Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса

Курникова Мария Андреевна

МОСКВА, 2007

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Государственном учреждении Медико-генетический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Мутовин Геннадий Романович

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Петрин Александр Николаевич

доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович

Ведущая организация:

ГОУ ДПО “Российская медицинская академия последипломного образования”

Защита диссертации состоится «26» марта 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.03 при Российском государственном медицинском университете по адресу: г. Москва, 117997, ул. Островитянова, д.1.С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ

Росздрава

Автореферат разослан «22» февраля 2007 г.Ученый секретарь Диссертационного совета,доктор медицинских наук, профессорМарченко Л.Ф.

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Синдром Элерса - Данлоса (СЭД) представляет собой гетерогенную группу наследственных соединительно-тканных заболеваний, объединенных на основе общих клинических признаков - гипермобильности суставов, повышенной растяжимости кожи, нарушений развития скелета, сердечно-сосудистых изменений и другой симптоматики, обусловленной дисплазией соединительной ткани. По данным некоторых авторов, СЭД является самым частым наследственным соединительно-тканным заболеванием [Burrows N.P., 1999].

В настоящее время выделено 6 типов СЭД, обусловленных различными генетическими причинами [Beighton P. и соавт., 1998]. Клиническое и молекулярно-генетическое разграничение типов СЭД актуально для медико-генетического консультирования, так как разные типы СЭД имеют разный тип наследования, отличаются по тяжести клинических проявлений и имеют разный прогноз для здоровья пациента и его родственников.

Одним из наиболее часто встречающихся типов СЭД является классический тип (КТ). Его популяционная частота оценивается примерно 1:10000 - 1:40000 [Byers, P.H., 2004]. КТ СЭД объединяет два типа заболевания, которые выделялись в предыдущей, Берлинской классификации 1986 года - I (gravis, тяжелый) и II (mitis, умеренный) [Beighton P. и соавт., 1986]. При одинаковых критериях диагностики для обоих типов учитывалась тяжесть клинических проявлений. В дальнейшем было установлено, что мутации в одних и тех же генах - генах б1- и б2- цепей коллагена V типа - приводят к фенотипическим проявлениям как I, так и II типов СЭД [Burrows N.P. и соавт., 1996]. На этом основании при пересмотре классификации СЭД в 1997 году эти типы объединили в один, классический, тип [Beighton P. и соавт., 1998].

В клинической практике постановка диагноза КТ СЭД вызывает определенные трудности, особенно в случаях умеренно выраженных признаков заболевания, что связано с клиническим полиморфизмом и общностью симптомов между КТ СЭД и другими нозологическими формами соединительно-тканных дисплазий. Во многих исследованиях было продемонстрировано отсутствие морфологических и биохимических маркеров, патогномоничных для КТ СЭД [Black C. и соавт., 1980; Steinmann B. и соавт., 2002; Proske S. и соавт., 2006].

В связи с этим весьма актуальным представляется молекулярно-генетическое изучение этиологии данного заболевания. За последние годы отмечен значительный прогресс в области изучения этиологии и патогенеза КТ СЭД. На сегодняшний день, по разным данным, примерно в 30-50% случаев при КТ СЭД удается установить генетический дефект. В подавляющем большинстве случаев это мутации в генах коллагена V типа [Malfait F. и соавт., 2005; Michalickova K. и соавт., 1998; Nicholls A.C. и соавт., 1996].

При подозрении на СЭД чрезвычайно важна стандартизация данных клинического обследования, так как она позволяет максимально подробно и объективно оценить клиническую картину заболевания. Разработка системы регистрации данных клинического и инструментального обследования больных с подозрением на СЭД с учетом основных и дополнительных критериев каждого типа может оказать помощь врачам в постановке клинического диагноза и проведении дифференциальной диагностики между типами СЭД.

В нашей стране ранее не проводилось комплексное клиническое и молекулярно-генетическое исследование ни одного из типов СЭД, включая КТ. Поэтому разработка метода молекулярно-генетической диагностики КТ СЭД позволит проанализировать гено-фенотипические корреляции и использовать данный вид диагностики для подтверждения клинического диагноза.

Цель исследования.

Разработка системы регистрации мутаций в генах коллагена V типа (COL5A1 и COL5A2) и выявление гено-фенотипических корреляций в группе пациентов с КТ СЭД.

Задачи исследования.

Разработать стандартную схему клинического обследования и систему регистрации результатов обследования с формированием компьютерной базы данных для больных с подозрением на СЭД.

Провести анализ клинических признаков среди пациентов с подозрением на СЭД и установить клинический диагноз.

Сформировать выборку пациентов для проведения молекулярно-генетического анализа (исследование генов COL5A1 и COL5A2).

Разработать систему регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5A1, а также провести молекулярно-генетическое исследование всей кодирующей последовательности и областей экзон-интронных соединений гена COL5A2 в выборке больных.

