Рекомбінантні організми як перспективні продуценти фактора некрозу пухлин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 615.277.3+577.112.7+615.331:615.339

Національний університет харчових технологій

Рекомбінантні організми як перспективні продуценти фактора некрозу пухлин

Анотація

пухлина некроз рекомбінантний дріжджі

У статті розглянуто особливості біосинтезу фактора некрозу пухлин (ФНП) генетично модифікованими клітинами прокаріот. Використання рекомбінантних клітин Escherichia coli характеризується такими перевагами: високий вихід ФНП (від 70 до 1600 мг/л), відсутність контамінації цільового продукту інфекційними агентами та відносна економічна рентабельність. Охарактеризовано переваги та недоліки використання еукаріотичних систем експресії рекомбінантного ФНП. Наведено приклади рекомбінантних дріжджів (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) і дані щодо можливості використання рослин як продуцентів рекомбінантних цитокінів. Визначено особливості векторної конструкції, що містить гени синтезу вказаного цитокіну. Серед переваг їх використання -- відсутність жорсткого контролю і суворого дотримання специфічних умов, як при культивуванні бактеріальних продуцентів та інших клітин, оскільки цільовий продукт синтезується і накопичується при рості цілої рослини, яку можна вирощувати в польових або тепличних умовах.

Ключові слова: фактор некрозу пухлин, рекомбінантні продуценти, біосинтез.

Abstract

Recombinant organisms as prospective producers of tumor necrosis factor

O. Skrotska, E. Kharchenko

National University of Food Technologies

The features of biosynthesis of tumor necrosis factor (TNF) by genetically modified cells of prokaryotes are considered in the article. Using of recombinant Escherichia coli cell has the following advantages: the high yield of TNF (from 70 to 1600 mg/L), inability of contamination of the desired product by the infectious agents and the relative economic profitability. The article also describes the advantages and disadvantages of eukaryotic expression systems of recombinant TNF. The examples of recombinant yeast (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) are presented and the features of vector constructions containing the genes of synthesis of cytokine are characterized. The data concerning the possibility of using plants as the producers of recombinant cytokines is considered. Among the advantages of their use is the absence of tight control and strict adherence to specific conditions compared with the cultivation of bacterial producers and other cells as the desired product is synthesized and accumulated during the growth of a plant which can be grown in the field or in the greenhouse environment.

Key words: Tumor necrosis factor Recombinant producers Biosynthesis

Article history: Received 07.11.2016 Received in revised form 20.11.2016 Accepted 08.12.2016 Corresponding author: O. Skrotska E-mail:

npnuht@ukr.net

Аннотация

Рекомбинантные организмы как перспективные продуценты фактора некроза опухоли

О.И. Скроцкая, Е.В. Харченко

Национальный университет пищевых технологий

В статье рассмотрены особенности биосинтеза фактора некроза опухоли (ФНО) генетически модифицированными клетками прокариот. Использование рекомбинантных клеток Escherichia coli характеризуется следующими преимуществами: высокий выход ФНО (от 70 до 1600 мг/л), отсутствие контаминации целевого продукта инфекционными агентами и относительная экономическая рентабельность. Охарактеризованы преимущества и недостатки использования эукариотических систем экспрессии рекомбинантного ФНО. Приведены примеры рекомбинантных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) и данные о возможности использования растений в качестве продуцентов рекомбинантных цитокинов. Определены особенности векторной конструкции, содержащей гены синтеза указанного цитокина. Среди преимуществ их использования -- отсутствие жесткого контроля и строгого соблюдения специфических условий, как при культивировании бактериальных продуцентов и других клеток, поскольку целевой продукт синтезируется и накапливается при росте целого растения, которое можно выращивать в полевых или тепличных условиях.

Ключевые слова: фактор некроза опухоли, рекомбинантные продуценты, биосинтез.

Постановка проблеми. Фактор некрозу пухлин (ФНП) -- багатофункціональний прозапальний цитокін, який синтезується в основному моноцитами та макрофагами і є важливим низькомолекулярним медіатором міжклітинних взаємодій. ФНП впливає на ліпідний метаболізм, коагуляцію, стійкість до інсуліну, функціонування ендотелію, стимулює продукцію інтерлейкінів (ІЛ-1, ІЛ-6, ІЛ-8), інтерферону-гамма, активує лейкоцити, а також є одним із важливих чинників захисту від внутрішньоклітинних паразитів і вірусів. ФНП чинить цитотоксичну дію на ракові клітини шляхом активації процесу апоптозу, кисневої дії і впливу окису азоту. Біологічні ефекти ФНП залежать від його концентрації. У низьких концентраціях ФНП діє в місці індукції як параі автокринний регулятор автоімунних реакцій у відповідь на травму або інфекцію. У середніх концентраціях -- стимулює утворення фагоцитів, підсилює згортання крові, чинить пірогенний ефект, знижує апетит, а також є важливим фактором розвитку кахексії при таких захворюваннях, як туберкульоз і рак [1].

