'- gctgcggcctccactatg -3'	136
	m223	5'- agagaaggaacaatggtcgtgc -3'

Гидролиз эндонуклеазами рестрикции. Гидролиз ДНК проводили в 1х буфере, соответствующем выбранной эндонуклеазе рестрикции, согласно рекомендаций производителя ферментов. Результат оценивали после электрофоретического разделения продуктов рестрикции в 6% ПААГ.

Результаты и обсуждение

Первой задачей данного исследования был поиск в клетках мыши мРНК IL-4д2 - аналогичной варианту, обнаруженному у человека и других видов животных. Система олигонуклеотидных праймеров была разработана таким образом, что позволяла селективно детектировать полноразмерный вариант мРНК IL-4 и альтернативно сплайсированный IL-42. Для поиска мРНК IL-42 мыши были использованы суммарные кДНК из спленоцитов и МНК костного мозга, культивированных in vitro с КонА, ЛПС и без митогенов. Фрагменты соответствующие мРНК IL-42 мыши (нуклеотидная структура определена прямым секвенированием по методу Сэнгера) присутствовали в образцах клеток селезенки и костного мозга, стимулированных КонА и не были выявлены ни в одном из образцов кДНК из культур клеток без митогенов или при стимуляции ЛПС. Присутствие минорных количеств мРНК IL-42 в интактных клетках костного мозга и селезенки обнаруживалось только при проведении «вложенной» двухстадийной ПЦР, которая характеризуется более высокой чувствительностью.

Рис. 1.Кинетика экспрессии мРНК IL-4 и мРНК IL-4д2 в культурах спленоцитов мыши.

При изучении кинетики экспрессии мРНК IL-4 и мРНК IL-4д2 в культурах спленоцитов мыши, показано, что при стимуляции КонА в них происходила индукция экспрессии как мРНК IL-4, так и мРНК IL-4д2. Максимальный уровень мРНК IL-4д2 наблюдался через 3 часа после добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии. Незначительный уровень мРНК IL-4д2 продолжал определяться в клетках вплоть до 48 часов культивирования. Пик индукции мРНК IL-4 наблюдался через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижался (рис.1).

С помощью конкурентной количественной ПЦР показано, что на пике индукции (6 часов) уровень мРНК полноразмерной формы был в 14 раз выше, чем уровень мРНК IL-4д2. Эти результаты согласуются с опубликованными в литературе работами, где также наблюдали повышение уровня экспрессии обеих изоформ интерлейкина-4 (полноразмерного варианта - в большей степени) и через несколько часов возвращение к базовому уровню.

Следующим этапом работы стало изучение тканеспецифического распределения сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 у мышей. Были исследованы ткани мыши: печень, тимус, легкое, лимфатические узлы, плейеровы бляшки, стенка кишечника, мышца, плацента и эмбриональные ткани: печень эмбриона на 11 и 15 сутки и мозг эмбриона после 14 суток гестации. Матричная РНК полноразмерного варианта IL-4 детектировалась в большинстве образцов (печени, лимфатических узлов, плейеровых бляшек, стенки кишечника, мышцы, плаценты и фетальной печени) при одностадийной ОТ-ПЦР. Матричная РНК IL-4д2 не определялась в нативных тканях методом одностадийной ПЦР и была обнаружена только более чувствительным методом «вложенной» двухстадиной ПЦР. На этом основании было заключено, что сплайс-вариант мРНК IL-4д2 у мыши в обследованных образцах тканей является минорной формой, по отношению к доминантной полноразмерной форме мРНК IL-4.

Для изучения особенностей экспрессии гена IL-6 мыши использовали те же образцы кДНК, что и в экспериментах по изучению экспрессии гена IL-4. Для увеличения специфичности и чувствительности метода использовали двухстадийную («вложенную») ПЦР.

Рис. 2. Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР мРНК гена IL-6 в клетках мыши.

Примечание: A - кДНК из клеток селезенки, мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4х10⁹; B - кДНК из клеток печени интактной мыши; С - кДНК из клеток плаценты мыши во II триместре беременности; D - кДНК из клеток плаценты мыши в III триместре беременности. Стрелками отмечены фрагменты: 1 - 640 п.о. (mIL-6), 2 - 582 п.о. (mIL-6?5), 3 - 526 п.о. (mIL-6?3).

