Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Характеристика и механизмы иммунных нарушений у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией

14.00.36 - Аллергология и иммунология

14.00.01 - Акушерство и гинекология

кандидата медицинских наук

Селедцова Наталья Владимировна

Новосибирск, 2009

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Черных Елена Рэмовна

доктор медицинских наук, профессор Пасман Наталья Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Скосырева Галина Александровна

доктор медицинских наук, профессор Гайдуль Константин Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий

Защита состоится « » 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН по адресу: 6300099, г. Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан « » 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна

Общая характеристика работы

В последнее время гиперандрогении (ГА) надпочечникового генеза уделяется большое внимание в связи с широкой распространенностью данной патологии среди женщин репродуктивного возраста. Наличие ГА рассматривается как один из факторов риска ранних гестационных осложнений (Сидельникова В.М., 2005). В то же время особенности течения второй половины беременности и родов у женщин с данной патологией исследованы недостаточно. Кроме того, неизученным остается вопрос о механизмах гестационных осложнений при ГА, особенно аспектах патогенеза, касающихся иммуно-эндокринных взаимодействий.

Как известно, физиологическое течение беременности происходит на фоне супрессорной перестройки иммунной системы, направленной на формирование и поддержание иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Важная роль в этом процессе отводится смещению цитокинового баланса в сторону доминирования Th2/противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13), а также увеличению количества естественных регуляторных СD4⁺CD25⁺ Т-лимфоцитов (Шмагель К.В., 2003; Сотникова Н.Ю. 2005; Сидельникова В.М., 2005, Saito S., 2007; Zhao J.X., 2007). Кроме того, определенное иммунорегуляторное влияние могут оказывать NK- клетки (Kitaya K., 2008; Vacca P., 2008). Нарушение супрессорной перестройки приводит к развитию осложнений, в частности, невынашиванию беременности и гестозу (Хонина Н.А., 2006; Raghupathy R, 2001; Quenby S., 2002; Xia X.Y., 2008; Yang H., 2008; Faridi R.M., 2009).

Данные о состоянии иммунитета у беременных c ГА надпочечникового генеза в литературе практически отсутствуют. В то же время хорошо известно, что течение беременности требует согласованного взаимодействия иммунной и эндокринной систем. Циркулирующие гормоны при беременности играют важную роль в формировании гестационной иммуносупрессии (Сидельникова В.М. 2002, Szekeres-Bartho J., 2001), и нарушение гормональной регуляции может приводить к развитию иммунных дисфункций.

Поскольку дегидроэпиандростерон и его сульфатированная форма (ДГЭАС) активируют цитотоксическую функцию NK-клеток (Solerte S.B., 2005), пролиферативный ответ Т-лимфоцитов (Pahlavani M.A., 1995) и продукцию Th1- цитокинов (Hernбndez-Pando R., 2005), повышение концентрации данного гормона может негативным образом сказываться на формировании иммуносупрессии и приводить к развитию осложнений беременности.

Согласно данным литературы, стимулирующее влияние ДГЭАС на Т-клетки и NK-клетки реализуется через специфические рецепторы (Okabe Т.,1995). В то же время не исключено, что действие гормона может опосредоваться через другие разновидности иммунокомпетентных клеток, например, дендритные клетки (ДК). Известно, что ДК обладают выраженной регуляторной активностью и могут не только активировать, но и подавлять иммунный ответ, в том числе индуцировать толерантность к аллоантигенам (Yamazaki S., 2007; Dolganiuc A., 2008). Кроме того, ДК способны участвовать в регуляции NK -клеток (Laskarin G., 2008).

Свойства ДК при беременности у человека исследованы недостаточно, а данные, характеризующие влияние ДГЭАС на ДК практически отсутствуют. Между тем, исследование влияния ДГЭАС на дифференцировку/созревание и функциональную активность ДК представляет большой интерес как в фундаментальном, так и практическом аспектах, поскольку раскрытие механизмов иммунорегуляторной активности ДГЭАС является основой для более полного осмысления иммуно-эндокринных взаимодействий и разработке новых подходов к диагностике, профилактике и лечению осложнений беременности, связанных с эндокринными дисфункциями.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования.

Цель исследования. На основе клинико-иммунологического анализа и оценки влияния дегидроэпиандростерона сульфата на созревание/функции ДК in vitro изучить роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе осложнений гестации у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ параметров клеточного звена иммунитета и продукции Th1/Th2-цитокинов в группах беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

2. Исследовать влияние ДГЭАС на созревание/дифференцировку (фенотип) и функциональную активность дендритных клеток беременных (способность индуцировать пролиферацию Т-клеток в СКЛ, стимулировать Th1 и Th2- ответ, влиять на активированные NK-клетки) в культуре in vitro.