Провести анализ гено-фенотипических корреляций у больных с КТ СЭД. синдром элерс ген

Разработать практические рекомендации для проведения молекулярно-генетического исследования при КТ СЭД.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Схема клинического обследования пациента с подозрением на СЭД, составленная с учетом критериев международной классификации СЭД, позволяет стандартизировать клиническое обследование и проводить дифференциальную диагностику различных типов СЭД. Разработанная система регистрации полученных данных может использоваться как на бумажных носителях, так и виде компьютерной базы, позволяющей проводить статистический анализ результатов.

Впервые в России проведено молекулярно-генетическое исследование КТ СЭД. Разработана система регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5A1 и система поиска мутаций в гене COL5A2. Показано, что поиск «нулевых аллелей» в гене COL5A1 является эффективным способом молекулярно-генетической диагностики заболевания среди пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД.

Положения, выносимые на защиту.

Схема обследования пациентов с подозрением на СЭД, разработанная с учетом основных и дополнительных критериев различных типов СЭД в соответствии с международной классификацией, позволяет стандартизировать клиническое обследование, провести дифференциальную диагностику между различными типами и избежать гипердиагностики СЭД.

При постановке клинического диагноза «КТ СЭД» следует выделять тяжелый вариант заболевания, характеризующийся генерализованной гипермобильностью суставов, генерализованной гиперрастяжимостью кожи, множественными атрофичными рубцами и подкожными псевдоопухолями.

Система регистрации «нулевых аллелей» в гене COL5A1 c использованием полиморфных маркеров является эффективным способом поиска мутаций в гене COL5A1 при тяжелом варианте КТ СЭД.

Апробация работы.

По материалам исследования опубликованы 9 работ. Материалы диссертации были представлены в виде стендовых презентаций на ежегодных научных конференциях Европейского общества генетики человека (ESHG) 2002 и 2003 гг и доложены на I Всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (2002 г) и на Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (2006 г).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 125 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы, приложение. Библиография содержит 9 отечественных и 115 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 22 таблицами и 12 рисунками, приложение содержит карту обследования и 8 фотографий.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В ходе клинического исследования были обследованы пациенты с направляющим или уже установленным диагнозом «Синдром Элерса-Данлоса». Обследованные пациенты наблюдались на кафедре клинической генетики педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в отделениях ФГУ "МНИИ педиатрии и детской хирургии Росздрава" и отделениях Российской детской клинической больницы.

Всего обследовано 108 человек (56 пробандов и 52 родственника) из 56 семей в возрасте от 2 до 64 лет. Личный осмотр родственников 15 пробандов не представлялся возможным, в остальных случаях были осмотрены один или несколько родственников.

При клиническом обследовании данные о каждом пациенте заносились в разработанную карту, составленную на основании критериев диагностики СЭД согласно классификации 1997 года. Карта имеет разделы, соответствующие системам органов, вовлеченных в патогенез СЭД: кожные покровы, суставы, костно-мышечная система, внутренние органы и сосуды и органы зрения. Каждый раздел включает подразделы, уточняющие клиническое многообразие и выраженность проявлений болезни при разных типах СЭД. Карта также предусматривает возможность внесения дополнительных симптомов, не вошедших в отдельные пункты, а также учитывает данные семейного анамнеза, результаты дополнительных методов обследования (УЗИ, ЭКГ, Эхо-КГ и др.) и заключения специалистов. Данная карта доступна как на бумажных носителях, так и в виде разработанной компьютерной базы данных (Microsoft Access 2000, Рис.1).

Рис.1.

Пример окна интерфейса компьютерной базы данных пациентов с СЭД.

У больных, вошедших в выборку для молекулярно-генетического исследования (31 человек), были взяты образцы крови путем венопункции и биопсия кожи. Биопсия кожи (участок диаметром 2-4 мм) производилась с передней средней трети предплечья с использованием одноразового скальпеля и пинцета под местным обезболиванием (0.1 мл 2 % лидокаина подкожно).

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов периферической крови выполняли с помощью набора реактивов для выделения DIAtomтм DNA Prep100 (Isogene Lab.ltd., Россия) по протоколу производителя.

Культивирование фибробластов кожных биоптатов осуществлялось в питательной среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки с периодической сменой среды. Выражаю глубокую благодарность сотрудникам лаборатории молекулярной биологии с группой клеточных культур ГУ МГНЦ РАМН и лично в.н.с. Терехову С.М..

Выделение тотальной мРНК осуществлялось из культуры клеток кожных фибробластов с использованием набора реактивов RNAgentsTotal RNA Isolation System (Promega, США) согласно протоколу фирмы производителя.

Для получения кДНК производили обратную транскрипцию с использованием набора реагентов Promega® Reverse Transcription System, Technical Bulletin No.099 (Promega, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК и кДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия) с использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров, которые синтезировались в НПО «Литех» или НПО“SYNTOL”.

Исследование полиморфных маркеров проводилось методом ПДРФ-анализа. Результаты оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля раствором бромистого этидия и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении. В работе использовали эндонуклеазы производства фирмы «СибЭнзим»(Россия), «Fermentas» (Литва) и «Promega» (США).

