Псевдогипертрофические прогрессирующие мышечные дистрофии у детей: алгоритмы диагностики и медико-генетического консультирования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Специальность - Нервные болезни

на тему: Псевдогипертрофические прогрессирующие мышечные дистрофии у детей: алгоритмы диагностики и медико-генетического консультирования

Выполнила:

Подагова Екатерина Владимировна

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Российский Государственный Медицинский Университет Росздрава.

Научные руководители: доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор Мальмберг С. А., Дадали Е. Л.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор кандидат медицинских наук, доцент Зыков В.П, Ситников В.Ф.

Ведущая организация: ГУ НИИ Неврологии РАМН.

Защита диссертации состоится “29” мая 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.01 в ГОУ ВПО Российском Государственном медицинском университете Росздрава по адресу: 117869, Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Автореферат разослан «14» марта 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат медицинских наук, профессор Л.В. Губский.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Поясно-конечностные прогрессирующие мышечные дистрофии (ПКМД) - группа генетически гетерогенных заболеваний с изолированным или преимущественным поражением мышц плечевого и тазового поясов конечностей [Anastasi G et al. 2004, Arahata K. 2000, Kumagai T et al. 2001, Nigro V. 2003]. Показано, что наиболее злокачественное течение характерно для, так называемых, псевдогипертрофических вариантов ПКМД, которые делятся на дистрофинопатии и саркогликанопатии [Fischer D et al. 2005, Gulati S et al. 2003, Sunada Y. 2004]. В группу дистрофинопатий включены ПМД Дюшенна и Беккера, которые представляют собой аллельные варианты, обусловленные различными мутациями в гене белка дистрофина [Дадали Е.Л. 1999, Иллариошкин С.Н. и соавт. 1998, Nonaka I. 2004]. Группа саркогликанопатий представлена 4 вариантами ПКМД - 2С, 2D, 2E, 2F типов, наследующихся по аутосомно-рецессивному типу и обусловленных мутациями в генах четырех трансмембранных белков - альфа, бета, гамма и дельта саркогликанов [Beckmann J.S. et al. 1996, Dincer P et al. 2000, Emery A.E. 2002]. Имеющиеся в литературе немногочисленные работы, посвященные проведению клинико-генетических корреляций, показали отсутствие выраженных различий клинических и нейрофизиологических проявлений ПМД Дюшенна и саркогликанопатий, что можно объяснить сходством патогенетических механизмов и морфологического дефекта, возникающего при этих группах заболеваний [Dua T 2001, Zats M. et al. 1989, Мальмберг С.А., 2000]. Известно, что дистрофин и саркогликаны входят в состав дистрофин-гликопротеинового комплекса, посредством которого осуществляется связь цитоскелета миофибрилл с внеклеточным матриксом [Баранов А.Н. 2000, Гринио Л.П. и соавт. 1997, Ananda A et al. 1999]. Нарушение одного из компонентов этого комплекса приводит к его деградации и некрозу мышечных волокон, с последующим замещением их соединительной тканью [Бадалян Л.О. и соавт. 1988, Темин П.А. и соавт. 1997, Шишкин С.С. 1997]. Сходство клинических проявлений этих генетически гетерогенных заболеваний осложняет проведение их дифференциальной диагностики и планирование профилактических мероприятий в отягощенных семьях в процессе проведения медико-генетического консультирования [Hausmanova-Petrusewicz I et al. 2000, Ozawa E. 1999]. Это определяет необходимость создания четких алгоритмов диагностики отдельных генетических вариантов псевдогипертрофических форм ПМД, использование которых позволит избежать ошибок при расчетах риска и заключениях о состоянии здоровья будущего ребенка во время проведении дородовой диагностики. Однако разработка таких алгоритмов невозможна без проведения тщательного клинического, биохимического, иммуногистохимического и молекулярно-генетического обследования больных и членов их семей. Основное внимание при проведении комплексного анализа должно быть направлено на изучение частот встречаемости и особенностей фенотипических проявлений различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД у больных мужского пола, а также характера клинических симптомов у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина и больных женского пола с аутосомно-рецессивными вариантами псевдогипертрофических форм ПМД. Результаты исследований позволят не только оптимизировать процесс диагностики и дифференциальной диагностики различных вариантов псевдогипертрофических форм ПМД, но и повысить результативность при проведении медико-генетического консультирования отягощенных семей.