3. Охарактеризовать дендритные клетки беременных (фенотип, продукцию цитокинов, аллостимуляторную и Th1/Th2 - стимулирующую активность) с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС в крови.

4. Провести ретроспективный анализ частоты поздних осложнений беременности и родов в группах с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы параметры иммунитета у беременных с надпочечниковой ГА. Установлено, что по сравнению с физиологической гестацией беременные с ГА характеризуются повышенной пролиферативной активностью Т-клеток в ответ на стимуляцию a-CD3мАТ и аллоантигенами партнера, сниженным относительным содержанием естественных регуляторных Т-клеток (СD4⁺CD25⁺) и повышенным содержанием активированных (СD3^-СD16⁺CD56⁺) NK-клеток. Также продемонстрировано, что течение беременности, осложненной ГА, ассоциировано с усилением КонА-индуцированной продукции IFN-г, TNF-б, GM-CSF клетками крови. При этом между выраженностью иммунных дисфункций и уровнем ДГЭАС в сыворотке крови выявлена достоверная взаимосвязь.

Установлено, что генерация интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток (ИФН-ДК) в культуре in vitro в присутствие ДГЭАС сопровождается увеличением содержания зрелых (CD83⁺) и активированных (CD25⁺) ДК и усилением их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток. При этом ДГЭАС усиливает способность ДК стимулировать продукцию Т-клетками IFN-г, ингибирует способность Т-клеток к продукции IL-4 и подавляет способность ИФН-ДК индуцировать апоптоз активированных NK-клеток.

Впервые продемонстрировано, что у беременных с ГА ИФН-ДК характеризуются более высоким содержанием клеток с маркерами зрелых и активированных ДК (CD83 и CD25), причем возрастание CD83-позитивных клеток обусловлено увеличением как зрелых миелоидных ДК (CD83⁺CD14^-), так и CD83⁺ -клеток, ко-экспрессирующих маркер моноцитов/макрофагов (CD83⁺CD14⁺). Кроме того, по сравнению с физиологической беременностью ИФН-ДК беременных с ГА отличаются более высоким уровнем продукции IFN- и низким уровнем IL-4, а также более высокой способностью стимулировать МНК к пролиферации и продукции IFN- в СКЛ.

В процессе клинического анализа получены новые данные о повышенной частоте встречаемости поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабость родовой деятельности, несвоевременное излитие околоплодных вод) при ГА. Установлено, что у беременных с ГА регистрируется раннее появление симптомов гестоза, и чаще встречаются классические варианты гестоза.

Теоретическая и практическая значимость. Сравнительный анализ параметров иммунитета у беременных с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС позволил охарактеризовать иммунные дисфункции, свидетельствующие о нарушении гестационной иммуносупрессии у беременных с ГА.

Выявленные в культуре in vitro стимулирующие эффекты ДГЭАС на дифференцировку/созревание, аллостимуляторную активность и Th1-стимулирующую активность ДК беременных раскрывают новые механизмы иммуностимулирующего действия ДГЭАС, опосредованные ДК. Впервые установлен новый механизм негативной регуляции активированных NK-клеток со стороны ИФН-ДК и продемонстрировано ингибирующее действие ДГЭАС на способность ИФН-ДК стимулировать активационно-индуцированный апоптоз CD56⁺CD16⁺ NK-клеток. Полученные новые данные об особенностях фенотипических и функциональных свойств ДК при физиологической беременности (признаки незрелости, низкая аллостимуляторная активность, доминирование Th2-стимуляторной активности) и выраженных изменениях ДК у беременных с ГА (более зрелый фенотип, появление Th1-стимуляторной активности) свидетельствуют о вовлечении ДК в процессы перестройки иммунной системы при физиологической гестации и участии ДК в опосредованных ДГЭАС иммунных нарушениях при надпочечниковой ГА.

Практическая значимость работы заключается в выявлении иммунологических маркеров, которые могут служить критериями нарушений гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой ГА. Обнаруженные в результате проведенного клинического анализа факты о повышенной частоте встречаемости тяжелых форм гестоза и более раннем возникновении данного осложнения у беременных с надпочечниковой ГА позволяют отнести этих женщин в группу риска по развитию гестоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Повышенный уровень дегидроэпиандростерона сульфата является причиной дефекта гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

2. Иммунотропные эффекты дегидроэпиандростерона сульфата в культуре in vitro и in vivo реализуются с участием дендритных клеток.

