Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Структурно-функциональные отношения трифенилэтиленов

и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы

Максимов Филипп Евгеньевич

Москва - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук,

профессор Терентьев Александр Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Шимановский Николай Львович

доктор медицинских наук,

профессор Шевченко Ольга Павловна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва

Защита состоится «24» мая 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «7» апреля 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор П.Х Джанашия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

По данным ВОЗ онкологические заболевания это ведущая причина всех смертей во всем мире, где рак молочной железы это самое распространенное онкологическое заболевание у женщин во всем мире (519,000 смертей в 2004 году) и пятая самая распространенная причина смерти от онкологических заболеваний в общей популяции. Этиология этого заболевания до сих пор изучается, но множественные исследования показали, что эстрогены играют важную роль в развитии этого заболевания (Russo и Russo, 1998). Биологические эффекты эстрогенов опосредованны через эстрогеновые рецепторы альфа (ЭРб) и бета (ЭРв), которые эскпрессируются в более чем 80% всех диагносцируемых опухолей молочной железы. ЭРб в данный момент остается основной мишенью в терапии рака молочной железы, а так же уровень его экспрессии используется для прогнозирования эффективности лечения селективными модуляторами ЭР (Selective Estrogen Receptor Modulators или SERM), такими как тамоксифен (EBCTCG, 1998; EBCTCG, 2005). Тамоксифен является первым хемиотерапевтическим препаратом, который предотвращает туморогенез ЭР-положительных опухолей (Jordan, 2008) у женщин входящих в группу риска по данному заболеванию по всему миру (Fisher и другие, 1998). Тамоксифен сам по себе является видоизмененной производной долгодействующего эстрогеноподобного вещества трифенилэтилена (Robson, 1937; Harper и Walpole, 1966; Harper и Walpole, 1967). Эффективность тамоксифена зависит от образования клинически активного метаболита 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена, которые в свою очередь обладают более высоким сродством к ЭРб и обладают более выраженными антиэстрогеновыми свойствами в клетках рака молочной железы (Jordan и другие, 1977; Johnson и другие, 2004). Сейчас не известны точные преобразования, которым подвергается ЭР после образования комплекса с эстрогенами, поскольку весь комплекс рецептора с лигандом не был до сих пор кристаллизован, таким образом недостаток знаний в этой области компенсируется изучением структурно-функциональных отношений ЭР и его лигандов. Тем не менее, сам лиганд-связывающий домен (ЛСД) ЭР, ассоциированный с 17в-эстрадиолом (Е2) и диетистилбестролом (DES) и SERM 4-гидрокситамоксифеном и ралоксифеном были кристаллизованны. Подробный рентгеноструктурный анализ конформационных изменений ЛСД ЭР выявил определенную разницу в конформациях ЛСД ЭР ассоциированного с 4-гидрокситамоксифеном и ралоксифеном по сравнению с ЛСД ЭР связанного с Е2 и DES (Brzozowski и другие, 1997; Shiau и другие, 1998). Поскольку в ходе исследований с тамоксифеном было выявленно, что тамоксифен в ряде тканей обладает слабыми эстрогеноподобными свойствами, то результаты более подробных исследований данного феномена позволили предположить что это свойство связано с взаимодействием боковой цепи (алкиламиноэтокси группы) тамоксифена с аспартатом в 351 позиции и переориентирование данного аминокислотного отстатка в рецепторе позволяет аспартату взаимодействовать с функциональным лиганд-независимым доменом ЭР AF-1, что и обеспечивает эстрогеноподобное действие тамоксифена (Levenson и Jordan, 1998; Levenson и другие, 1998). Поскольку, как ранее было показано, тамоксифен является производным трифенилэтилена, то было сделано предположение, что не все эстрогены одинаково взаимодействуют с ЭРб (Jordan и другие, 2001). Планарные вещества (такие как эстрадиол) и непланарные (такие как трифенилэтилен) являются эстрогенами и могут вызывать увеличение массы матки у грызунов, а так же вызывать ороговение вагинальной слизистой в кастрированных жиывотных, хотя непланарные эстрогены вызывают антагонистическую конформацию ЭР. Таким образом, эстрогены были классифицированны на основе их химической структуры на эстрогены класса I и класса II (Gust и другие, 2001; Jordan и другие, 2001). Несмотря на определеную разницу в конформационных изменениях ЭР, ассоцииированных с различными классами эстрогенов, до сих пор в полной мере не известны связанные с ними биологические эффекты, такие как рост клеток, апоптоз, активация транскрипции эстроген-зависимых генов и ее регуляция.

Цель настоящего исследования

Целью настоящего исследования является проверка гипотезы о том, что конформация ЭРб, которая зависит от структуры эстрогенов двух разных классов, играет роль в регуляции ряда биологических процессов (клеточная пролиферация, апоптоз и т.д.) в уникальных культурах клеток рака молочной железы человека in vitro.

Задачи настоящего исследования:

1. Определить биологическую активность (пролиферация клеток, апоптоз и т.д.) непланарных эстрогенов (серии синтезированных гидроксилированных трифенилэтиленов) по сравнению с планарными эстрогенами (17в-эстрадиол и диэтилстилбестрол) на клонах клеток линии рака молочной железы человека MCF7 in vitro.

2. Подтвердить явление и уровень апоптоза при обработке эстроген-независимых клонов клеток рака молочной человека MCF7:5C in vitro исследуемыми трифенилэтиленами по сравнению с планарными эстрогенами.

3. Определить опосредованность действия исследуемых веществ через ЭРб в клонах клеток линии рака молочной железы человека MCF7:WS8 и MCF-7:5C in vitro.

4. Определить механизм активации ЭРб эстрогенами класса I и класса II при помощи репортерных тестов с мутантной формой ЭР в ЭР-отрицательной линии клеток рака молочной железы человека T47D:C4 in vitro.