Для выявления изменений нуклеотидной последовательности гена COL5A2 использовался метод SSCP-анализа [Orita и соавт., 1989] с щелочной денатурацией амплифицированных фрагментов кДНК с последующим их электрофорезом в неденатурирующем полиакриламидном геле, окраской геля 1х раствором SYBR Gold nucleic acid gel stain (InvitrogeneMolecular Probes, США) и регистрацией с помощью документирующей системы GelDoc фирмы BIO-RAD (США) в УФ-излучении.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ данных клинического обследования.

Среди 108 обследованных было выявлено 86 больных с различной соединительно-тканной патологией (таблица 1), в том числе 56 пробандов и 30 родственников, и 22 условно здоровых индивида (все - родственники пробандов). Под «условно здоровыми» в данном случае подразумевали тех индивидов, у которых проявления соединительно-тканной дисплазии либо отсутствовали, либо отмечались отдельные неспецифичные признаки. Суммарные данные анамнеза, осмотра и других методов исследования приведены в таблице 2.

Таблица 1.

Спектр соединительно-тканной патологии, выявленной в результате клинического обследования, среди всех больных и в выборке для молекулярно-генетического исследования.

Диагноз	Количество больных	Количество больных в выборке для молекулярно-генетического исследования
		поиск «нулевых аллелей» в гене COL5A1	поиск точковых мутаций в гене COL5A2
Классический тип СЭД	тяжелый (I, gravis)	11	9	4
	умеренный (II, mitis)	13	10	4
Недифференцированная дисплазия соединительной ткани (НДСТ)	47	5
Признаки ДСТ у детей в возрасте до 5 лет	4
Кифосколиотический тип СЭД	1
Смешанные фенотипы	10	7	2
Всего	86	31	10

Таблица 2.

Частота встречаемости признаков СЭД среди всех обследованных, больных, условно здоровых и в выборке пациентов для молекулярно-генетического исследования.

Исследуемый признак	Частота встречаемости признака (число случаев/% от N)
	Все обследованные N=108	Больные N=86	Условно здоровые N=22	Выборка для молекулярно-генетического исследования N=31
Кожные покровы
Гиперрастяжимость кожи	12(11,1%)	12(14%)	-	10(32,3%)
Умеренно повышенная растяжимость кожи	37(34,3%)	37(43%)	-	17(54,8%)
Множественные атрофичные рубцы	26(24,1%)	26(30,2%)	-	18(58,1%)
Единичные атрофичные рубцы	4(3,7%)	4(4,7%)	-	-
Длительное заживление ран	24(22,2%)	24(28%)	-	12(38,7%)
Бархатистость кожи	21(19,4%)	21(24,4%)	-	11(35,5%)
Подкожные узелки	13(12%)	13(15,1%)	-	7(22,6%)
Подкожные псевдоопухоли	6(5,6%)	6(7%)	-	6(19,4%)
Тонкая, прозрачная кожа	14(13%)	14(16,3%)	-	8(25,8%)
Акрогерия	-	-	-	-
Выраженная хрупкость кожи (рвущаяся кожа)	2(1,9%)	2(2,3%)	-	2(6,5%)
Избыточность кожи	1(0,9%)	1(1,2%)	-	1(3,2%)
Мягкая, тестообразная консистенция кожи	-	-	-	-
Суставы
Гипермобильность суставов (6 баллов и более)	41(38%)	41(47,7%)	-	23(74,2%)
Вывихи, подвывихи	26(24,1%)	25(29,1%)	1(4,5%)	19(61,3%)
Растяжение связок	11(10,2%)	11(12,8%)	-	3(9,7%)
Врожденный вывих бедра	6(5,6%)	6(7%)	-	2(6,5%)
Хронические артралгии	33(30,6%)	33(38,4%)	-	16(51,6%)
Гипермобильность мелких суставов	7(6,5%)	7(8,1%)	-	6(19,4%)
Тяжелая генерализованная гипермобильность	1(0,9%)	1(1,2%)	-	1(3,2%)
Костно-мышечная система
Сколиоз	50(46,3%)	49(57%)	1(4,5%)	24(77,4%)
Кифосколиоз	8(7,4%)	8(9,3%)	-	2(6,5%)
Деформация грудины	32(29,6%)	31(36%)	1(4,5%)	14(45,2%)
Переломы	7(6,5%)	7(8,1%)	-	4(12,9%)
Деформация стопы (плоскостопие, плосковальгусные стопы, косолапость)	51(47,2%)	51(59,3%)	-	24(77,4%)
Мышечная гипотония	12(11,1%)	12(14%)	-	4(12,9%)
Разрыв сухожилий и мышц	-	-	-	-
Повышенная утомляемость	23(21,3%)	23(26,7%)	-	12(38,7%)
Атрофия десневого края	-	-	-	-
Аномальный рост зубов	19(17,6%)	19(22,1%)	-	12(38,7%)
Внутренние органы и сосуды
Грыжи	21(19,4%)	21(24,4%)	-	8(25,8%)
Опущение внутренних органов	28(25,9%)	27(31,4%)	1(4,5%)	14(45,2%)
Пролапс митрального клапана	56(51,9%)	56(65,1%)	-	23(74,2%)
Пролапсы других клапанов сердца	3(2,8%)	3(3,5%)	-	1(3,2%)
Другая сердечно-сосудистая патология	34(31,5%)	33(38,4%)	1(4,5%)	10(32,3%)
Спонтанный пневмоторакс	1(0,9%)	1(1,2%)	-	1(3,2%)
Кровотечения носовые/десенные	37(34,3%)	36(41,9%)	1(4,5%)	16(51,6%)
Кровотечения маточные/почечные/ желудочно-кишечные	8(7,4%)	8(9,3%)	-	2(6,5%)
Разрывы артерий	1(0,9%)	1(1,2%)	-	-
Легкое возникновение экхимозов	50(46,3%)	49(57%)	1(4,5%)	22(71%)
Варикозное расширение вен	19(17,6%)	18(21%)	1(4,5%)	10(32,3%)
Глазная патология
Миопия	26(24,1%)	26(30,2%)	-	9(29%)
Астигматизм	8(7,4%)	8(9,3%)	-	3(9,7%)
Разрывы глазного яблока и роговицы	-	-	-	-
Другое	24(22,2%)	22(25,6%)	2(9,1%)	7(22,6%)