3. Беременные с повышенным уровнем дегидроэпиандростерона сульфата составляют группу риска по развитию поздних гестационных осложнений, в первую очередь тяжелых форм гестоза.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Материал изложен на 146 страницах машинописного текста, включающего 15 таблиц и 6 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 285 литературных источника (245 иностранных).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва - 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск -2005), ежегодном конкурс - конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2006» (Новосибирск - 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск - 2007), XIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург - 2009). Апробация диссертации состоялась 02 июля 2009 года на расширенном семинаре НИИ КИ СО РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 11 статей, из которых 10 опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК, для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Содержание работы

Характеристика женщин, включенных в исследование. Диссертационная работа основана на результатах иммунологического обследования женщин репродуктивного возраста и беременных, наблюдавшихся в женских консультациях МБУЗ КДЦ им.А.П.Гумилевского, МУЗ ДСКБ№5, МУЗ ГКБ№11, №3 за период 2004-2008 годы. Обследование проводилось на базе лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ КИ СО РАМН (руководитель д.м.н., профессор Е.Р. Черных).

В исследование были включены 142 небеременные женщины, 190 беременных с физиологическим течением гестации и 101 беременная с надпочечниковой ГА. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, срокам беременности (14,2±0,2 и 15,1±0,1 недель гестации, соответственно) и соматическому статусу. Венозную кровь у небеременных забирали в фолликулярную фазу менструального цикла, у беременных - в сроки 9 - 20 недель.

Дополнительно проводили ретроспективный анализ сплошной выборки историй беременности женщин, наблюдавшихся в женской консультации МУЗ ДСКБ №5 г. Новосибирска в 2002-2004 годы (n=690). Для оценки степени тяжести гестоза использовали классификацию и критерии, разработанные кафедрой акушерства и гинекологии НГМИ 1990 г., дополненные в 1996 г (Серов В.Н. и др., 2001).

Иммунологические исследования. МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований (0,1 х 106 клеток на лунку в 0,15 мл культуральной среды). Для стимуляции клеток использовали растворимые моноклональные анти-CD3 антитела (aCD3 ICO-90, ТОО «Медбиоспектр», Москва, 1 мкг/мл). В отдельной серии экспериментов пролиферативный ответ клеток исследовали в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), где в качестве стимуляторов использовали лимфоциты партнера, инактивированные в течение 40 минут митомицином С (Serva, 40 мкг/мл). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа (анти-CD3 -индуцированные культуры МНК) или 120 часов (СКЛ) по включению метки ³Н-тимидина.

Моноциты выделяли на чашках Петри 33 мм² (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (2-5 х 10⁶/мл) в присутствии 10% сыворотки крови АВ(IV). ДК генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК в течение 3 сут в среде RPMI-1640, дополненной 10% сыворотки плодов коровы (БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (1000 Ед/мл, Leucomax, Шеринг-Плау, Швейцария) и IFN- (1000 Ед/мл, Роферон-А, Roche, Швейцария) с последующим дозреванием с липополисахаридом (10 мкг/мл, ЛПС Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich) 24 ч.

Для оценки продукции цитокинов гепаринизированную венозную кровь разводили 1:4 средой RPMI-1640, дополненной 100 мкг/мл гентамицина, и стимулировали конканавалином А (Кон А, Sigma, 15 мкг/мл) в течение 24 ч. Содержание цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 9-Plex. В ряде случаев концентрацию цитокинов в супернатантах и уровень ДГЭАС в сыворотке крови определяли методом ИФА, используя тест-системы производства «Вектор-Бест», г. Новосибирск (IFN-г), «Протеиновый контур», г.Санкт-Петербург (IL-4) и «ООО Хема-Медика», г. Москва (ДГЭАС).

Определение субпопуляций клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные APC анти-CD3 и анти-СD11с мАТ (BD PharMingen, США), фикоэритрином (PE)-меченные анти-CD4 и анти-СD14 мАТ (“ЗАО Сорбент-сервис”, г. Москва), анти-CD56, анти-СD1а, анти-СD123 мАТ (Phar-Mingen, США) и меченные FITC анти-CD25, анти-СD83 мАТ (BD PharMingen, США), анти-CD16 мАТ («Сорбент», Москва).

Определение фаз клеточного цикла и уровня апоптоза проводили с помощью окрашивания клеток Aсtinomycin D, 7-Amino (Calbiochem, Германия) методом проточной цитофлюориметрии. Оценку экспрессии внутриклеточных цитокинов проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FASC Clibur, Becton Dickinson). Для этого МНК здоровых доноров, истощенные от прилипающих клеток, культивировали в присутствии и отсутствие ИФН-ДК в соотношении 10:1 в течение 5 сут. Затем проводили рестимуляцию аналогичными ИФН-ДК в течение 48 ч (вторичная СКЛ). За 18 ч до конца инкубации в культуру добавляли 10 мкг/мл брефелдина (ISN). МНК обрабатывали APC-меченными анти-CD3 мАТ и фиксировали 1% раствором параформальдегида. Пермеабилизацию клеток проводили с использованием 0,2% раствора Твин-20. Для идентификации внутриклеточных детерминант цитокинов клетки обрабатывали FITC-меченными анти-IFN-б мАТ и PE-меченными анти-IL-4 мАТ (Becton Dickinson, США).