Цель исследования: создание алгоритмов диагностики и медико-генетического консультирования семей отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПКМД на основе проведения комплексного обследования больных и членов их семей.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

Оценить частоту встречаемости ПМД Дюшенна и аутосомно-рецессивных вариантов псевдогипертрофических ПКМД в выборке больных из популяции РФ.

Провести сравнительный анализ частот встречаемости основных клинических признаков и уровня активности КФК в группах больных с аллельными вариантами ПМД Дюшенна.

Оценить особенности клинических проявлений у больных женского пола с аутосомно-рецессивными вариантами псевдогипертрофических ПКМД и у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина.

Разработать алгоритмы дифференциальной диагностики псевдогипертрофических ПМД у больных мужского и женского пола.

Унифицировать протокол проведения медико-генетического консультирования семей, отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПМД.

Научная новизна.

Впервые на основе проведения комплексного клинического, молекулярно-генетического, биохимического и иммуногистохимического методов обследования больных с фенотипическими проявлениями псевдогипертрофических ПМД проведена оценка частот встречаемости ПМД Дюшенна и псевдогипертрофических вариантов ПМД с аутосомно-рецессивным типом наследования. Выявлены особенности клинических проявлений и биохимических параметров у носительниц мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. Выявлены ранее не описанные в литературе особенности поражения мозга у гетерозиготной носительницы в гене дистрофина. Усовершенствованы алгоритмы диагностики, дифференциальной диагностики и медико-генетического консультирования семей с различными генетическими вариантами псевдогипертрофических форм ПКМД у лиц мужского и женского пола на основе современных иммунногистохимических и молекулярно-генетических данных.

Практическая значимость.

Разработаны четкие протоколы диагностики и дифференциальной диагностики псевдогипертрофических вариантов ПМД у больных мужского и женского пола, необходимые в практической деятельности врача-невролога и генетика. Использование этих протоколов в клинической практике позволит избежать ошибок при проведении профилактических мероприятий в ходе медико-генетического консультирования отягощенных семей.

Положения, выносимые на защиту:

1. В выборке больных мужского пола с псевдогипертрофическими вариантами ПМД из центральных регионов России подавляющее большинство случаев (96,7%) представлено ПМДД, тогда как на долю аутосомно-рецессивных вариантов саркогликанопатий приходится лишь 3,3% случаев. В противоположность этому в группе больных женского пола доля саркогликанопатий составляет 77,8 %, а в 22,2 % случаев заболевание возникает у гетерозиготных носительниц мутаций в гене дистрофина.

2. Существуют различия в частоте встречаемости аллельных вариантов ПМДД, обусловленных делециями, дупликациями и точковыми мутациями в гене дистрофина. В 60,5 % заболевание возникает в результате делеции, в 7,6 % - дупликации и 31,9 % - точковых мутаций в гене дистрофина. Показано отсутствие статистически значимых различий в возрасте начала, частотах встречаемости клинических проявлений и уровне активности креатинфосфокиназы в плазме крови при аллельных вариантах ПМДД.