Среди 86 больных были дети (56 человек в возрасте от 1,5 до 16 лет, из них 31 мальчик и 25 девочек) и взрослые (27 женщин в возрасте от 20 до 63 лет и 3 мужчины в возрасте от 19 до 48 лет).

В тех случаях, когда у больных наблюдались признаки дисплазии соединительной ткани (ДСТ), однако их набор не соответствовал набору симптомов известного соединительно-тканного заболевания, мы расценивали их как проявления так называемой недифференцированной дисплазии соединительной ткани (НДСТ).

При постановке диагноза «КТ СЭД» клинически были выделены тяжелый и умеренный варианты данного заболевания. Тяжелый вариант подразумевал наличие генерализованной гипермобильности суставов, генерализованной гиперрастяжимости кожи, множественных атрофичных рубцов как обязательных признаков, а также подкожных псевдоопухолей и гладкой, бархатистой, легко ранимой кожи. При умеренном варианте СЭД повышение растяжимости кожи оценивалось как умеренное, гипермобильность суставов оценивалась в 6-8 баллов по шкале Бейгтона, а атрофичные рубцы могли быть единичными.

Из 86 больных с различной соединительно-тканной патологией была сформирована выборка больных (N=31) для проведения молекулярно-генетического исследования генов COL5A1 и COL5A2. В данную выборку вошли 19 больных с КТ СЭД. В выборке были также пациенты со смешанными фенотипами СЭД и НДСТ с целью определения роли мутаций в генах коллагена V типа при соединительно-тканных дисплазиях, имеющих отдельные признаки КТ СЭД, но не соответствующих данному диагнозу в соответствии с критериями международной классификации 1997 года.

Молекулярно-генетическое исследование.

Поиск мутаций в гене COL5A2

Первый этап заключался в амплификации 11 последовательных фрагментов всей последовательности кДНК гена COL5A2.

На втором этапе проводилась рестрикция 10 из 11 фрагментов в связи с тем, что длины фрагментов, полученных после рестрикции, были оптимальны для проведения SSCP-анализа (не превышали 300 п.н.) (Рис.2).

Рис. 2.

Схема амплифицируемых фрагментов и соответствующих рестриктаз для кДНК гена COL5A2.

На третьем этапе проводился SSCP - анализ. В результате исследования 10 образцов кДНК пациентов, из которых у 8 был клинически поставлен диагноз КТ СЭД и у двух - смешанный фенотип СЭД, ни в одном из изученных фрагментов изменений электрофоретической подвижности обнаружено не было (Рис.3).

Рис.3.

SSCP-анализ амплифицированного фрагмента F11R11 кДНК гена COL5A2.

M - маркер молекулярного веса - ДНК фага л, обработанная эндонуклеазой PstI.

Данные литературы свидетельствуют о сравнительно низкой выявляемости мутаций в гене COL5A2 при КТ СЭД. На сегодняшний день в мире описано 7 пациентов с КТ СЭД, у которых выявили мутации в этом гене, причем 4 из них в 2005 году. Учитывая данные других исследований и наши собственные данные, этот метод был расценен нами как малоинформативный, и дальнейшее исследование гена COL5A2 в нашей работе не проводилось.

Разработка системы регистрации гаплонедостаточности в гене COL5A1.

Классический тип СЭД является одним из заболеваний, в этиопатогенезе которого продемонстрирована роль механизма деградации мРНК, содержащей преждевременные стоп-кодоны (ПСК) [Schwarze U., 2004; Malfait F., 2005; Wenstrup RJ, 2006]. В англоязычной литературе данный механизм называется «noncence-mediated mRNA decay» (NMD) [Maquat L., 2005].