Аллостимуляторную активность ИФН-ДК оценивали в СКЛ при культивировании МНК доноров в присутствии ИФН-ДК небеременных и беременных с отсутствием и наличием ГА (10:1, 5 суток).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5.0». клеточный иммунитет беременный дегидроэпиандростерон

Характеристика параметров иммунитета у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией. Исследование параметров иммунитета показало, что по сравнению с небеременными, женщины с физиологической беременностью характеризовались снижением пролиферативного ответа МНК в aCD3-стимулированных культурах (табл.1). У беременных с ГА пролиферативный ответ Т-клеток на стимуляцию aCD3 мАТ был снижен, однако в гораздо меньшей степени и достоверно превышал таковой при физиологической беременности. При этом между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и интенсивностью пролиферации Т-клеток в аCD3-стимулированных культурах в группе беременных выявлялась прямая корреляционная связь (r_S=0,41, p<0,05, n=23).

Анализ ответа Т-клеток на стимуляцию аллоантигенами выявил резкое снижение уровня пролиферации у женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами (табл.1). В то же время у беременных с ГА уровень пролиферации в СКЛ значимо превышал таковой у женщин с физиологической беременностью. Интенсивность ответа в СКЛ также находилась в прямой корреляционной зависимости от концентрации ДГЭАС в крови беременных (r_S=0,53, p<0,01, n=24).

Относительное содержание регуляторных СD4⁺CD25⁺Т-клеток при физиологической беременности в 3 раза превышало количество этих клеток у небеременных (табл.2). В группе с ГА содержание СD4⁺CD25⁺Т-клеток было достоверно ниже, чем у беременных с отсутствием ГА. При этом количество регуляторных Т-клеток у беременных обратно коррелировало с уровнем ДГЭАС (r_S=-0,57, P<0,001). Аналогичные изменения были выявлены в отношении CD4 -позитивных клеток с высоким уровнем экспрессии CD25-антигена (CD4⁺CD25^high). Количество этих клеток при физиологической беременности в среднем в 2,5 раза превышало аналогичный показатель у небеременных.

Таблица 1. Характеристика пролиферативного ответа Т-клеток у небеременных женщин, беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание: *P_U<0,01-достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; ^#P_U<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 2. Регуляторные Т-клетки в периферической крови у небеременных женщин, беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание: *P_U<0,001 -достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #P_U<0,01- по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

В то же время у беременных с ГА содержание CD4⁺CD25^high Т-клеток практически не отличалось от такового у небеременных женщин (табл. 2).

Оценка количественного содержания различных субпопуляций клеток с естественной цитотоксической активностью показала, что беременные с ГА, так же как и женщины с физиологической беременностью, характеризовались сходным с небеременными количеством СD3^-СD16^-CD56⁺, однако отличались от женщин с физиологической беременностью 2-кратным возрастанием количества активированных NK-клеток (СD3^-СD16⁺CD56⁺) (рис.1). Между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и содержанием СD3^-СD16⁺CD56⁺ - NK-клеток определялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь в общей группе беременных (r_S=0,6; p_U <0,01; n=24).

По сравнению с небеременными женщинами при физиологическом развитии беременности интенсивность КонА-стимулированной продукции Th1/провоспалительных цитокинов (IFN-г, TNF-б, GM-CSF) клетками крови была достоверно ниже (табл. 3).

Рис.1. Субпопуляции киллерных клеток периферической крови небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием гиперандрогении

Количество человек в каждой группе - 12; *- P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с нормальным уровнем ДГЭАС, U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

Между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и содержанием СD3^-СD16⁺CD56⁺ - NK-клеток определялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь в общей группе беременных (r_S=0,6; p_U <0,01; n=24).

По сравнению с небеременными женщинами при физиологическом развитии беременности интенсивность КонА-стимулированной продукции Th1/провоспалительных цитокинов (IFN-г, TNF-б, GM-CSF) клетками крови была достоверно ниже (табл. 3).