3. Миопатический симптомокомплекс в проксимальных группах мышц конечностей и/или признаки кардиомиопатии выявляются при тщательном клинико-неврологическом обследовании у 41,8 % облигатных носительниц, что требует назначения профилактического лечения, препятствующего манифестации клинических симптомов. Выявлены ранее неописанные особенности клинических проявлений у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина, характеризующиеся симптомами поражения ЦНС. псевдогипертрофический прогрессирующая мышечная дистрофия

4. Усовершенствованы алгоритмы диагностики псевдогипертрофических ПМД у лиц мужского и женского пола. У 10,6 % больных мужского пола и 78,6 % больных женского пола для дифференциальной диагностики ПМДД и аутосомно-рецессивных саркогликанопатий необходимо использовать иммуногистохимический метод, направленный на обнаружение дистрофиновых волокон в мышечном биоптате.

5. Модифицированы расчеты повторного риска рождения больного ребенка с ПМДД и характер проведения профилактических мероприятий в отягощенных семьях. На основе различий частоты возникновения мутаций в гене дистрофина в женских и мужских гаметах установлено, что при аллельном варианте ПМДД, обусловленном точковыми мутациями вероятность гетерозиготного носительства его матери составляет 97,6 %, что значительно увеличивает эффективность и точность результатов проведения дородовой диагностики в семьях отягощенных ПМДД с использованием косвенных методов ДНК анализа.

Внедрение результатов исследования в практику

Разработанные диагностические протоколы и алгоритмы проведения медико-генетического консультирования семей, отягощенных псевдогипертрофическими вариантами ПМД, успешно используются в практической работе отделения психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями ФГУЗ ДКБ № 38 - ЦЭП ФМБА России, которое является клинической базой кафедры нервных болезней педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, а также в научно-консультативном отделе ГУ Медико-генетического научного центра РАМН. Данные проведенного исследования применяются в лечебной и педагогической работе на кафедре нервных болезней педиатрического факультета, а также включены в лекционные курсы по медицинской генетике на кафедре общей и медицинской генетики медико-биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на юбилейной конференции «15-лет ФГУЗ ДКБ № 38-ЦЭП ФМБА» (2005 г), совместном заседании кафедры нервных болезней педиатрического факультета и кафедры генетики МБФ РГМУ (2007 г).

Публикации.

По теме диссертационного исследования опубликовано 5 научных работ (4 статьи и 1 тезис).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста и включает введение и главы, посвященные обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению и обсуждению полученных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 12 таблицами, 9 рисунками, 5 диаграммами, 17 оригинальными фотографиями, краткими выписками из историй болезни. Библиографический указатель включает 252 (65 отечественных и 187 зарубежных) источника.

Материалы и методы исследования.