Возникновение ПСК является частым событием мутагенеза. Известно, что примерно одна треть всех наследственных заболеваний, а также многие формы рака обусловлены нонсенс-мутациями или мутациями, приводящими к сдвигу рамки считывания и возникновением ПСК [Frischmeyer P.A.,1999]. Было продемонстрировано, что большинство транскриптов, содержащих ПСК, распознаются и эффективно разрушаются в клетке с помощью механизма NMD. Этот механизм универсален для эукариот и, как полагают, защищает организм от доминантных эффектов утрачивания или приобретения каких-либо функций, к чему могли бы привести укороченные белки в случае стабильности транскриптов с ПСК.

Деградация транскрипта, содержащего ПСК, обнаруживается при сравнительном анализе ДНК и кДНК с использованием специфичных внутриэкзонных полиморфизмов как полная или частичная потеря гетерозиготности в образцах кДНК. Для обозначения понятия «потеря гетерозиготности» в литературных источниках используют также термины «гаплонедостаточность» и «нулевой аллель».

При классическом типе СЭД поиск «нулевых аллелей» имеет ряд преимуществ перед другими способами поиска молекулярно-генетических изменений:

Наибольшее количество мутаций при КТ СЭД локализовано в гене COL5A1; при этом большинство из этих мутаций приводит к возникновению ПСК [Malfait F., 2005].

Прямое секвенирование при поиске мутаций в гене COL5A1 затруднено в связи с большой протяженностью общей и кодирующей последовательностей, отсутствием повторяющихся мутаций и регионов максимальной их концентрации.

Этот метод позволяет косвенно выявить не только нонсенс-мутации, но и делеции/инсерции, приводящие к сдвигу рамки считывания, а также протяженные делеции, не поддающиеся идентификации методами, обычно используемыми для поиска точковых мутаций (SSCP, DGGE, секвенирование и др.).

Для определения мутаций в последовательности кДНК, приводящих к формированию преждевременного стоп-кодона и последующей деградации нонсенс-транскрипта, перед выделением мРНК клеточные культуры должны быть обработаны циклогексимидом, в присутствии которого происходит стабилизация нонсенс-транскрипта мРНК. В противном случае при секвенировании фрагментов кДНК с обнаруженной потерей гетерозиготности, включающих область геномной мутации, определяется последовательность только нормального аллеля, а мутация не выявляется.

По данным ряда исследований, в некоторых случаях при выявлении «нулевых аллелей» обнаружить мутацию не удается [Wenstrup RJ, 2000].

Таким образом, метод поиска гаплонедостаточности в гене COL5A1, по данным разных исследований, на сегодняшний день является наиболее эффективным методом определения генетической причины заболевания среди других известных молекулярно-генетических методов у пациентов с КТ СЭД.

Анализ внутриэкзонных полиморфизмов в образцах ДНК.

Первый этап молекулярно-генетического исследования гена COL5A1 заключался в анализе однонуклеотидных полиморфизмов в гене COL5A1 в образцах ДНК пациентов с целью определения гетерозиготного состояния по исследуемому маркеру в генотипе каждого пациента.

Критериями выбора полиморфизмов, помимо локализации в кодирующей части гена, были информативность (гетерозиготность) и расположение как 5', так и 3'- области гена. Праймеры для исследования ДНК выбирались как в экзонной, так и в интронной последовательностях, а для кДНК - только в экзонной части гена (Рис.4).

Для анализа были выбраны 6 полиморфизмов: C1120T (rs3124299), меняющий сайт узнавания для рестриктазы PstI в экзоне 5; G4504А (rs3827848), меняющий сайт узнавания для рестриктазы AsuHPI в экзоне 52; G4864C (rs3811146), меняющий сайт узнавания для рестриктазы Bsc4I в экзоне 58; С5652Т (rs2229817), меняющий сайт узнавания для рестриктазы StyI в экзоне 65; T5982C (rs13946), меняющий сайт узнавания для рестриктазы BstENII в экзоне 66 (в 3'-нетранслируемой области, 3'-UTR) и T6166C (rs12722), меняющий сайт узнавания для рестриктазы BstUI в экзоне 66 (в 3'-UTR). Идентификационные номера SNP приводятся в соответствии с базой SNP, а номера нуклеотидов - в соответствии с референсной последовательностью мРНК гена COL5A1 NM_000093. Для системы выявления «нулевых аллелей» в итоге были выбраны 3 полиморфизма, которые оказались наиболее информативными - C1120T, G4864C и T5982C.

В образцах геномной ДНК из 31 пациента 13 (42%) были гетерозиготны по полиморфизму C1120T (PstI) в экзоне 5, 18 (58%) были гетерозиготны по полиморфизму G4864C (Bsc4I) в экзоне 58 и 14 (45%) были гетерозиготны по полиморфизму T5982C (BstENII) в экзоне 66. Таким образом, 26 из 31 пациента (84%) были информативны по одному или нескольким полиморфизмам (Рис.5).

Рис. 4.

Схема полиморфных маркеров и амплифицируемых фрагментов для ДНК и кДНК при поиске гаплонедостаточности в гене COL5A1.