Таблица 3. Продукция цитокинов КонА-стимулированными клетками цельной крови небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание .*P_U<0,05, **P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой небеременных; ^#P_U<0,05, ^##P_U<0,01 -по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

У беременных с ГА уровень продукции IFN- и GM-CSF в культурах клеток крови был достоверно выше, чем у женщин с физиологической беременностью. Корреляционный анализ показал наличие прямой взаимосвязи между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови беременных и уровнем продукции IFN-г клетками цельной крови (r_S=0,73, p<0,01, n=17).

Таким образом, у беременных с надпочечниковой ГА отмечается нарушение гестационной иммуносупрессии, что проявляется усилением пролиферативного ответа в a-CD3 и аллоантиген - стимулированных культурах МНК крови и увеличением доли активированных СD3^-СD16⁺CD56⁺ NK-клеток. В основе механизмов, приводящих к выявленным изменениям, может лежать сниженное количество естественных регуляторных СD4⁺CD25⁺ Т-клеток в циркуляции, а также нарушение Th1-Th2 переключения и сохранение активной продукции Th1/провоспалительных цитокинов. При этом причастность выявленных изменений с повышенным уровнем ДГЭАС у беременных с ГА подтверждается наличием достоверных корреляционных связей между концентрацией гормона и выраженностью изменений анализируемых иммунологических параметров.

Влияние ДГЭАС на дифференцировку/созревание и функциональную активность дендритных клеток в культуре in vitro. С целью исследования влияния ДГЭАС на дифференцировку и созревание ИФН-ДК оценивали эффект гормона на экспрессию поверхностных маркеров ДК (табл. 4).

Таблица 4. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на дифференцировку и созревание ИФН-ДК беременных

Примечание: *P_U<0,05, **P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК, полученными в стандартных условиях (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах)

Добавление ДГЭАС с первых суток культивирования достоверно не влияло на количество ДК, экспрессирующих исследуемые маркеры. В то же время, при добавлении ДГЭАС совместно с LPS (за 24 ч до окончания культивирования) регистрировалось увеличение доли как незрелых (CD1a-позитивных), так и зрелых ДК (CD83⁺), в том числе активированных CD25-позитивных клеток.

Из данных табл. 5 видно, что обработка ДК беременных ДГЭАС (10^-6М) повышала их аллостимуляторную активность. Так, интенсивность пролиферации и индекс стимуляции в СКЛ, индуцированной ДГЭАС-модифицированными ДК были достоверно выше, чем в культурах, индуцированных интактными ДК.

Таблица 5. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на аллостимуляторную активность ИФН-ДК беременных

Примечание: МНК доноров инкубировали в отсутствие и в присутствие ДК женщин с физиологической беременностью (n=6), генерированных в стандартных условиях (МНК+ДК₀) и с ДГЭАС (МНК+ДК_ДГЭАС). Тестирование всех ДК проводилось на МНК двух различных женщин - доноров. Индексы влияния (ИВ) рассчитывали как соотношение пролиферативного ответа МНК доноров при стимуляции ДК к уровню спонтанной пролиферации. *P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК₀; (U критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах).

На следующем этапе оценивали влияние ДГЭАС на Тh1- и Th2 -стимулирующую активность ДК беременных. Для этого сравнивали продукцию Т-клетками IFN-г и IL-4 в супернатантах вторичной СКЛ, которую индуцировали интактными или ДГЭАС-модифицированными ДК, полученными от 9 женщин c физиологическим течением гестации (табл.6). Проведенные исследования показали, что продукция IFN-г в супернатантах СКЛ, индуцированной ДГЭАС-модифицированными ДК была в 2,2 раза выше, а концентрация IL-4 - в 1,7 раза ниже, чем в культурах СКЛ, индуцированной интактными ДК (табл.6).

Таблица 6. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на Th1/Th2-cтимулирующую активность ИФН-ДК беременных

Примечание: ДК₀ - ДК женщин с физиологической беременностью (n=9), генерированные в стандартных условиях, ДК_ДГЭАС - генерированные с ДГЭАС. Тестирование всех ДК проводилось на МНК двух различных женщин - доноров. Индексы влияния (ИВ) рассчитывали как соотношение уровня продукции цитокинов МНК доноров при стимуляции ДК к уровню спонтанной продукции. *P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК₀; (U критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах)

Исследования последних лет показали, что наряду с участием в регуляции Th1/Th2 баланса ДК способны активно взаимодействовать с NK-клетками. В этой связи представлялось важным исследовать влияние интактных и ДГЭАС-модифицированных ДК на активированные NK-клетки. Добавление интактных ДК в культуры МНК не влияло на количество CD56⁺СD16^- NK-клеток (табл.7), однако приводило к достоверному снижению доли активированных CD56⁺СD16⁺ NK-клеток.