Обследованная выборка больных включала 142 пациента с псевдогипертрофическими формами ПМД: 123 больных мужского пола в возрасте от 2,5 до 18 лет и 19 - женского в возрасте от 2 лет 8 мес до 40 лет, находящихся под наблюдением в научно-консультативном отделе МГНЦ РАМН (директор - академик РАМН, профессор Е.К. Гинтер) и в отделении психоневрологии с центром реабилитации детей с двигательными нарушениями (зав. - д.м.н. Мальмберг С.А.) ФГУЗ ДКБ №38 - ЦЭП ФМБА России (главный врач - к.м.н. Голоденко В.И.) в период с 2002 по 2005. Клиническое обследование больных включало неврологический осмотр по общепринятой в клинической нейромиологии методике, сбор анамнестических данных и генеалогический анализ. В соматической сфере был сделан акцент на тщательном контроле сердечной и дыхательной деятельности. Оценка уровня зрелости и специфики развития интеллекта исследовалась с помощью шкалы Векслера. Электромиографическое исследование проводилось с использованием 4-х канального электронейромиографа «Нейро-МВП» фирмы Нейрософт (Иваново, Россия). С целью обнаружения поражения сердечной мышцы проводилось эхокардиографическое исследование, регистрация ЭКГ и суточное холтеровское кардиомониторирование на аппарате “Oxford Medilog Prima” в трех отведениях с определением среднесуточной частоты сердечных сокращений, циркадного индекса, стандартных параметров ЭКГ, аритмий, вариабельности ритма сердца с применением временного анализа. Определение уровня активности креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), мышечных изоформ аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартатаминотрансферазы (АсАт) проводилось по стандартной методике на автоматическом биохимическом анализаторе Vitalab Flexor PC и полуавтоматическом биохимическом анализаторе Eclipse фирмы Merck. ДНК-диагностика у больных мужского пола осуществлялась методом мультиплексной амплификации с анализом 20 экзонов и промоторной области в лаборатории ДНК-диагностики МГНЦ РАМН (зав. - д.б.н., проф. Поляков А.В.). Больным женского пола с клиническими признаками псевдогипертрофической ПМД проводилось исследование кариотипа с использованием дифференцированной G окраски по стандартным методикам. При выявлении несбалансированной лайонизации одной из Х хромосом учитывали данные о том, что основным фактором инактивации Х-хромосомы у девочек является дифференцированное метилирование в различных ее участках. Использование рестриктаз, чувствительных к метилированию, то есть расщепляющих ДНК только тогда, когда в сайте их рестрикции метилирование отсутствует, дает основание судить об уровне метилирования генов Х хромосомы. При наличии несбалансированной лайонизации Х хромосомы после обработки ДНК эндонуклеазой, будет преимущественно амплифицироваться один из двух аллелей, которые наблюдались в равном соотношении после проведения реакции амплификации на ДНК, не подвергнутой обработке рестриктазой. Имунно-гистохимический анализ, направленный на определение дичстрофиновых волокон в биоптате четырехглавых мышц проводился при помощи антител, специфичных к С-домену, Rod - домену и N-концу белка дистрофина. Мышечный биоптат обрабатывался согласно стандартному иммунно-цитохимическому протоколу. Для выявления эпитопов дистрофина использовали антитела DYS-1, DYS-2 и DYS-3 "Novocastra" (Великобритания).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ частот встречаемости ПМДД в группе больных мужского пола с псевдогипертрофическими вариантами ПМД.

Точная диагностика ПМДД у больных мужского пола с псевдогипертрофическим вариантами ПМД осуществлялась в случаях: наличия X -сцепленного рецессивного наследования заболевания, обнаружения делеции в гене дистрофина и установления гетерозиготного носительства матерью пробанда в изолированных случаях на основе повышения уровня креатинфосфокиназы в плазме крови. Х-сцепленная сегрегация заболевания обнаружена в 26 семьях (21,2 % от общего количества семей), в двух обследованных семьях (1,6 %) наличие сходного заболевания выявлено у сестер пробандов, что дало основании диагностировать аутосомно-рецессивный вариант ПКМД, в остальных 95 семьях (77,2 %) пробанд был единственным больным в семье. При проведении ДНК анализа, направленного на выявление делеций и дупликаций в гене дистрофина, в группу больных с ПМДД отнесен еще 71 больной больных (при этом у 62 больных идентифицирована делеция, а у 9 больных дупликация в гене дистрофина).

В оставшихся семьях с наличием единственного больного всем матерям пробандов проведено исследование уровня КФК в плазме крови. В качестве порогового значения для установления носительства был принят показатель в 150 ед/л. Результатами этого исследования явилось установление гетерозиготного носительства мутации у 11 матерей больных мальчиков. Таким образом, в результате проведения такого комплексного исследования диагноз ПМДД установлен у 108 больных, что составило 87,8 % случаев в обследованной нами выборке больных мужского пола и в двух случаях идентифицирован аутосомно-рецессивный вариант псевдогипертофической ПКМД.

У 13 больных мальчиков, у матерей которых значения активности КФК были в границах нормы, а сами пациенты были единственными больными в семьях, проведение дифференциального диагноза между ПМДД/Б и псевдогипертофическими вариантами ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования требовало осуществления иммуногистохимического анализа биоптатов скелетных мышц с целью обнаружения дистрофин-позитивных волокон. Отсутствие дистрофин-позитивных волокон обнаружено у 11 из 13 обследованных, что позволило установить диагноз ПМДД/Б. В 2 случаях с выявленными дистрофин-позитивными волокнами у больных диагностирован аутосомно-рецессивный вариант ПКМД. Таким образом, на основании данных генеалогического и иммуногистохимического анализа количество случаев с аутосомно-рецессивными псевдогипертрофическими вариантами ПКМД увеличилось до четырех (см. таблицу 1).