5. Определить регуляцию транскрипционной активности ЭРб (индукцию транскрипции мРНК и протеосомальной деградации) испытуемыми трифенилэтиленами по сравнению с планарными эстрогенами в клонах линии клеток рака молочной железы человека MCF7 in vitro.

6. Подтвердить гипотезу об изменении конформации лиганд-связывающего домена ЭРб исследуемыми трифенилэтиленами при помощи молекулярного докинга.

Научная новизна

В ходе настоящего исследования было проведено структурно-функциональное исследование синтезированных производных трифенилэтилена (некоторые из них синтезированны впервые) на уникальных клеточных линиях рака молочной железы человека in vitro.

В ходе данного исследования была показана эстрогеноподобная активность в клетках рака молочной железы с диким фенотипом, а так же впервые была показана невозможность исследуемых трифенилэтиленов индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз эквивалентный апоптозу индуцируемому эстрадиолом в клетках рака молочной железы с эстроген-независимым фенотипом, что впервые указывает на зависимость данного феномена от структуры лигнда и, как следствие, конформации рецептора.

Была подтверждена гипотеза о механизме активации ЭР в клетках рака молочной железы экспрессирующих мутантный типа ЭР, при помощи репортерных тестов. Были определны амикислотные остатки лиганд связывающего домена ЭР, критичные для активации рецептора трифенилэтиленами. Наиболее значимым результатом является выявление критичности наличия аспартата в 351 позиции на ЭР для активации рецептора трифенилэтиленами.

Впервые был проведен молекулярный докинг моделей структур исследуемых веществ в модели известных конформаций рецептора, в ходе которого были определены анинокислотные остатки, образующие с лигандами образуют водородные связи, и вероятные конформации, придаваемые трифенилэтиленами рецептору после связывания.

Впервые было показано, что, несмотря на измененную конформацию ЭР при связывании трифенилэтиленов, ЭР способен выполять свою транскрипционную функцию на промоторах эндогенных эстроген-зависимых генов (на примере pS2) в клетках рака молочной железы.

На основе полученных данных, были подтверждены выдвинутые гипотезы о регуляции транскрипционной активности ЭР в клетках при измененной конформации последнего и измененном механизме активации. Так было показано, что ЭР с измененной конформацией после связывания с трифенилэтиленами не способен эффективно деградировать и присоединять коактиватьрные молекулы (на примере SRC3).

Практическая значимость работы

Полученные данные ставят задачу по проведению клинических исследований о возможности применения эстрогена (17в-эстрадиола) для лечения резистентных ко всем видам адъювантной терапии форм рака молочной железы. Применение производных трифенилэтилена для лечения таких форм рака было бы актуальным в силу менее выраженных системных побочных эффектов в ходе применения таких веществ для лечения. Ранее производные трифенилэтиленов уже исследовались в качестве противоопухолевых препаратов для лечения рака молочной железы в поздних стадиях развития. Обнаружилось, что хотя и был положительный терапевтический эффект от применения таких веществ и были менее выраженны побочные эффекты, данные вещества уступали в своей терапевтической эффективности планарным эстрогенам эстрадиолу и DES. Развитие новых клеточных моделей для симуляции резистентности рака молочной железы к современным формам адъювантной терапии позволило нам оценить возможность применения производных трифенилэтилена для индукции апоптоза в таких клетках. Результаты показали, что данные вещества не индуцируют апоптоз эффективно и обладают меньшим сродством к ЭР, что ставит под сомнение потенциальное развитие хемиотерапевтических препаратов на основе трифенилэтиленов для лечения таких резиситентных форм рака за счет их эстрогеноподобных свойств.

Но стоит отметить, что результаты настоящего исследования могут в дальнейшем прояснить механизмы формирования резистентности к лечению рака молочной железы тамоксифеном, так как и тамоксифен является производной трифенилэтилена.

Положения выносимые на защиту

Гидроксилированные производные трифенилэтилена, изучаемые в данном исследовании, являются агонистами ЭР в клетках рака молочной железы с диким фенотипом, но являются антагонистами в клетках рака молочной железы резистентных к тамоксифену и с эстроген-независимым фенотипом.

Исследуемые производные трифенилэтилена не способны индуцировать увеличение уровней проапоптотических маркеров в клетках с эстроген-независимым фенотипом, несмотря на способность трифенилэтиленов активировать ЭР в этих клетках так же эффективно как и в клетках с диким фенотипом.

Для активации ЭР трифенилэтиленами необходимо взаимодействие с 351 амикислотным остатком в рецепторе, так как именно эта аминокислота участвует в активации рецептора не планарными эстрогенами.

Образование комплекса трифенилэтиленов с ЭР приводит к конформационным изменениям рецептора больше напоминающих его антагонистическую конформацию.

За счет измененной конформации ЭР, рецептор активированный трифенилэтиленами способен выполнять свою функцию как транскрипционный фактор, но не способен присоединять таке же количество коактиваторных белков как в случае с эстрадиолом.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на русском языке, на 103 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 195 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 1 таблицой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Матриалы и методы исследований

Исследуемые гидроксилированные производные трифенилэтилена синтезированны были in situ в Фокс Чейзовском Онкологическом Центре (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA). Всего было синтезированно для настоящего исследования пять производных трифенилэтилена (Рис.1): 1) 1,1,2-Трис(4-гидроскифенил)бут-1-ен (далее тригидрокситрифенилэтилен); 2) 1,1-Бис(4,4'-гидроксифенил)-2-фенилбут-1-ен (далее бисфенолтифенилэтилен); 3,4) Цис/Транс-4-(1-(4-гидроксифенил)-1-фенилбут-1-ен-2-ил)фенол (далее цис/транс-дигидрокситрифенилэтилен); и 5) Цис-4-(1-(4-этоксифенил)-1-(4-гидроксифенил)бут-1-ен-2-ил)фенол (далее этокситрифенилэтилен). Все синтезированные вещества имели чистоту не менее 80% и были синтезированны в объемах 80-120 мг. Чистота всех синтезированных веществ была проверена при помощи высоко продуктивной жидкостной хроматографии (HPLC).