Уменьшение относительного содержания CD56⁺СD16⁺ клеток не было связано со снижением экспрессии СD16, поскольку средний уровень флюорисценции данной молекулы в контрольных культурах МНК и МНК, культивируемых в присутствие ДК, не различался (табл.7).

Таблица 7. Влияние ИФН-ДК беременных, генерируемых в присутствие и отсутствие ДГЭАС, на относительное количество, пролиферацию и апоптоз NK-клеток

Примечание: МНК доноров инкубировали в отсутствие ДК (МНК), в присутствие ДК, генерированных без добавления ДГЭАС (ДК₀) и в присутствие ДК, генерированных с ДГЭАС (ДК_ДГЭАС). *P_U<0,05 -достоверность различий по сравнению с культурой МНК, #P_U<0,05- достоверность различий по сравнению с культурой МНК+ДК₀; (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах)

В то же время добавление в культуры МНК интактных ДК сопровождалось уменьшением доли покоящихся (в G0/G1)- и увеличением доли пролиферирующих (в S,G2/M фазах клеточного цикла) CD56⁺СD16⁺ клеток и 5-кратным возрастанием уровня апоптоза в данной популяции. Культивирование МНК с ДГЭАС-модифицированными ДК не сопровождалось достоверным снижением относительного содержания CD56⁺СD16⁺ клеток, а индукция апоптоза CD56⁺СD16⁺ клеток была достоверно ниже, чем в присутствии интактных ДК. Таким образом обработка ДК ДГЭАС достоверно снижала их ингибирующий эффект в отношении активированных NK-клеток. Таким образом, ДГЭАС в культуре in vitro стимулирует дифференцировку и созревание миелоидных ДК и оказывает выраженный эффект на функциональную активность ДК, в частности, усиливает аллостимуляторную- и Th1-стимулирующую активность ДК и подавляет их способность индуцировать апоптоз активированных NK-клеток. Выявленные эффекты гормона на ДК позволяют полагать, что изменение цитокинового баланса в сторону продукции Th1-цитокинов и повышенное содержание активированных CD56⁺СD16⁺ - NK-клеток в периферической крови беременных с ГА может быть следствием изменения функциональной активности ДК на фоне повышенного содержания ДГЭАС.

Характеристика дендритных клеток при неосложненной беременности и надпочечниковой гиперандрогении. Сравнительный анализ ИФН-ДК показал, что по сравнению с небеременными женщинами при физиологической беременности относительное количество клеток с фенотипом зрелых (CD83⁺) и активированных (CD25⁺) ДК было снижено в два раза (табл.8). Относительное количество CD83⁺ - и CD25⁺ - ДК у беременных с ГА было в 2,5 раза выше, чем при неосложненной беременности. Кроме того, беременные с ГА отличались повышенным содержания ДК с маркером моноцитов (CD14⁺).

Таблица 8. Фенотип ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание: *P_U<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; ^#P_U<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Чтобы объяснить одновременное возрастание клеток с фенотипом моноцитов и зрелых ДК, в отдельной серии экспериментов была исследована ко-экспрессия CD14 - и CD83 - молекул в популяции ДК. У небеременных популяция ДК содержала небольшое количество клеток, экспрессирующих одновременно молекулы CD14 и CD83. В группе женщин с физиологической беременностью количество CD14⁺CD83⁺ - клеток было 2-кратно снижено (4,3±0,9 vs 8,4±1,7% у небеременных, P_U<0,05), а у беременных с ГА - достоверно повышено (14,0±2,5 vs 4,3±0,9 % при физиологической беременности, P_U<0,01). Характерно, что наряду с возрастанием CD14⁺CD83⁺ клеток у беременных с ГА также отмечалось более высокое содержание CD14^-CD83⁺-клеток, представляющих «классические» зрелые миелоидные ДК (10,6±2,5 vs 4,3±0,5% при физиологической беременности). Таким образом, наблюдаемое возрастание CD83⁺ ДК у беременных с ГА было обусловлено как за счет зрелых ДК, так и за счет популяции CD14⁺CD83^+.

Чтобы выяснить, являются ли изменения ДК при ГА следствием повышенного уровня ДГЭАС в крови, в отдельной серии экспериментов исследовали влияние сывороток крови беременных на экспрессию дифференцировочных маркеров ДК доноров. Для этого ДК небеременных женщин на этапе созревания культивировали либо с сыворотками беременных c неосложненной гестацией, либо беременных с ГА. Концентрация ДГЭАС в сыворотках крови женщин с физиологической беременностью (n=10) составила в среднем 0,63 ± 0,1 мкг/мл, у беременных с ГА (n=10) - 9,3±0,6 мкг/мл. Сыворотки крови женщин с неосложненной беременностью ингибировали созревание ДК, что проявлялось в снижении относительного количества CD83-позитивных клеток (20,2±1,8 против 30,5±4,4% в контроле). В то же время сыворотки беременных с ГА не оказывали ингибирующего эффекта на содержание CD83⁺ДК и достоверно отличались по влиянию на количество СD25⁺ДК от сывороток женщин с физиологической беременностью (25,8±3,8 против 18,8±3,4 %, P_U<0,05).