Рис.5.

Пример определения информативности внутриэкзонного маркера в гене COL5A1 в образцах ДНК при исследовании полиморфизма G4864C (Bsc4I) в экзоне 58.

M - маркер молекулярного веса - ДНК фага л, обработанная эндонуклеазой PstI. 1, 2 - фрагменты ДНК пациентов до обработки эндонуклеазой рестрикции Bsc4I (длина 142 п.н.). После обработки фрагмента кДНК эндонуклеазой рестрикции Bsc4I возможно образование фрагментов длиной 126+16 п.н.(С-аллель) или сохранение фрагмента 142 п.н. (G-аллель). У пациентов P2, Р4, Р6, Р9 выявлено гетерозиготное состояние гена COL5A1 по полиморфному маркеру G4864C.

Анализ информативных внутриэкзонных полиморфизмов в образцах кДНК

Количество экспрессируемых аллелей гена COL5A1 в образцах кДНК определяли по тем полиморфным маркерам, которые оказались информативными при исследовании ДНК данного больного.

При исследовании образцов кДНК по маркеру G4864C была обнаружена полная потеря гетерозиготности у четырех пациентов - Р9, Р11, Р12 и Р12.1, а также частичная потеря гетерозиготности у Р21.

По маркеру C1120T выявлена частичная потеря гетерозиготности у Р21 (так же, как и по маркеру G4864C). По маркеру T5982C выявлена полная потеря гетерозиготности у Р12 (так же, как и по маркеру G4864C). (Рис.6).

Рис.6.

Потеря гетерозиготности гена COL5A1 в кДНК при исследовании полиморфного маркера G4864C (Bsc4I) в экзоне 58.

M - маркер молекулярного веса - ДНК фага л, обработанная эндонуклеазой PstI. 52F58R - фрагмент кДНК одного из пациентов до обработки эндонуклеазой рестрикции Bsc4I (длина 404 п.н.). После обработки фрагмента кДНК эндонуклеазой рестрикции Bsc4I образуются фрагменты длиной 20+165+84+135 п.н.(G-аллель) и 20+165+84+16+119 п.н. (С-аллель) (следует обратить внимание на фрагменты длиной 135 и 119 п.н.). У пациентов P12.1, Р12 , Р11 и Р9 отмечена потеря С-аллеля, у пациентки Р21 - частичная потеря G-аллеля.

Таким образом, из трех маркеров наиболее информативным при выявлении потери гетерозиготности оказался маркер G4864C (Bsc4I) в экзоне 58.

Следует особо отметить результаты, полученые у P9. В отличие от остальных пациентов, из трех информативных маркеров - C1120T, G4864C и T5982C - потеря гетерозиготности в образце кДНК этой больной была обнаружена только для маркера G4864C, расположенного в экзоне 58, а при исследовании маркеров, расположенных в экзонах 5 и 66, гетерозиготность в образце кДНК была сохранена. Можно предположить, что изменения структуры ДНК таковы, что при процессинге мРНК теряется участок, содержащий полиморфизм G4864C в экзоне 58, но не происходит образования преждевременного стоп-кодона, и, следовательно, элиминации транскриптов с этой копии гена механизмом NMD.

Гено-фенотипические корреляции у пациентов с выявленной гаплонедостаточностью.

В результате проведенного нами молекулярно-генетического исследования гена COL5A1 полная или частичная потеря гетерозиготности (гаплонедостаточность) в образцах кДНК была обнаружена у 5 пациентов (из них - 4 пробанда и 1 родственник). Клинические характеристики этих пациентов представлены в таблице 3.

Среди пациентов с выявленной гаплонедостаточностью больные Р11, Р12, Р12.1 и Р21 имели клинический диагноз «тяжелый вариант (I) КТ СЭД. Эти случаи были семейные, с аутосомно-доминантным типом наследования. У пациентки Р9 был определен смешанный фенотип СЭД, в симптоматике заболевания преобладали сердечная патология, скелетные изменения и глазная патология при умеренно выраженных изменениях кожи и суставов. В данном случае семейный анамнез не выявил родственников со сходными клиническими проявлениями (при осмотре матери специфической для СЭД патологии не выявлено, обследование других родственников провести было невозможно).

Таблица 3.

Клинические характеристики пациентов, у которых была выявлена

гаплонедостаточность гена COL5A1.