Рис.1 Химические структуры веществ исследуемых в настоящей работе

ЭР-положительные клетки рака молочной железы человека MCF-7:WS8 были выведены по признаку гиперчувствительности к эстрогенам из клеток рака молочной железы дикого типа MCF7, которые были полученны из коллекции ATCC. Эстрадиол индуцирует рост данных клеток. Клетки MCF-7:5C были клонированны из клеток линии MCF-7 дикого типа путем долговременного эстрогенового голодания и содержались в безстероидной стреде RPMI 1640, без содержания pH индикатора фенол-красного, но с содержанием 10% очищенной активированным углем от эндогенных эстрогенов фетальной бычьей сыворотки. Гормон-независимые, ЭР-отрицательные клетки T47D:C4:2 были клонированны из клонов T47D:C4, которые, в свою очередь, были клонированны при помощи эстрогенового голодания из T47D клеток рака молочной железы, полученных из коллекции ATCC. Клетки T47D:C4:2 культивировались в безстероидной среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку очищенную активированным углем. Клетки линиий MC2 и 538A были полученны путем стабильной трансфекции ЭР-отрицательных клеток рака молочной железы человека линии MDA-MB-231 векторами для стабильной экспрессии ЭРб дикого типа и ЭРб с заменой D538A, соответственно. Клетки линии MC2 и 538A культивировались в среде МЕМ без содержания pH индикатора фенол-красного, но с содержанием 5% фетальной бычьей сыворотки очищенной активированным углем.

Для определения клеточной пролиферации при обработке клеток исследуемыми веществами в течение недели использовался метод обпределения количества ДНК в культурах клеток. Все вещества разводились в безстероидной среде по методу серийных разведений и добавляли к клеткам рассеяных в 24-луночных плашках. Определение количества ДНК проводилось при помощи флуоресцентного ДНК-интеркалирующего красителя Hoechst 33258 (входящего в состав набора для определения содержания ДНК от Bio-Rad), а так же при помощи флуориметра Mirthas LB540 (Berthold Technologies).

Для количественно-качественного анализа эстроген-индуцированного апоптоза в эстроген-независимых клетках рака молочной железы MCF-7:5C мы использовали набор ApoPecentage apoptosis detection kit (Biocolor). Данный набор позволяет количественно определить апоптоз в культуре клеток непосредственно на культуральной подложке без отделения от последней. Данаый набор нам позволил определить апоптоз и количественно зарегистрировать колориметрическим методом прямо в культуре клеток. Обработка клеток исследуемыми веществами проводилась в течение 4 суток, в качестве положительного контроля использовалась обработка клеток той же линии пероксидом водорода в концентрации 5 мМ в течении 4 часов. На четвертые сутки после начала обработки культур веществами, клеткам заменялась питательная среда на среду, содержащую специфический апоптотический краситель ApoPercentage Dye, работа которого основывается на феномене транслокации фосфатидилсерина цитолазматической мембраны с внутренней стороны мембраны на наружную, что соответствует раннему апоптотическому ответу клеток. Эта транслокация фосфатидилсерина, т.н. “flip-flop” эффект, изменяет проницаемость цитоплазматической мембраны апоптотических клеток и специфически позволяет красителю ApoPercentage Dye войти в апоптотические клетки и окрасить их относительно здоровых жизнеспособных клеток. Далее краситель высвобождался из клеток лизирующим раствором и измерялась оптическая плотность образцов при 550 нм на флуориметре/спектрофотомтере Mirthas LB540.

Для определения уровней активации ЭР исследуемыми веществами применялся метод репортерных тестов. Репортерный ген люциферазы находился под кнтролеи промотора, содержащего пятикратную последовательность эстроген-респонсивного элемента (ЭРЭ), к которому присоединяется активированный ЭР. Для экспрессии репортерного гена клетки транфицировались векторами pERE(5X)TA-ffLuc для экспрессии репортерного гена и pTA-srLuc для контроля трансфекции. Уровень активности люциферазы в клетках, обработанных исследуемыми веществами, указывает на уровень транскрипции репортерного гена и, соответственно, на уровень активации ЭР, который выполняет роль транскрипционного фактора. Клетки рассевались на 24-луночные плашки, после чего обрабатывались тестируемыми веществами в течение 24 часов. Для определения уровня активности люциферазы в клетках использовался набор Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Уровень флуоресценции субстратов люциферазы, определялся при помощи флуориметра Mirthas MB540. Для проведения аналогичных экспериментов на ЭР-отрицательных клетках линии T47D:C4:2, клетки трансфицировались дополнительно векторами pSG5HEGO для экспрессии ЭР дикого типа и вектором pSG5D351GER для экспрессии ЭР с заменой Асп351 на Гли. Эти эксперименты были необходимы для определения роли 351 а.о. для активации ЭР трифенилэтиленами.

Для определения уровней белков ЭР и про- и анти-апоптотических маркеров использовался метод иммуноблота. Иммуноблот проводился при помощи соответственных первичных антител против ЭРб, p53, Bad, Bax, Bcl-2, Bcl-XL, Bim (все от Santa Cruz), а так же против в-актина (Sigma-Aldrich) и соответствующих вторичных кроличьих антииммуноглобулиновых антител, коньюгированных с пероксидазой хрена (Santa Cruz). Сигнал визуализировался при помощи хемилюминисцентного метода с использованием набора ECL Western Blotting Detection Reagents (General Electrics).

Для определения уровня транскрипции эндогенного эстроген-респонсивного гена pS2 клетки инкубировались с разведенными в питательной среде исследуемыми веществами в течении 24 часов, после чего проводилось лизирование агентом Trizol (Invitrogen) и экстракция РНК хлороформом. Очистка РНК проводилась при помощи очистительных колонок входящих в набор Quiagen RNeasy Midi Column Kit (Quiagen), после чего проводился синтез кДНК с использованием рандомизированных праймеров. Уровень кДНК гена pS2 проводилось при помощи количественного ПЦР в реальном времени на амплификаторе от Applied Biosystems.