Согласно данным литературы, состояние зрелости ДК во многом определяет спектр продуцируемых ими цитокинов. Исследование продукции цитокинов показало, что концентрация IFN- в культурах ДК у женщин с физиологической беременностью была достоверно ниже, а уровень IL-4 - 2-кратно выше, чем в культурах ДК небеременных женщин (табл.9).

Таблица 9. Содержание IFN- и IL-4 в супернатантах ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием гиперандрогении

Примечание: *P_U<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; ^#P_U<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

У беременных с ГА концентрация IFN- в супернатантах ДК была существенно выше, а продукция IL-4 - значимо ниже, чем в группе здоровых беременных.

Анализируемые группы различались также по аллостимуляторной активности ДК. По сравнению с небеременными женщинами ДК женщин с физиологической беременностью обладали более низкой способностью стимулировать пролиферацию МНК в СКЛ (табл.10). В группе беременных с ГА ИВ ДК был достоверно выше, чем при физиологической беременности.

На следующем этапе было проведено исследование Тh1/Тh2-стимулирующей активности ДК. ДК небеременных женщин значимо стимулировали увеличение количества CD3⁺IFN-г⁺ Т-клеток в СКЛ (Таблица 11). В то же время ДК женщин с неосложненной беременностью не вызывали увеличения CD3⁺IFN-г⁺ Т-клеток, однако индуцировали увеличение относительного содержания CD3⁺IL-4⁺ Т-клеток. ДК беременных с ГА сохраняли способность активировать Т-клетки к внутриклеточной продукции IFN-г, хотя стимулирующий эффект был значимо ниже по сравнению с ДК небеременных женщин. Одновременно с этим ДК беременных с ГА индуцировали увеличение доли CD3⁺IL-4⁺ Т-клеток.

Таблица 10. Аллостимуляторная активность ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание. ДК культивировали в течение 5-ти суток с МНК доноров, ДК от каждой женщины протестированы в СКЛ на 2-х донорах; *P_U<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; ^#P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 11. Относительное количество СD3⁺IFN-⁺ и СD3⁺IL-4⁺ клеток и уровень продукции IFN- во вторичной СКЛ с ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием гиперандрогении

Примечание. ИВ-индекс влияния (отношение уровня продукции или относительного содержания клеток с внутриклеточным содержанием цитокина в культуре МНК после стимуляции ДК к аналогичному показателю в отсутствие стимуляции). *P_U<0,05, **P_U<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #P_U<0,05 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (U- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Наличие Тh1-стимулирующей активности ДК беременных с ГА подтверждалась также более высоким уровнем продукции IFN- в СКЛ, индуцированной этими клетками по сравнению с СКЛ, индуцированной ДК женщин с физиологической беременностью.

Таким образом, по сравнению с ДК женщин с физиологической беременностью популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой ГА содержит большее количество зрелых, активированных клеток и характеризуется более высоким уровнем продукции IFN- и низким уровнем IL-4. Эти клетки более эффективно стимулируют пролиферацию МНК в СКЛ и сохраняют способность индуцировать Th1- ответ. Эти клетки более эффективно стимулируют пролиферацию МНК в СКЛ и сохраняют способность индуцировать Th1- ответ.

Сравнительная характеристика особенностей течения и исходов беременности у женщин с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении. Ретроспективный анализ историй беременности и родов выявил, что синдром надпочечниковой ГА, подтвержденный наличием лабораторных признаков (повышенное содержание в крови ДГЭАС), встречался у 17,2% (119/690) беременных.

Оценка частоты развития наиболее значимых клинических осложнений беременности и родов, влияющих на перинатальные исходы, показала, что у женщин с ГА беременность достоверно чаще осложнялась угрозой прерывания, фетоплацентарной недостаточностью, гестозом, преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты, синдромом задержки развития плода (табл.12, 13,14).