Таблица 1. Распределение больных с изолированными случаями псевдогипертрофических ПМД, диагностируемых с помощью различных методов.

Таблица 2. Частоты встречаемости клинических признаков у больных с делеционными и неделеционными вариантами ПМДД

Полученные результаты не выявили значимых различий в спектре и частоте встречаемости основных фенотипических проявлений ПМДД в трех обследованных группах.

3. Клинические характеристики различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД у лиц женского пола.

Под нашим наблюдением находилось 19 больных женского пола (из 18 семей) в возрасте от 2 лет 8 мес до 40 лет с выраженными клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПМД. Известно, что наличие признаков заболевания у женщин может быть обусловлено, как манифестацией аутосомно-рецессивных вариантов псевдогипертрофических ПМД, так и возникновением заболевания у гетерозиготных носительниц мутации в гене дистрофина в результате количественных или структурных перестроек Х-хромосомы. Всем больным женского пола проводилось исследование кариотипа с использованием дифференциальной G -окраски, молекулярно-генетический анализ, направленный на идентификацию несбалансированной лайонизации Х-хромосомы в клетках крови, а также генеалогический анализ. Двенадцати больным, у которых используемые диагностические методы не позволяли уточнить генетический вариант, проведен иммуногистохимический анализ, направленный на идентификацию дистрофиновых волокон. В итоге - используемый комплекс диагностических методов позволил идентифицировать генетические варианты в рамках заданных критериев у всех больных женского пола.

Показано, что у 5 из 19 обследованных больных женского пола (26,3 %) возникновение выраженных клинических проявлений ПМД было обусловлено наличием мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. У одной пациентки клинические симптомы ПМД были обусловлены мозаичным вариантом синдрома Шерешевского-Тернера, а у 4 больных (21%) наблюдалась несбалансированная лайонизация Х-хромосомы, которая привела к преимущественной инактивации хромосомы, не несущей патологической мутации в гене дистрофина (Таблица 3).

Таблица 3. Распределение различных генетических вариантов в анализируемой группе псевдогипертрофических форм ПМД у больных женского пола.

Учитывая полученные результаты, свидетельствующие о возможности возникновения выраженных клинических проявлений ПМДД у гетерозиготных носительниц, нами проведено клиническое, биохимическое и электромиографическое обследование 43 облигатных носительниц из 40 семей в возрасте от 28 до 50 лет, не предъявлявших жалоб на момент осмотра.

Факт гетерозиготного носительства устанавливался на основании проведения генеалогического анализа, свидетельствующего об Х-сцепленной рецессивной сегрегации заболевания и/или обнаружения повышения уровня КФК в плазме крови. В результате проведения обследования клинические проявления обнаружены у 18 из 43 носительниц (см. рисунок 3).

У 11 из 18 носительниц (61,1 %) выявлялись только миопатический симптомокомплекс наряду с умеренно выраженными псевдогипертрофиями икроножных мышц, у 6 больных (33,3 %) наблюдалось сочетание миопатического симптомов и кардиомиопатии. Лишь у 1 носительницы (5,5 %) были выявлены изолированные признаки кардиомиопатии.

4. Медико-генетическое консультирование при псевдогипертрофических вариантах ПМД.