Для определения уровня белков ЭР и коативатора SRC3 привлекаемых на промоторный участок гена pS2 использовался метод иммунопреципитации хроматина. Для этого клетки обрабатывались исследуемыми веществами в течение 45 минут, после чего выделялся фиксированный формальдегидом хроматин. Преципитация ЭР и SRC3, ассоциированных с ДНК проводилась при помощи моноклональных антител против данных белков (все от Santa Cruz), и агарозных частиц, ассоциированных с белком G (Santa Cruz). Участки ДНК, копреципитированные с белками, очищались при помощи колонок, входящих в набор QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen). Количество преципитированной ДНК определялось при помощи ПЦР в реальном времени на амплификаторе от Applied Biosystems.

Для определения наиболее вероятных ориентаций исследуемых трифенилэтиленов в полости лиганд-связывающего домена ЭР, был проведен молекулярный докинг моделей всех трифенилэтиленов. Докинг проводился в известные модели ЛСД ЭР в агонистическокой (эстрадиол) и антагонистической (4-гидрокситамоксифен) конформации ЭР. Метод осуществлялся Др-м Рамоной Курпан из Химического Института при Академии Наук Румынии в рамках коллаборационного проекта.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для сравнения биологических активностей планарных эстрогенов (класса I) и непланарных эстрогенов (класса II) были выбраны 17в-эстрадиол (Е2 и DES для класса I) и все in situ синтезированные трифенилэтилены (для класса II). Для сравнения эстрогеноподобных свойств веществ использовались клетки линии MCF-7:WS8, которые обладают фенотипом дикого типа и были селектированны из клеток MCF-7 дикого типа по признаку высокой чувствительности к пролифератиным эффектам эстрогенов. Эффекты всех исследуемых трифенилэтиленов сравнивались с эффектами метаболитов тамоксифена 4-гидрокситамоксифеном и эндоксифеном, которые являются антиэстрогенами в связи с наличием алкиламиноэтокси боковой цепи. Клетки MCF-7:WS8 были чувствительны ко всем веществам особенно к E2, которые вызывали макимальную пролиферацию клеток при 1х10-11М (Рис. 1).

Все исследуемые трифенилэтилены являются выраженными агонистами и вызывают пролиферацию MCF-7:WS8 клеток, но, тем не менее, их агонистическая эффективность меньше по сравнвению с E2, значение концентрации 50% эффекта (EC50) которого 1х10-12М. Вещество этокситрифенилэтилен было синтезированно для репликации молекулы 4-гидрокситамоксифена или эндоксифена без алкильной группы. Этокситрифенилэтилен обладает менее выраженными эстрогеноподобными свойствами, чем остальные исследуемые трифенилэтилены, но, тем не менее, данное вещество является полным агонистом в наших опытах по определению пролиферативных эффектов. Метаболиты 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен фактически не имеют никаких агонистических эффектов в MCF-7:WS8 клетках, но оба эти вещества при концентрации 1 мкМ способны полностью ингибировать пролифератиный эффект эстрадиола в той же линии клеток, таким образом, подтверждая их роль как антагонистов/антиэстрогенов. Остальные тестированные трифенилэтилены не имели никаких антагонистических свойств в клетках данной линии.

Рис.2 Эффекты тестируемых трифенилэтиленов и антиэстрогенов 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена на пролиферацию клеток линии MCF-7:WS8 дикого фенотипа

рак пролиферация трифенилэтилен эстроген

Для определения способности тестируемых трифенилэтиленов вызывать эстроген-индуцированный апоптоз использовалась линия MCF-7:5C, которая была выведенна в результате долгосрочного (2 года) культивирования в безстероидной питательной среде, что привело к формированию эстроген-независимого фенотипа. Клетки, которые были жизнеспособны и пролиферировали в безстероидной среде были селектированы. Пародоксально, то, что вместо гиперсенсибилизации клеток к пролиферативным эффектам эстрогенов, данная линия клеток отвечает на обработку E2 и DES полной гибелью популяции клеток по типу апоптоза, а так же другими планарными эстрогенами класса I (Рис. 3). В отличие от чувствительности клеток MCF-7:WS8 линии с диким фенотипом, клетки линии MCF-7:5C оказались менее чувствительными к агонистическим эффектам трифенилэтиленов и проявили себя больше как антагонисты (Рис. 3).

Рис. 3 Эффекты тестируемых трифенилэтиленов и антиэстрогенов 4-гидрокситамоксифена и эндоксифена на пролиферацию клеток линии MCF-7:5С.

Планарные эстрогены E2 и DES оказались, как и предполагалось, самыми эффективными веществами, которые вызывали апоптотический эффект за счет своего агонизма с ЭР клеток, со значением концентрации 50% ингибирования пролиферативного эффекта (IC50) приблизительно 1х10-11М. Для исследования антагонистической эфективности тестируемых трифенилэтиленов были выбраны два самых эффективных агониста в MCF-7:WS8 клетках бисфенолтрифенилэтилен (2) и тригидрокситрифенилэтилен (1), а так же для сравнения самый мало эффективный агонист этокситрифенилэтилен (5). Исследуемые трифенилэтилены 1, 2 и 5 при концентрации в 1 мкМ эффективно способны ингибировать проапоптотический эффект Е2 и восстанавливать пролиферацию клеток на уровень приблизительный к контрольному. Это, парадоксально, делает исследуемые трифенилэтилены в данном опыте антагонистами ЭР (поскольку действие Е2 в клетках MCF-7:5C опосредованно через ЭР), при этом являясь агонистами в клетках с диким фенотипом.