Из представленной на рис. 2 электрофореграммы видно, что помимо основного фрагмента ДНК размером 640 п.о., соответствующего полноразмерной форме мРНК mIL-6, в образцах присутствуют дополнительные фрагменты меньшей величины, соответствующие альтернативным сплайс-вариантам мРНК интерлейкина-6. Секвенирование полученных нуклеотидных последовательностей показало, что фрагмент 2 содержит делецию участка экзона 5 размером 58 п.о., а фрагмент 3 - делецию экзона 3, размером 114 п.о. Соответствующие сплайс-варианты были обозначены как mIL-6?5 и mIL-6?3. Матричную РНК mIL-6?3 и мРНК mIL-6?5 детектировали в селезенке мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4х10⁹ и в плаценте во II и III триместрах. Кроме того, мРНК mIL-6?5 обнаружена в печени интактной мыши.

Описанная выше серия экспериментов продемонстрировала, что cплайсинг матричных РНК IL-4 и IL-6 у человека и мыши происходит видоспецифично. Поэтому дальнейшие исследования особенностей экспрессии сплайс-вариантов матричных РНК IL-4 и IL-6 выполнялись на тканях человека, в том числе фетальных.

Для исследования спектра сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 в фетальных тканях человека использовали подход, позволяющий амплифицировать последовательности всех возможных сплайс-вариантов. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Присутствие специфических последовательностей сплайс- вариантов мРНК гена IL-4 в фетальных тканях человека.

Ткань	мРНК
	IL-4	IL-4д2
Поджелудочная железа	+	+
Мозг	+/-	+
Кожа	-	-
Почка	-	+/-
Легкое	+/-	-
Печень	+	+
Селезенка	+	+
Тимус	+	+
Щитовидная железа	+	+
Надпочечник	-	-
Скелетная мышца	-	+/-
Миокард	+/-	-
Яичник	+/-	+/-
Яичко	-	-
Костная ткань	-	+/-

Примечание: Приведены результаты исследования 2-4 образцов каждой ткани. «+» - ПЦР-продукт присутствовал во всех образцах, «-» - отсутствие специфического ПЦР-продукта, «+\-» - ПЦР-продукт присутствовал не во всех исследованных образцах.

В фетальных тканях, имеющих непосредственное отношение к гемопоэзу и иммунопоэзу (тимус, печень, селезёнка) была предпринята попытка количественно охарактеризовать уровень матричных РНК IL-4 и IL-4д2. Измерения проводили методом ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в «реальном времени». Результаты представлены на рис. 3. Показано, что экспрессия полноразмерного варианта в тимусе в среднем на 1-2 порядка выше, чем в печени и селезёнке. Это согласуется с данными Klein S.C. с совт. и Atamas S.P., которые наблюдали слабую экспрессию мРНК IL-4 в клетках тимуса [Klein S.C. et all., 1996; Atamas S.P., 1996].

Рис. 3. Относительные количества мРНК IL-4 и IL-4д2 в фетальных тканях человека.

Примечание: Данные приведены в относительных единицах как среднее + стандартное отклонение для четырех образцов печени, селезенки и тимуса.

Количественный анализ мРНК IL-4д2 показал, что в печени его в среднем в 2-5 раз больше, чем в селезёнке или тимусе. В то же время в тимусе у эмбрионов мРНК IL-4д2 даже чуть больше, чем в селезёнке (рис.3).

Также было исследовано влияние некоторых цитокинов в культуре in vitro МНК периферической крови здоровых людей на спектр экспрессируемых ими мРНК IL-4, поскольку известно, что продукция цитокинов и их изоформ в культуре клеток может меняться под воздействием цитокинов и ростовых факторов [Chomarat P., 1997; D'Andrea A., 1995; Hart P.H., 1989; Силков А.Н., 2005; Douay L., 1994]. В культуре клеток использовалась панель рекомбинантных цитокинов человека, включающая IL-2, IL-4, IL-4д2, IL-10, IL-18, IFNг и эритропоэтин. Выделенные от условно здоровых доноров МНК периферической крови культивировались в течение 6 часов в присутствии и в отсутствии цитокинов и КонА. Констатировано присутствие в культурах клеток мРНК IL-4 и мРНК IL-4д2. В МНК некоторых доноров, культивированных в присутствии rhIL-18 был обнаружен дополнительный фрагмент ДНК меньшего размера, соответствующий мРНК IL-4alt3, что было определено методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) - анализа и прямого секвенирования.

В экспериментах по изучению спектра экспрессируемых мРНК IL-6 у мыши были обнаружены два новых сплайс-варианта: IL-6?3 и IL-6?5. Поскольку в литературе приводятся противоречивые сведения о спектре сплайс-вариантов IL-6 у человека, была сконструирована система праймеров, позволяющая выявить все возможные сплайс-варианты мРНК интерлейкина-6 у человека.

На рисунке 4 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР, где в качестве матрицы использовали кДНК из МНК периферической крови свежевыделенных от условно здоровых доноров, а также МНК периферической крови, культивированных в течение 48 часов спонтанно, в присутствии КонА или в присутствии rhIL-18. Все образцы содержат фрагмент ожидаемой длины (711 п.о.), соответствующий мРНК IL-6. Кроме того, во всех дорожках присутствует фрагмент меньшей длины (520 п.о.).