№ семьи	Пациент, пол и возраст (лет)	Гиперрастяжимость кожи	Бархатистость кожи	Атрофичные рубцы	Подкожные псевдоопухоли	Гипермобильность суставов (баллы по шкале Бейгтона)	Другие симптомы
9	Р9 Ж/16	+/-	-	-	-	6	Вывих локтевого сустава, нефроптоз, пролапсы сердечных клапанов, сколиоз, воронкообразная деформация грудины (оперированная), кровоточивость, косоглазие, миопия
11	P11 Ж/37	+	-	+	-	9	Кровоточивость, кифосколиоз, плоскостопие, воронкообразная деформация грудины, пролапс митрального клапана, варикозное расширение вен, артралгии, недостаточность шейки матки, подкожные узелки, эпикант
12	P12 M/16	+	+	+	+	7	Артралгии, нефроптоз, сколиоз, плоскостопие, воронкообразная деформация грудины, пролапс митрального клапана, мышечная гипотония, повышенная утомляемость
	Р12.1 Ж/45	+	+	+	+	9	Вывихи голеностопных и плюсневых суставов, плоскостопие, остеохондроз, артрозы
21	P21 Ж/38	+	+	+	-	9	Вывихи коленных суставов, артралгии, сколиоз, плоско-вальгусная деформация стоп, варикозное расширение вен, пролапсы сердечных клапанов, нефроптоз, сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит

При сравнении частоты встречаемости различных признаков среди всех больных и больных с тяжелым вариантом КТ СЭД можно отметить, что при тяжелом варианте КТ СЭД у всех пациентов присутствовали гиперрастяжимость кожи, множественные атрофичные рубцы и гипермобильность суставов, причем в 10 из 11 случаев она составляла 9 баллов по шкале Бейгтона. Подкожные псевдоопухоли и выраженная хрупкость кожи отмечались не у всех пациентов с тяжелым КТ СЭД, но при этом встречались только у пациентов с этим диагнозом среди всей группы больных. У 10 из 11 больных с тяжелым КТ СЭД отмечалась бархатистость (необычная мягкость) кожи, а также склонность к легкому возникновению экхимозов (таблица 4).

Таблица 4.

Сравнение частот встречаемости различных жалоб и признаков в группе всех больных и в группе пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД.

Исследуемый признак	Частота встречаемости признака (число случаев/% от N)
	Больные N=86	Больные с тяжелым вариантом КТ СЭД N=11
Гиперрастяжимость кожи	12(14,1%)	11(100%)
Умеренно повышенная растяжимость кожи	37(43,5%)	-
Множественные атрофичные рубцы	26(30,6%)	11(100%)
Единичные атрофичные рубцы	4(4,7%)	-
Длительное заживление ран	23(27,1%)	5(45,5%)
Бархатистость кожи	21(24,7%)	10(90,9%)
Подкожные узелки	13(15,3%)	6(54,5%)
Подкожные псевдоопухоли	6(7,1%)	6(54,5%)
Тонкая, прозрачная кожа	14(16,5%)	7(63,6%)
Выраженная хрупкость кожи (рвущаяся кожа)	2(2,4%)	2(18,2%)
Гипермобильность суставов (6 баллов и более)	40(47,1%)	11(100%)
Вывихи, подвывихи	25(29,4%)	6(54,5%)
Хронические артралгии	33(38,8%)	8(72,7%)
Грыжи	20(23,5%)	-
Опущение внутренних органов	27(31,8%)	2(18,2%)
Пролапс митрального клапана	55(64,7%)	7(63,6%)
Пролапсы других клапанов сердца	3(3,5%)	1(9,1%)
Другая сердечно-сосудистая патология	32(37,6%)	2(18,2%)
Кровотечения носовые/десенные	35(41,2%)	2(18,2%)
Легкое возникновение экхимозов	49(57,6%)	10(90,9%)
Миопия	26(30,6%)	2(18,2%)

Особое внимание следует обратить на тот факт, что среди всех обследованных нами пробандов было 7 пациентов с тяжелым вариантом КТ СЭД. При этом 1 пациент при исследовании гена COL5A1 не имел информативных маркеров в образце ДНК, а среди 6 остальных гаплонедостаточность гена COL5A1 была нами обнаружена у 3-х больных. Небольшое количество анализируемых случаев тяжелого варианта КТ СЭД не позволяют делать статистически достоверных выводов, однако выявление гаплонедостаточности в гене СOL5A1 у 3 среди 6 информативных пациентов соответствует данным зарубежных исследований о максимальной частоте ее выявления при КТ СЭД, оцениваемой в 50% [Schwarze U., 2000]. Мы полагаем, что эти данные оправдывают наше мнение о целесообразности клинического разделения тяжелого и умеренного вариантов КТ СЭД, существовавшего ранее, в предпоследней из классификаций СЭД. Это мнение разделяют и другие исследователи [Byers P., 2003].

В то же время у большинства пациентов с клиническим диагнозом «СЭД» отмечаются признаки умеренного варианта КТ СЭД, который наиболее сложен для дифференциальной диагностики. Вероятно, «умеренный вариант КТ СЭД» представляет собой гетерогенную группу заболеваний. Это подтверждает тот факт, что уже на сегодняшний день при исследованиях в группах пациентов с клиническим диагнозом «КТ СЭД» на основании выявленных молекулярно-генетических изменений и тщательного анализа соответствующего им фенотипа выделены две отдельных формы - классический тип СЭД с тяжелым поражением сердечных клапанов (мутации в генах COL1A1 и COL1A2) [[Schwarze U., 2004] и синдром, напоминающий классический тип СЭД, связанный с дефицитом тенасцина Х (мутации в гене TNXB) [Schalkwijk, J., 2001].