Для количественно-качественного определения эстроген-индуцированного апоптоза, мы использовали метод калориметрического измерения уровня апоптоза в культурах клеток MCF-7:5C. Е2 при концентрации 1 нМ способен вызывать существенное увеличение количества апоптотических клеток по сравнению с контрольным необработанным образцом (почти в 5,5 раз), что утверждает эстрадиол как проапоптотический агент в клетках MCF-7:5C в эстроген-индуцируемом апоптозе. DES так же способен индуцировать апоптоз в данных клетках, но в меньшей степени (4 раза), по сравнению с Е2. Остальные трифенилэтилены способны вызывать апоптоз при концентрации 1 мМ в течении 4-х суток, но данные уровни апоптоза в среднем значительно меньше, что соответствует данным об их биологических активностях в ранее описанных опытах. Отдельно необходимо отметить бисфенолтрифенилэтилен, который является единственным эстрогеноподобным трифенилэтиленом, абсолютно не вызывающим апоптоз в клетках MCF-7:5C. В качестве отрицательного контроля использовался известный антиэстроген 4-гидрокситамоксифен, который так же как бисфенолтрифенилэтилен не вызывает апоптоза в клетках. Для установления разницы между способностью эстрогенов класса I и II (билфенолтрифенилэтилен, тригидрокситрифенилэтилен и этокситрифенилэтилен в концентрации 1 мМ) индуцировать апоптоз, мы проводили иммуноблоты при помощи специфичных антител против митохондриальных про- (Bim, Bad, Bax, Bak, p53) и анти-апоптотических маркеров (Bcl-Xl, Bcl-2), для того что бы оценить индукцию и соотношение каждого маркера относительно друг друга и оценки апоптотической эффективности. Клетки MCF-7:5C, обработанные Е2 в концентрации 1 нМ, индуцируют в течении первых 24 часов увеличение уровня экспрессии белков проапоптотических маркеров Bax, Bim, Bak, Bad и р53, а так же снижение уровня антиапоптотического маркера Bcl-Xl, что указывает на активацию апоптотических факторов внутри клеток и снижение активности экспрессии фактора выживаемости, что приводит к запуску сигнального каскада эстроген-индуцированного апоптоза.

Связывание ЭР, активированного лигандом, с ДНК на ЭРЭ увеличивает транскрипцию репортерного гена люциферазы. Измерение уровня экспрессии люциферазы в клетках позволяет судить об уровне агонистической активности комплекса ЭР:трифенилэтилен. Все тестируемые трифенилэтилены эстрогеноподобные, но Е2 и DES с 100 раз более эффективнее, чем даже самый эффективный трифенилэтилен бисфенолтрифенилэтилнен. Порядок эффективности активации ЭР в клетках MCF-7:WS8 следующий: Е2 > DES > бисфенолтрифенилэтилен > тригидрокситрифенилэтилен > цис/транс-дигидрокситрифенилэтилен > этокситрифенилэтилен > 4-гидрокситрифенилэтилен. Ни один из исселедуемых трифенилэтиленов не проявил никаких антиэстрогеновых свойств в данных опытах (Рис. 4).

Рис. 4 Определение уровня активности ЭРб при помощи репортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстроген респонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках

MCF-7:WS8 после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в течении 24 часов.

Для определения способности тестируемых трифенилэтиленов активировать ЭР в клетках линии MCF-7:5C, мы провели аналогичный, с вышеописанным экспериментом, опыт. Результаты данного опыта показали, что все эстрогены, вне зависимости от класса, способны так же, как и в клетках с диким фенотипом, активировать транскрипцию гена люциферазы.

Все эти результаты указывают на то, что данные вещества несмотря на их непланарную структуру спосбны активировать ЭР и вызывать активацию транскрипции генов, ответственных за инициацию эстроген-стимулированной пролиферации. Несмотря на то, что по результатам данных экспериментов, тестируемые трифенилэтилены вызывают пролиферативные эффекты в клетках с диким фенотипом при более высоких концентрациях чем планарные эстрогены, как 17в-эстрадиол и синтетический нестероидный эстроген диэтилстилбестрол (DES), трифенилэтилены способны связываться с ЭР, хотя, вероятнее всего с более низкой аффинностью. В отличии от тестируемых трифенилэтиленов, которые не обладают боковой аминоэтокси группой, метаболиты тамоксифена 4-гидрокситамоксифен и эндоксифен не способны активировать ЭР (по результатам репортерных тестов) и, следовательно, вызывать пролиферативный эффект (по результатам пролиферативных тестов). Пародоксально, но непланарные трифенилэтилены неспособны вызывать полной гибели клеток в течении 7 суток дяже при высокой концентрации в среде (1 мкМ). Только, два вещества были способны вызывать биологически существенный уровень апоптоза в культуре. Тригидрокситрифенилэтилен был способен зызывать в среднем 40-50% гибели клеток, в то время как транс-изомер дигидрокситрифенилэтилен был способен вызывать полную гибель клеток. Объяснить такую проапоптотическую активность транс-изомера дигидрокситрифенилэтилена можно только тем, что это вещество не имея 4-гидроксигруппы, как остальные трифенилэтилены, может связываться с ЛСД ЭР таким образом, что бы гидроксигруппа на противоположном фенильном кольце воспроизводила позицию гидрокси группы на эстрадиоле, таким образом, позиционируясь в полости ЛСД так, что второе фенильное кольцо не создает стерического препятствия для 12-ой б-спирали, позволяя ей закрыть полость ЛСД и связаться коактиваторам с ЭР и активировать его. Таким образом, данный трифенилэтилен может связываться с рецептором с достаточно высоким сродством, активировать его по пути сходным с этрадиол-опосредованным и вызывать апоптоз клеток. Так же возможна трансизомеризация, которая известна для тамоксифена, когда цис-изомер тамоксифена частично в растворе переходит в транс-изомер тамоксифена и перестает проявлять антиэстрогеновые свойства. Остальные вещества не способны были вызывать гибель клеток, что было показно в пролиферативных тестах и в опытах по определению уровня апоптоза в культуре клеток. Более того, данные трифенилэтилены способны выступать в роли антагонистов ЭР, ингибируя эстрадиол-индуцированный апоптоз клеток. При этом все трифенилэтилены, так же как и планарные эстрадиол и DES, способны активировать транскрипционную активность репортерного гена, а следовательно и активировать ЭР. Это может указывать, что исследуемые непланарные трифенилэтилены способны связываться в ЭР в данных клетках, ативировать его, как и в клетках дикого типа, но неспособны индуцировать гибель клеток, как это делают планарные эстрогены, которые являются агонистами ЭР в обеих линиях клеток.