За даними ВООЗ до 2020 р. онкопатологія вийде на перше місце серед захворювань. Нині ж рак є причиною понад 15% всіх смертей, тому актуальним є отримання недорогих і доступних протипухлинних препаратів, зокрема ФНП за допомогою рекомбінантних організмів. Перше покоління очищених препаратів ФНП отримували завдяки культивуванню імунокомпетентних клітин тварин або людини, стимулюючи утворення ФНП бактеріальними ліпополісахаридами (ЛПС). Отримання ФНП таким способом мало ряд недоліків: довготривалість процесу, низький вихід ФПН, наявність у донорському матеріалі (кров) алергенів та інфекційних агентів, тому наступним поколінням препаратів ФНП стали модифіковані білки, отримані на основі рекомбінантних продуцентів -- бактерій, дріжджів, перещеплюваних клітин ссавців, клітин рослин.

Мета статті: здійснити огляд літературних джерел з метою аналізу рекомбінантних продуцентів фактора некрозу пухлин, навести їх переваги та недоліки, а також визначити особливості культивування та здатність до продукції ФНП.

Виклад основних результатів дослідження. Серед прокаріотичних клітин найбільш поширеними продуцентами рекомбінантного фактора некрозу пухлин є різні штами Escherichia coli (табл. 1). До переваг їх використання можна віднести велику різноманітність комерційно доступних експресійних векторів; відносну дешевизну компонентів поживних середовищ для вирощування прокаріотів; високу швидкість росту клітин; внутрішньоклітинну експресія ФНП; накопичення ФНП у тільцях-включеннях, що спрощує його виділення й очищення; відсутність контамінації цільового продукту вірусами або пріонами; високий вихід цільового продукту (50-- 1700 мг/л). До недоліків використання прокаріотів як рекомбінантних продуцентів ФНП слід віднести такі: контамінація бактеріальними ендотоксинами, що вимагає спеціальних способів очищення і контролю цільового продукту; відсутність посттрансляційних модифікацій рекомбінантного білка (глікозилювання, алкілування тощо); необхідність ренатурації in vitro цільового продукту.

Таблиця 1. Синтез фактора некрозу пухлин рекомбінантними штамами Escherichia coli

Нині створено ряд прокаріотичних рекомбінантних продуцентів ФНП. Зокрема, E. coli BL21(DE3) pTNF5, що характеризується виходом ФНП у кількості 70 мг/л за невеликої тривалості культивування. Слід відмітити, що для продукції ФНП необхідне внесення індуктора IPTG на початку процесу біосинтезу [2].

Наступним продуцентом ФНП є E. coli BL21(DE3) hTNF-pET11, процес культивування клітин даного штаму характеризується збільшеною тривалістю і на 20 мг/л нижчим виходом ФНП. Серед особливостей процесу біосинтезу є внесення індуктора ФНП IPTG після досягнення значення оптичної щільності культуральної рідини 0,7--0,8 при довжині хвилі 600 нм [3].

Порівняно з попередніми штамами, отримання ФНП з використанням E. coli C600/pBV-TRAIL має суттєві відмінності: збільшений до 30 год процес культивування, високий вихід ФНП -- 1600 мг/л. Особливістю ведення біотехнологічного процесу є різка зміна температурного режиму -- із 30 °C на початку біосинтезу до 42 °С через 26 год культивування. Даний технологічний прийом необхідний для індукції синтезу цільового білка. Також застосовується двоступеневе підживлення іонами цинку: на початку процесу культивування вносять джерело іонів Zn²+ (ZnSO₄ * 7H₂O) у концентрації 0,5 г/л, а на 26 год ферментації разом з підвищенням температури додатково вносять 2,3 г/л джерела катіонів цинку і культивування продовжують ще 4 год. Додавання в культуральну рідину іонів цинку збільшує продукцію

ФНП, що можна пояснити специфічним впливом іонів металів на його білкову структуру, а саме: стабілізацію гомотримерної форми ФНП [4].

Серед еукаріотичних продуцентів ФНП виділяють перещеплювані культури клітин ссавців, дріжджі, а також клітини рослин. Вказані системи експресії рекомбінантного ФНП мають свої переваги і недоліки [5] (табл. 2).

Таблиця 2. Переваги і недоліки використання еукаріотичних систем експресії рекомбінантного фактора некрозу пухлин

На сьогодні створені генетично-модифіковані еукаріотичні системи експресії рекомбінантного ФНП, серед яких дріжджі (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae), перещеплювані клітини ссавців (клітини яєчника китайського хом'яка -- СНО), рослини (Solanum tuberosum -- картопля) (табл. 3).