Особо следует отметить, что в отечественной практике существует клиническая гипердиагностика СЭД. В нашем исследовании среди 56 пробандов, направленных с предварительным диагнозом «СЭД», у 30 из них не было симптомов, патогномоничных для какого-либо из типов СЭД. В большинстве таких случаев присутствовали признаки ДСТ, которые действительно могут встречаться при СЭД, но являются только дополнительными диагностическими критериями (например, сколиоз, плоскостопие, пролапс митрального клапана, миопия).

Таким образом, небольшой процент выявления гаплонедостаточности гена COL5A1 в нашей выборке больных с КТ СЭД мы объясняем, прежде всего, неоднократно продемонстрированной ранее гетерогенностью заболевания и клинической гипердиагностикой КТ СЭД в группе пациентов с умеренным типом КТ СЭД.

ВЫВОДЫ

Предложенная схема клинического обследования пациентов с подозрением на СЭД с использованием специальной карты и компьютерной базы данных позволяет стандартизировать клиническое обследование, провести дифференциальную диагностику между типами СЭД и избежать гипердиагностики.

Поиск точковых мутаций в гене COL5A2 при классическом типе СЭД является малоинформативным методом.

Разработана система регистрации потери гетерозиготности (гаплонедостаточности) в гене COL5A1 как метод молекулярно-генетической диагностики КТ СЭД. При использовании трех внутриэкзонных полиморфизмов (C1120T, G4864C и T5982C) общая информативность системы составила 84%. Потеря гетерозиготности была выявлена у 5 пациентов из 4 семей.

Наибольшая информативность метода выявления потери гетерозиготности в гене COL5A1 наблюдается в группе больных с тяжелым вариантом КТ СЭД (в 3 из 6 информативных случаев), характеризующимся выраженной гипермобильностью суставов, гиперрастяжимостью кожи, наличием тонной, бархатистой кожи, множественных атрофичных рубцов и подкожных псевдоопухолей.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

Блинникова О.Е., Курникова М.А., Мутовин Г.Р. «Современные представления о синдроме Элерса-Данлоса. Значение молекулярно-генетических исследований (обзор литературы)»// Альманах «Исцеление», вып.5, «Тривола».- Москва. - 2001.- С.154-156

Курникова М.А., Семячкина А.Н., Тверская С.М., Поляков А.В., Блинникова О.Е., Мутовин Г.Р. «Клиническое и молекулярно-генетическое исследование классического типа синдрома Элерса-Данлоса»// Тез.докл.I Всероссийского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии».- Москва.-2002.- С.126-127

Курникова М.А., Блинникова О.Е., Мутовин Г.Р., Семячкина А.Н., Тверская С.М., Поляков А.В. «Современные представления о синдроме Элерса-Данлоса»// Медицинская генетика. - 2004.-Т.3, №1. - С.10-17.

Курникова М.А., Блинникова О.Е., Мутовин Г.Р., Семячкина А.Н., Терехов С.М., Тверская С.М., Поляков А.В. «Гаплонедостаточность гена COL5A1 у пациентов с классическим типом синдрома Элерса-Данлоса»// Медицинская генетика. - 2006.-№5(47). - С.25-31.

Курникова М.А., Семячкина А.Н., Тверская С.М., Поляков А.В., Мутовин Г.Р. «Выявление гаплонедостаточности гена COL5A1 среди пациентов с классическим типом синдрома Элерса-Данлоса»// V Всероссийский конгресс «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии»: сборник материалов конгресса. - Москва.-2006.- С.59-60

Курникова М.А., Тверская С.М., Поляков А.В. «Деградация мРНК, содержащей преждевременные стоп-кодоны: механизм, биологическая значимость и медико-генетические аспекты»// Медицинская генетика.-2006.-Т.5, прил.1.- С.44-53

Kournikova M., Blinnikova O., Semyachkina A., Mutovin G., Tverskaya S., Polyakov A. “Clinical and molecular genetic investigation of the classic type of Ehlers-Danlos syndrome in Russia”// Europ J of Hum Genet. - Vol10, suppl 1.- Abst. Annual meeting of the European Society of Hum.Genet.-Strasbourg.-2002.-P.126

Kournikova M., Blinnikova O., Mutovin G., Semyachkina A., Tverskaya S., Polyakov A. “COL5A1 haploinsufficiency in a patient with the classical form of Ehlers-Danlos syndrome”// Europ J of Hum Genet. - Vol11, suppl 1.- Abst. Annual meeting of the European Society of Hum.Genet.-Birmingham.-2003.-P.97

Kournikova M., Blinnikova O., Semyachkina A., Mutovin G., Tverskaya S., Polyakov A. “COL5A1 haploinsufficiency in Russian patients with classic Ehlers-Danlos syndrome”//Europ J of Hum Genet. - Vol14, suppl 1.- Abst. Annual meeting of the European Society of Hum.Genet.-Amsterdam.-2006.-P.248

Размещено на Allbest.ru

...