Рис. 5 Определение уровня активности ЭРб при помощи репортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстроген респонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках MCF-7:5С после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в течении 24 часов.

Определение мехнизма активации ЭР в клетках нам было необходимо для объяснения роли измененной корформации ЭР в неспособности индуцировать апоптоз в эстрогеннезависимых клетках и некритичности данного конформационного изменения для индукции роста клеток дикого типа. Для этого мы использовали результаты молекулярного докинга и репортерных тестов с мутантной формой ЭР. Результаты молекулярного докинга показали, что все наши исследуемые трифенилэтилены лучше входят в модель антагонистической конформации ЭР и связываются лучше с рецептором орентируясь в ЛСД ЭР сходным образом с 4-гидрокситамоксифеном. В случае с агонистической конформацией ЭР, связывание трифенилэтиленов и образование водородных связей с аминокислотными остатками ЛСД, необходимых для подходящей ориентации лигандов в полости ЛСД, невозможно из-за стерических помех 12-ой б-спирали рецептора. Из этих результатов можно сделать вывод, что поскольку трифенилэтилены не могут войти в агонистическую конформацию ЭР из-за стерических помех, но входят в аналогичную антагонистической конформации рецептора с 4-гидрокситамоксифеном, то с наибольшей вероятностью все трифенилэтилены при связывании с ЭР придают последнему конформацию схожую с антагонистической конформацией ЭР, но тем не менее, способны активировать его, в отличии от 4-гидрокситамоксифена. Это было подтверждено при помощи молекулярного докинга. Анализ результатов молекулярного докинга проводился на основании наиболее вероятных ориентировок тестируемых трифенилэтиленов в ЛСД ЭР и сравнивался с ориентацией 4-гидрокситамоксифена. Конформации ЭР, ассоциированных с 4-гидрокситамоксифеном и эстрадиолом были полученны из базы данных PDB. RMSD (Raw Median Standart Deviation, значение которое отображает эфективность докинга двух молекул) для докинга 4-гидрокситамоксифена составила 0,55 Е, более того, низкое значение RMSD было получено так же в результате докинга тестируемых лигандов в ходе аналогичного позиционирования их моделей в ЛСД ЭР в антагонистической конформации (обозначена как 3ert в базе данных PDB), что показано на Рис. 6А. Все тестируемые трифенилэтилены способны образовывать такие же взаимодействия с аминокислотными остатками D351, E353, R394, T347 и H524, как и 4-гидрокситамоксифен. Самая большая разница в докинге трифенилэтиленов в сравнении с 4-гидрокситамоксифеном заключается в том, что боковая цепь последнего подвинута ближе к D351 и образует связь между амино группой тамоксифена и карбоксильной группой а.о. D351. Суперимпозиция моделей тестируемых трифенилэтиленов выявила то, что их ориентация в ЛСД ЭР очень схожа с той, что у 4-гидрокситамоксифена и, таким образом, позволяет образовывать взаимодействия с теми же аминокислотными остатками ЭР, что и тамоксифен. Для контроля подобное ориентирование молелей лигандов было проведено на агонистической модели ЭР (ЭР кристаллизованного с эстрадиолом, обозначен как 1GWR в базе данных PDB). Результаты такого докинга показало, что трифенилэтилены не могут уместиться в полость ЛСД из-за стерических препятстсвий между углеводными радикалами лейцинов Leu525, Leu540 на 12-ой б-спирали, как показано на Рис. 6Б. Это указывает на то, что трифенилэтилены наиболее вероятно будут вызывать антагонистическую конформацию ЭРб, сходную с той, которую образует 4-гидрокситамоксифен.

Рис. 6 Молекулярный докинг исследуемых трифенилэтиленов и модель лигандсвязывающего домена ЭР в А: антагонистической конформации и в Б: агонистической конформации.

Для поддтверждения гипотезы, что для активации ЭР трифенилэтиленам необходимо взаимодействие с 351 а.о. ЭР мы провели репортерные тесты на клетках транзиторно экспрессирующих дикий тип ЭР и мутантный тип с заменой Асп351 на глицин. репортерные тесты, результаты которых показали, что все вещества вне зависимости от класса способны активировать транскрипцию гена люциферазы, соответственно, способны активировать ЭР дикого типа (Рис. 7), в то время как только планарные эстрогены класса I способны активировать мутантный тип ЭР, т.к. не нуждаются во взаимодействии с 351 а.о (Рис. 8).

Для потверждения того, что все тестируемые трифенилэтилены не активируют мутантную форму ЭР не за счет того, что они просто не способны связываться с рецептором, а потому что не способны в ходе стерических нарушений рецептора его активировать, мы провели опыты с конкуренцией некоторых наиболее интересных трифенилэтиленов против Е2 за связывание с ЭР. Результаты показали, что все трифенилэтилены, в том чичсле и антиэстрогены способны ингибировать зстроген-стимулированную транскрипцию репортерного гена, при концентрации Е2 в 1 нМ. При более высокой концентрации в 10 нМ тестируемых трифенилэтиленов, последние способны фактически полностью ингибировать эстрадиол-стимулированную транскрипцию. Эти результаты указывают на то, что эстрогены класса II несмотря на то, что не способны активировать мутантную форму ЭР, способны с таким рецептором образовывать комплекс.

Рис. 7 Определение уровня активности ЭРб дикого типа при помощи репортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстроген респонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках T47D:C42 после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в течении 24 часов.