Таблиця 3. Приклади еукаріотів -- продуцентів рекомбінантного фактора некрозу пухлин

Розглядаючи перспективні продуценти рекомбінантних цитокінів, варто відзначити рослини, що можуть виступати привабливою альтернативою традиційним культурам клітин ссавців або модельних систем мікробних клітин. За допомогою технології рекомбінантних ДНК можливе створення рослин для отримання великих кількостей лікарських засобів і промислових білків, що мають високу якість при відносно низьких затратах [10]. Зокрема, фактор некрозу пухлин було експресовано в генетично модифікованій картоплі. При конструюванні вектора використовували два типи касет експресії (частин ДНК-вектора), що містили як промотор 35S CaMV і трансляційний енхансер з ВТМ. Одна з касет мала додаткові послідовності, що кодують N-кінцевий сигнальний пептид і С-кінцевий пептид, що відповідає за внутрішньоклітинне сортування білків ендоплазматичним ретикулумом. В обох випадках вихід ФНП складав близько 15 мкг біологічно активного білка на 1 г рослинної тканини [9].

Рекомбінантне виробництво трансгенними рослинами терапевтичних білків, таких як цитокіни (фактор некрозу пухлин), може бути вирішенням проблеми задоволення попиту на терапевтичні білки для терапії таких серйозних захворювань, як рак. Оскільки клінічне використання фракціонованих молекул плазми крові, з якої отримують ФНП, обмежене високими затратами виробництва, використання рекомбінантних біофармацевтичних препаратів, отриманих з рослин, є реальною альтернативою для забезпечення ефективного лікування. До переваг використання продуцентів-рослин також варто віднести зручність процесу виробництва та відсутність жорсткого контролю і суворого дотримання специфічних умов, як при культивуванні бактеріальних продуцентів та інших клітин, оскільки цільовий продукт синтезується і накопичується при рості цілої рослини, яку можна вирощувати в польових або тепличних умовах.

Висновки

Розглянувши особливості прота еукаріотичних продуцентів фактора некрозу пухлин, слід зазначити, що всі вони мають як переваги, так і недоліки. Використання рекомбінантних клітин E. coli характеризується такими перевагами: високий вихід ФНП, відсутність контамінації цільового продукту інфекційними агентами та відносна економічна рентабельність. Але відсутність посттрансляційних модифікацій рекомбінантного білка та необхідність ренатурації in vitro цільового продукту ускладнює процес виробництва.

Серед еукаріотичних систем експресії людського ФНП перспективним є використання клітин дріжджів і рослин. Хоча наведені щодо них дані показують, що вказані системи мають як переваги, так і недоліки, тому, враховуючи щорічне зростання кількості онкологічних захворювань, створення нових продуцентів фактора некрозу пухлин є актуальним завданням сучасних біотехнологій.

Література

1. Шмелёв В.А. РЕФНОТ. Рекомбинантный вактор некроза опухолей -- Тимозин-а1, препарат с низкой системной токсичностью для лечения онкологических заболеваний / В.А. Шмелёв. -- Москва : Рефнот-Фарм, 2010. -- 92 с.

2. Новый штамм-продуцент фактора некроза опухолей человека на основе E. coli /

E. В. Суровцева, Т.В. Кузнецова, В.Г. Хоменкова и др. // Биоорган. хим. -- 2005. -- № 5. -- С. 474--481.

3. Curnis F. Production and Characterization of Recombinant Human and Murine TNF /

F. Curnis, A. Corti // Methods in Molec. Med. -- 2004 -- Vol. 98. -- P. 9--22.

4. Improvement of expression level and bioactivity of tumor necrisis factor-related apoptosis-inducing ligand (Apo2L/TRAIL) by a novel zinc ion feeding strategy / Ai-You Sun, Ya-Ling Shen, Ji-Cheng Yin et al. // Biotech. Lett. -- 2006. --Vol. 28. -- Р. 1215--1219.

5. Серёгин С.В. Оптимизация конструкций рекомбинантных ДНК для получения иммунобиологических препаратов. Дис док. биол. наук. / С.В. Серёгин. -- 2015. -- 311 с.

6. Expression of a functional human tumor necrosis factor-а (hTNF-a) in yeast Saccharomyces cerevisiae / Seung-Moon Park, Ae-Young Mo, Yong-Suk Jang et al. // Biotechnol. and Biopr. Eng. -- 2004. -- Vol. 9. -- Р. 292--296.

7. Kotikanyadan S. Pat. USA № 5.002.876 East production of human tumor necrosis factor / S. Kotikanyadan, F. Motohiro, H. Rica. -- Publ. 26.03.1991.

8. Пат. № 2556816 РФ. Штамм клеток яичников китайского хомячка -- продуцент рекомбинантного антитела против фактора некроза опухоли альфа человека / А.В. Петров, А.С. Симбирцев, А.М. Ищенко и др. -- Опубл. 20.01.2013.

9. Expression of biologically active human tumor necrosis factor--alpha in trans-genic potato plant / K. Ohya, N. Itchoda, K. Ohashi, M. Onuma et al. // J. Interferon Cytokine Res. -- 2002. -- Vol. 22. -- Р. 371--378.

10. Скроцька О.І. Досягнення сучасних біотехнологій для отримання модифікованих продуктів харчування / О.І. Скроцька, О.В. Мор'єва // Харчова промисловість. -- 2015. -- № 18. -- С. 94--100.

Размещено на Allbest.ru