Таблица 12. Частота развития гестационных осложнений у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание: n-количество женщин с осложнением, % рассчитан по отношению к количеству беременных в данной группе; достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Рч²= 0,01, **Рч²= 0,001 - достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой

Таблица 13. Частота развития и особенности течения гестоза у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание: n-количество беременных в группе, достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Рч²= 0,01, ** Рч²= 0,001 - достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой

Примечательно, что в контрольной группе не было зарегистрировано ни одного случая преэклампсии, тогда как при ГА данное осложнение регистрировалось достоверно чаще, в частности, имело место у 3 беременных (2,5%). При ГА отмечено раннее появление клинических симптомов гестоза, диагностированных в большинстве случаев до 25 недель гестации и преобладание классического варианта (триады Цонгемейстера).

Одним из индикаторов показатели тяжести гестоза является масса новорожденного при рождении (табл.13). Вес новорожденных, рожденных от беременных с гестозом на фоне ГА был достоверно ниже, чем в группе сравнения (гестоз в отсутствие ГА).

У рожениц с ГА в 4 раза чаще встречалась слабость родовой деятельности, в 3 раза чаще несвоевременное излитие околоплодных вод, в 8 раз чаще интранатальная гипоксия плода (< 7 баллов по шкале Апгар на 5-ой минуте). Относительное количество оперативных родов (кесарево сечение) при ГА также было достоверно выше, чем при физиологической беременности. Подводя итог клинико-иммунологическому исследованию можно заключить, что, ассоциированные с повышенным уровнем продукции ДГЭАС иммунные нарушения приводят к развитию гестационных осложнений - формированию первичной плацентарной недостаточности и, как следствие, нарушению кровоснабжения плода и спонтанным выкидышам. При сохранении гестации в данной группе женщин на фоне плацентарной недостаточности во второй половине беременности развивается гестоз. Высокая частота гестационных осложнений при надпочечниковой ГА диктует необходимость разработки мероприятий проведения их эффективной профилактики с ранних сроков беременности и на этапе предгравидарной подготовки.

Таблица 14. Частота развития патологии родов у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Примечание: n-количество женщин с осложнением родов, % рассчитан по отношению к количеству родильниц в группе; достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Рч²= 0,01, ** Рч²= 0,001 - достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой

Выводы

1. Беременные с гиперандрогенией надпочечникового генеза отличаются повышенным уровнем пролиферативного ответа Т-клеток на стимуляцию a-CD3мАТ и аллоантигенами партнера, возрастанием относительного содержания активированных (СD3^-СD16⁺CD56⁺) NK-клеток и снижением количества естественных регуляторных Т-клеток (СD4⁺CD25^high), а также усилением КонА-индуцированной продукции Th1 - цитокинов (IFN-г, TNF-б, GM-CSF) клетками цельной крови, что свидетельствует о нарушении клеточно-и цитокинопосредованных механизмов гестационной иммуносупрессии у беременных с повышенным уровнем ДГЭАС.

2. Обработка ИФН-ДК беременных ДГЭАС in vitro приводит к увеличению содержания CD1а⁺, CD83⁺ и CD25⁺ дендритных клеток, а также усилению их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток и продукцию IFN- и подавлению способности индуцировать продукцию IL-4 в СКЛ, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/ созревание, антигенпрезентирующую и Th1 - стимуляторную активность дендритных клеток наряду с ингибирующим действием на Th2-стимуляторную активность.

3. Культивирование ИФН-ДК беременных с МНК сопровождается усилением апоптоза и снижением количества CD56⁺СD16⁺ NK-клеток. При этом ДГЭАС на этапе созревания дендритных клеток ингибирует их апоптоз-индуцирующую активность, что является одним из возможных механизмов повышенного содержания CD56⁺СD16⁺ NK-клеток у беременных с гиперандрогенией.

4. Популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (по сравнению с дендритными клетками женщин с неосложненной беременностью) характеризуется повышенным содержанием CD83⁺ и CD25⁺ дендритных клеток, более высоким уровнем продукции IFN- и низким уровнем IL-4, и способностью стимулировать Т-клетки к продукции IFN-, что свидетельствует о более зрелом фенотипе дендритных клеток и наличии у них Тh1-стимулирующей активности.

5. Иммунные дисфункции у беременных с гиперандрогенией ассоциированы с повышенной частотой развития гестоза, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, задержки внутриутробного развития плода, что подтверждает важную роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе поздних гестационных осложнений.

Практические рекомендации

1. Высокая встречаемость синдрома надпочечниковой гиперандрогении, ассоциированная с повышенной частотой осложнений беременности, диктует необходимость скринингового исследования уровня ДГЭАС в крови на этапе планирования беременности или постановки беременной на учет в женскую консультацию. При выявлении повышенного уровня ДГЭАС в крови целесообразна профилактика не только ранних, но и поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабости родовой деятельности, несвоевременного излития околоплодных вод).

2. Проведение иммунологического исследования у...