Для определения роли конформационных изменений ЭР в регуляции транскрипционной активности ЭР мы опирались на известные факты, что транскрипционная активность ЭР поддерживается за счет постоянного турновера белка ЭР. Турновер белка ЭР обеспечивается системой протеосомальной деградации белка. После активации ЭР лигандом и присоединения белков-коактиваторов, к этому комплексу присоединяются дополнительные коактиваторные молекулы, среди которых ДНК метилтрансфераза и ацетилтрансфераза, для изменения нуклеосомальной структуры ДНК, что позволяет ЭР присоединиться к ДНК, а так же и убиквитин-лигазы UbL и UbC, которые осуществляют убиквитинилирование белка ЭР.

Рис. 8 Определение уровня активности мутантной формы ЭРб с заменой аспартата на глицин в 351 позиции при помощи репортерного гена люцифенразы под промотором с пятикратным эстроген респонсивным элементом (ЭРЭ) в клетках T47D:C42 после обработки планарными эстрогенами Е2 и DES и тестируемыми трифенилэтиленами в течении 24 часов.

Для определения уровней деградации белка ЭР и характера этого процесса во времени мы провели эксперименты, в которых мы обрабатывали клетки линий MCF-7:WS8 и MCF-7:5C тестируемыми трифенилэтиленами: тригидрокситрифенилэтилен (1 нМ), бисфенолтрифенилэтилен (1нМ) и этокситрифенилэтилен (1 мкМ) в минимальных концентрациях, необходимых для индукции транскрипции репортерного гена, а так же планарным эстрадиолом в течении 24 часов. Результаты показали, что Е2 способен начинать деградацию ЭР уже начиная с 1 часа, после чего происходит фактически полная и стабильная деградация ЭР. В отличие от планарного эстрадиола, тестируемые трифенилэтилены, хоть и вызывают деградацию ЭР после 4-8 часов обработки клеток, но не способны эту деградацию вызывать стабильно, т.к. уровни белка ЭР в клетках возвращаются на уровень сходный с контрольным на 24 часовой отметке (Рис. 9). Отдельно стоит отметить бисфенолтрифенилэтилен, который способен вызывать деградацию белка ЭР в клетках только между 8 и 24 часами обработки, то есть значительно медленее, чем остальные трифенилэтилены. Для подтверждения того, что снижение уровней белка ЭР в клетках при обработке трифенилэтиленами это именно протеосомальная деградация, мы провели аналогичную обработки клеток MCF-7:WS8 и MCF-7:5C веществами индивидуально и в комбинации с ингибитором 26S протеосомы MG132 в течении 4 часов. В результате, как и ожидалось, все вещества в индивидуальном порядке вызвали деградацию белка ЭР, но в комбинации с протеосомным ингибитором, уровни ЭР остались на контрольном уровнях, что указывает на то, что именно протеосомальная деградация на 26S протеосоме является причиной снижения уровня белка ЭР в клетках (Рис.10).

Для опредеоления способности тестируемых трифенилэтиленов индуцировать транскрипцию эндогенных эстроген-респонсивных генов в MCF-7:WS8 и MCF-7:5C клетках, мы обработали последние всеми тестируемыми трифенилэтиленами (кроме бисфенолтрифенилэтилена), а так же Е2. Далее была собрана мРНК из каждого образца, после чего, на основе мРНК, была получена кДНК и проведен анализ при помощи количественного ПЦР в реальном времени. Результаты показали, что все анализируемые трифенилэтилены способны активировать транскрипцию эндогенного эстроген-зависимого гена pS2. Самым эффективнм эстрогеном по уровню индукции транскрипции мРНК гена pS2 является Е2 в концентрации 1 нМ, остальные трифенилэтилкены так же увеличивают уровень транскрипции, но не настолько существенно как Е2.

Рис. 9. Иммуноблоттинг лизатов клеток MCF-7:5С обработанных антителами против ЭРб и в-актина для контроля нагрузки. Клетки обрабатывались в течении 24 часов тестируемыми трифенилэтиленами и эстрадиолом в течении определенных периодов времени.

Для определения уровня привлечения белков ЭРб и коактиватора раецептора SRC-3 на промоторный участок гена pS2, что напрямую отражает транскрипционную функцию ЭР после активации эстрогенами разных классов, мы использовали метод хроматиновой иммунопреципитации. Результаты данной серии экспериментов показали, что Е2 явялется самым эффективным эстрогеном и имеет самое большое привлечение ЭР на промоторный участок гена pS2, а так же белка SRC-3. Тригидрокситрифенилэтилен и этокситрифенилэтилен так же способны привлечь ЭР на промотор гена, но в среднем на чуть меньшем уровне. Что касается коактиватора SRC-3, то пародоксально, исследуемые трифенилэтилены, так же как и антиэстроген 4-гидрокситамоксифен не привлекают детектируемое количество белка SRC-3. Антиэстроген 4-гидрокситамоксифен в концентрации 1мкМ способен привелчь некоторое количество ЭР на промотор гена, но то что данное вещество не способно инициировать транскрипцию с гена объсняется тем, что комплекс ЭР:4-гидрокситамоксифен присоединяет белки-корепрессоры, а не коактиваторы.

Рис. 10 Иммуноблоттинг лизатов клеток MCF-7:WS8 и MCF-7:5С, обработанных антителами против ЭРб и в-актина. Клетки обрабатывались в течении 4 часов тестируемыми трифенилэтиленами и эстрадиолом индивидуально, а так же в комбинации с ингибитором 26S протеосомы MG132.

В случае с трифенилэтиленами, ЭР, активированный такими непланарными эстрогенами, способен быть активным как транскрипционный фактор, но привлечение коактиваторов низкое, что может объяснить пониженную транскрипционную активность за счет сниженного уровня деградации белка ЭР протеосомальным комплексом. Подтвердением наших результатов, полученных при помощи ммунопреципитации хроматина могут служить результаты полученные, группой Леклерка из Бельгии (Bourgoin-Voillard и другие, 2009). Их группа обнаружила на другой in vitro модели, что ЭР ассоциированный с эстрогенами не планарными класса II не может образовывать комплекс с коактиваторными молекулами по причине конформационных изменений молекулы рецептора. В своих исследованиях они использовали вещество бисфенотрифенилэтилен и другие непланарные эстрогены, при связывании с которыми наблюдалось увеличение транскрипционной активности ЭР, а так же могли проявлять некоторые антагонистические свойства, подобные тем, которые обнаружили и мы. Бисфенолтрифенилэтилен в их исследованиях активировал ЭР, но рецептор не способен в этом случае присоединать коактиваторы (Bourgoin-Voillard и другие, 2009).