Медико-генетическое консультирование (МГК) отягощенных семей является необходимым этапом при проведении обследования пробандов с псевдогипертрофическими вариантами ПКМД. МГК традиционно включает три основных этапа. Наиболее важным из них является первый, диагностический этап, от успешности проведения которого зависит эффективность консультирования в целом. На основании результатов собственных исследований и анализа литературных данных нами усовершенствована методика проведения двух основных этапов МГК, направленных на диагностику и дифференциальную диагностику различных генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД и модифицированы таблицы расчетов риска рождения больного ребенка в семьях с аллельными вариантами ПМДД. Алгоритм диагностики у лиц мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПКМД представлен на рисунке 4. В абсолютном большинстве случаев псевдогипертрофических ПМД диагностический поиск будет ограничиваться предложенным алгоритмом.

Однако в части случаев (в нашей выборке количество таких больных не превышает 3 %) возникает необходимость продолжения диагностического поиска оставшихся четырех генетических вариантов псевдогипертрофических ПМД. С этой целью нами предложен следующий алгоритм диагностики псевдогипертрофических ПМД с аутосомно-рецессивным типом наследования, который представлен на рисунке 5. Учитывая результаты собственных исследований, а также литературные данные, свидетельствующие об отсутствие значимых клинических, биохимических, электромиографических признаков, позволяющих уверенно дифференцировать ПМДД и псевдогипертрофические варианты ПМД, основой для предложенного диагностического алгоритма этой группы заболеваний явились литературные данные о частотах встречаемости отдельных генетических вариантов.

Нами показано, что 27,8 % обследованных больных женского пола возникновение выраженных клинических проявлений псевдогипертрофических вариантов ПМД было обусловлено наличием мутации в гене дистрофина в гетерозиготном состоянии. В связи с этим дифференциальная диагностика у пациенток женского пола должна быть направлена в первую очередь на исключение гетерозиготного носительства патологической мутации в гене дистрофина (см. рисунок 6.)

Рисунок 4. Алгоритм диагностики у лиц мужского пола с клиническими проявлениями псевдогипертрофических ПКМД

Рисунок 5. Алгоритм диагностики псевдогипертрофических вариантов ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования

Рисунок 6. Алгоритм дифференциальной диагностики различных вариантов псевдогипертрофических ПКМД у лиц женского пола

4.3. Принципы расчетов риска возникновения ПМДД у потомков родственниц пробандов с различными аллельными вариантами заболевания.

При четком установлении генотипа матери пробанда и ее родственниц расчеты риска не представляют сложностей и проводят на основании типов образующихся гамет. Известно, что женщины-гетерозиготные носительницы мутаций имеют 50 % вероятность рождения больного сына или дочери-носительницы. Наибольшие сложности возникают при наличии единственного больного в семье, а генотип его матери установить не удалось, так уровень креатинфосфокиназы у нее был в пределах нормы. Традиционно, при расчетах вероятности носительства мутации в гетерозиготном состоянии у родственниц пробандов с Х-сцепленными-рецессивными заболеваниями используют теорему Байеса (расчеты риска с различной вероятностью возникновения 2-х независимых событий). В качестве априорной вероятности носительства женщиной патологической мутации в одном из генов Х-хромосом обычно принимают показатель в 4 (где - частота мутирования на гамету на поколение). Этот показатель складывается из частот мутирования в женских гаметах 2 и мужских 2. При равной частоте мутирования в женских ( )и мужских половых клетках () и фертильности больных f=0 (известно, что больные ПМДД не оставляют потомства) этот показатель принимается равным 4. Используя этот показатель в качестве априорной вероятности при наличии единственного больного в семье и отсутствия родственников мужского пола по материнской линии, вероятность гетерозиготного носительства у матери пробанда оказывается равной 2/3 (66 %,) и риск рождения больного ребенка составляет 33 % (таблица 4).

Таблица 4. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда в спорадических случаях.

Таблица 5. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда с наличием точковой мутации при четко установленном диагнозе ПМДД.

Таблица 6. Расчет вероятности носительства мутации в гене дистрофина матерью пробанда с ПМДД, обусловленного делецией или дупликацией в гене дистрофина.