Рис. 4. Электрофореграмма в 6% ПААГ продуктов ПЦР с праймерами 6hum1/6hum2 на матрицах кДНК из нативных и культивированных МНК периферической крови.

Примечание: 1-4 - донор 1, 5-8 - донор 2. М - маркёр молекулярного веса pGK3/HaeIII (видны полосы 734, 525, 503, 404). 1 и 5 - нативные МНК, 2 и 6 - МНК после культивации, 3 и 7 - МНК культивированные с добавлением КонА (10 мкг/мл), 4 и 8 - МНК культивированные с добавлением IL-18 (40 нг/мл).

Методом ПДРФ - анализа было установлено, что он соответствует мРНК IL-6д2, в которой отсутствует второй экзон. В образцах из свежевыделенных МНК периферической крови присутствует дополнительный фрагмент (373 п.о.), соответствующий мРНК IL-6д2д4, что также было определено методом ПДРФ.

В процессе культивирования МНК периферической крови человека происходит изменение спектра экспрессируемых сплайс-вариантов матричных РНК IL -6: изоформа мРНК IL-6д2д4 (373 п.о.) исчезает. Таким образом, в МНК периферической крови человека присутствуют мРНК IL-6, мРНК IL-6д2 и мРНК IL-6д2д4. Присутствие мРНК IL-6д2д4 в МНК периферической крови человека показано впервые.

Далее были исследованы фетальные ткани человека на предмет присутствия в них сплайс-вариантов мРНК IL -6. В тканях фетусов был обнаружен тот же спектр матричных РНК интерлейкина-6, что и в предварительных эксперимнтах с митоген-стимулированными МНК периферической крови человека (табл. 3). При этом в ткани поджелудочной железы и мозга обнаруживался только полноразмерный вариант, мРНК IL-6; в яичнике, печени и коже - только альтернативные варианты: мРНК IL-6д2 и мРНК IL-6д2,4. В тканях щитовидной железы, надпочечника, легких, селезенки, тимуса, миокарда, яичка и почки выявлялись мРНК IL-6 и мРНК IL-6д2, причём интенсивность сигнала была приблизительно одинаковая для обоих сплайс-вариантов.

Таблица 3 Присутствие специфических последовательностей мРНК в фетальных тканях человека

Ткань\мРНК	IL-6	IL-6д2	IL-6д2,4
Поджелудочная железа	+	-	-
Мозг	+	-	-
Печень	-	+	+
Яичник	-	+	+
Кожа	-	+	+
Почка	+	+	-
Легкое	+	+	-
Селезенка	+	+	-
Тимус	+	+	-
Щитовидная железа	+	+	-
Надпочечник	+	+	-
Скелетная мышца	+/-	+/-	-
Миокард	+	+	-
Яичко	+	+	-

Примечание: Приведены результаты исследования 2-4 образцов каждой ткани. «+» - ПЦР-продукт присутствовал во всех образцах, «-» - отсутствие специфического ПЦР-продукта, «+\-» - ПЦР-продукт присутствовал не во всех исследованных образцах.

Выводы

1. Показано, что в спленоцитах и мононуклеарных клетках костного мозга мышей ген интерлейкина-4 экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной и альтернативно сплайсированной по 2 экзону.

2. Продемонстрировано, что в культуре спленоцитов, стимулированных Конканавалином А происходит индукция как мРНК mIL-4, так и мРНК mIL-4д2, причем максимальный уровень мРНК IL-4д2 наблюдается через 3 часа после добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии, а пик индукции мРНК mIL-4 наблюдается через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижается. Соотношение мРНК mIL-4 / мРНК mIL-4д2 на пике индукции мРНК mIL-4 составляет 14:1.

3. Установлено, что ген IL-6 экспрессируется в клетках мышей в виде трех форм матричных РНК: мРНК mIL-6, соответствующей полноразмерному белку интерлейкина-6, и двух альтернативных сплайс-вариантов, которые не обнаруживаются у человека, мРНК mIL-6Д3 - с делецией экзона 3 и мРНК mIL-6Д5 - с делецией участка экзона 5.

4. Во всех исследованных образцах тканей мыши, как во взрослом состоянии, так и в фетальных тканях экспрессия альтернативно сплайсированных мРНК интерлейкина-4 и интерлейкина-6 носит минорный характер.

5. Продемонстрировано, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-4 происходит с участием альтернативного сплайсинга и имеет качественные и количественные отличия в экспрессии мРНК IL-4 и мРНК IL-4д2, что отражает наличие тканеспецифичной регуляции альтернативного сплайсинга этого гена.