Все эти данные указывают, что изменение конформации ЭР при связывании с трифенилэтиленами не только лишает его способности индуцировать эстроген-индуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках, но и играет роль в регуляции стабильности белка ЭР, что, в свою очередь, изменяет механизм регуляции транскрипционной активности опосредованной ЭР.

Таким образом, в настоящей работе исследовалась роль конформационных изменений ЭР при связывании с непланарными эстрогенами. Непланарные эстрогены были представлены серией синтезированных нестероидных гидроксилированных производных трифенилэтилена. Биологические свойства данных непланарных эстрогенов класса II сравнивались с планарными эстрогенами класса I, такими как эстрадиол и DES. Для определения разницы в вероятных конформационных изменениях ЭР при связывании с эстрогенами различных классов мы применили метод виртуального докинга и показали, что конформационные изменения ЭР при связывании трифенилэтиленов вероятнее всего больше напоминают антагонистическую конформацию рецептора, придаваемую рецептору антиэстрогеном 4-гидрокситамоксифеном. Для определения биологической активности трифенилэтиленов по сравнению с эстрогенами класса I применялись пролиферативные тесты, с помошью которых мы показали, что все эстрогены, вне зависимости от класса, способны инициировать пролиферацию клеток рака молочной железы с диким фенотипом, но не все способны индуцировать эстроген-идуцированный апоптоз в эстроген-независимых клетках. При помощи Вестерн блоттингов мы показали, что из-за измененной конформации ЭР рифенилэтилена, невозможно существенное увеличение уровней проапоптотических факторов, что возможно и является причиной низкой степени клеточной гибели. При помощи репортерных тестов, проведенных на тех же линиях клеток, мы показали, что вне зависимости от класса эстрогенов, все вещества были способны активировать транскрипционную активность ЭР. Таким образом, можно сделать вывод о том, что конформационное изменение ЭР не критично для активации рецептора и индукции клеточной пролиферации, но критично для индукции апоптоза в эстроген-независимых клетках. Так же при помощи репортерных тестов с мутантной формой ЭР мы показали разницу в механизме активации ЭР. Мы подтвердили гипотезу о том, что для активации ЭР трифенилэтиленами, последним необходимо взаимодействие с аспартатом в 351 позиции на рецепторе, что позволит этому а.о. взаимодейтсвовать с активным доменом рецептора AF-1, что, по всей видимости и обеспечивает активность рецептора. Так же мы определили разницу в регуляции транскрипционной активности ЭР посредством изменения стабильности белка ЭР, связанного с непланарными эстрогенами, в сравнении с планарным эстрадиолом. При помощи Вестерн блоттингов мы показали, что ЭР, активируемый трифенилэтиленами, деградирует в меньшей степени, чем посредством планарного эстрадиола. Мы объяснили при помощи иммунопреципитации хроматина, что ЭР с измененной трифенилэтиленами конформацией не может эффективно связывать коактиваторы, что и обуславливает нарушение в протеосомальной деградации белка ЭР и объясняет пониженный уровень транскрипционной активности ЭР на промоторе эндогенных эстроген-респонсивных генов в клетках.

ВЫВОДЫ

Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры (планараности) способны инициировать клеточную пролиферацию клеток рака молочной железы.

Непланарные эстрогены не способны индуцировать апоптоз эстроген-независимых клеток MCF-7:5C. Только планарные эстрогены (17в-эстрадиол и диэтилстилбестрол) могут вызывать полную гибель таких клеток.

Уровень апоптоза в эстроген-независимых клетках при обработке непланарными эстрогенами ниже по сравнению с уровнями, индуцированными планарными эстрогенами. Планарные эстрогены способны увеличивать уровень митохондриальных проапоптотических маркеров в клетках эффективнее чем трифенилэтилены, тем самым предрасполагая клетки к апоптозу.

Все эстрогены вне зависимости от их химической структуры могут активировать ЭРб в ЭР-положительных клетках рака молочной железы как с диким фенотипом, так и с эстроген-независимым фенотипом.

Механизм активации ЭРб трифенилэтиленами отличен от механизма активации эстрадиолом за счет разной принимаемой рецептором конформации. Эстрогены класса II нуждаются во взаимодействии с аспартатом в 351 позиции ЭР для его эффективной активации.

Регуляция транскрипционной активности ЭР при активации различными классами эстрогенов разная. Трифенилэтилены не позволяют ЭР эффективно связывать коактиваторные белки с рецепторным комплексом, что нарушает механизм деградации белка ЭР и снижает транскрипционную активность в клетках рака молочной железы.

Непланарные трифенилэтилены вероятнее всего изменяют конформацию ЭРб по типу антагонистической, подобно антиэстрогену 4-гидрокситамоксифену. В отличие от планарных эстрогенов, трифенилэтилены за счет своей химической структуры не позволяют 12-ой б-спирали закрыть полость лиганд-связывающего домена ЭРб.

Полученные результаты подчеркивают важность конформационных изменений ЭР при активации эстрогенами различных клессов для модуляции эстрогенового ответа в клетках.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты настоящего исследования, описывающие структурно-функиональные отношения трифенилэтиленов и эстрогенового рецептора в клетках рака молочной железы могут служить важным дополнением к тем, уже имеющимся, знаниям о механизмах регулирующих эстрогеновый ответ в клетках, в том числе и резистентных к адъювантной терапии. Вещества типа производных трифенилэтиленов могут послужить основой к созданию новейших препаратов терапии рака молочной железы с меньшими побочными эффектами.

Размещено на Allbest.ru