6. Обнаружен ранее не описанный у человека вариант мРНК интерлейкина-4 со сплайсированным участком третьего экзона IL-4alt3 в мононуклеарных клетках, культивированных в присутствии rhIL-18.

7. Показано, что в мононуклеарных клетках человека экспрессируются мРНК IL-6, мРНК IL-6д2 и мРНК IL-6д2д4, ранее описанная только в клетках ткани легкого и фибробластах, причем после 6 часового культивирования мононуклеаров мРНК IL-6д2д4 не определяется.

8. Установлено, что в фетальных тканях человека экспрессия гена интерлейкина-6 происходит с участием альтернативного сплайсинга с образованием мРНК IL-6, мРНК IL-6д2 и мРНК IL-6д2д4 и имеет качественные и количественные отличия в разных тканях, что может говорить о тканеспецифической регуляции альтернативного сплайсинга этого гена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Сенников С.В., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 мыши. // Цитокины и Воспаление, (Материалы международной научно-практической школы-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет»), 2002, T.1, №2, c.21.

Yatsenko O.P., Filipenko M.L., Chrapov E.A., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing of mouse IL-4 mRNA. // Journal of Interferon and Cytokine Research, (Cytokines and Interferons 2002. Turin, Italy, 6-10 October 2002), 2002, V22, supplement 1, S-127-128, Abstracts. Р-5-48.

Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Сенников С.В., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 мыши. // Иммунология, иммуногенетика, иммунопатология. Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН под ред. В.И.Коненкова, Новосибирск, 2003, с. 258-261.

Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 мыши. // Медицинская иммунология (Материалы 7 Всероссийского научного Форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 23-26 июня 2003), 2003, Т.5, №3-4, с.430.

Yatsenko O.P., Filipenko V.L., Chrapov E.A., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing of mouse IL-4 mRNA. // Proceedings of the annual meeting 2003 of the ISICR. Cytokines, signaling and diseases. S. 335

Yatsenko O.P., Filipenko M.L., Khrapov E.A., Voronina E.N., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Alternative splicing IL-4 mRNA and IL-6 mRNA in mice. // Clinical and Investigative Medicine, (Abstract 12 International Congress of Immunology and 4 Annual Conference of FOCIS), 2004, V.27 №4, р.70B.

Яценко О.П., Филиппенко М.Л., Воронина Е.Н., Храпов Е.А., Сенников С.В., Козлов В.А.. Альтернативный сплайсинг мРНК интерлейкина-4 мыши. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004 Т.137, №2, с.202-205.

Яценко О.П., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В.,. Козлов В.А. Альтернативный сплайсинг мРНК интерлейкина-6 у мыши. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2004, Т.137, № 7, с.87-90.

Яценко О.П., Силков А.Н., Филиппенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Козлов В.А., Сенников С.В. Альтернативный сплайсинг мРНК ИЛ-4 и ИЛ-6 в клетках разных фетальных тканей мыши и человека. // Медицинская иммунология, (Материалы VIII Всероссийского научного форума с международным участием имени В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге), 2004, Т. 6, №3-5, с. 264.

Yatsenko O.P., Filipenko M.L., Khrapov E.A., Voronina E.N., Kozlov V.A., Sennikov S.V. Alternative splicing of mRNA of mouse interleukin-4 and interleukin-6. // Cytokine, 2004, V. 28, №4-5 р. 190-196.

Яценко О.П., Филипенко М.Л., Самарин Д.М., Селедцов В.И., Сенников С.В., Козлов В.А. Особенности экспрессии изоформ мРНК интерлейкина-4 и интерлейкина-6 в эмбриональных тканях человека. // Цитокины и воспаление, (Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет»), 2005, Т.4, №2, с.82.

Яценко О.П., Силков А.Н., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Селедцова Г.В., Козлов В.А., Сенников С.В.Экспрессия слайс-вариантов мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 в различных тканях человека. // Цитокины и воспаление, (Материалы Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» Новосибирск 15-17 сентября 2010г.), 2010, Т.9, №3, с. 58-59.

Яценко О.П., Силков А.Н., Храпов Е.А., Филиппенко М.Л., Сенников С.В. Тканеспецифичность сплайсинга мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 человека. // «Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике». Под ред. В.А.Козлова и С.В.Сенникова, Новосибирск, 2011, с.57-59.

Яценко О.П., Силков А.Н., Храпов Е.А., Филиппенко М.Л., Козлов В.А., Сенников С.В. Тканеспецифическая экспрессия сплайс-вариантов мРНК генов ИЛ-4 и ИЛ-6 человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2011, Т. 152, № 9, с. 298-302.

Размещено на Allbest.ru

...