Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

«Скрининг гемолитической и иммуносупрессорной активности фотосенсибилизаторов порфиринового ряда»

03.00.02 - биофизика

кандидата биологических наук

Мансурова Галина Валерьевна

Москва - 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, доцент Кягова А.А.

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Осипов А.Н.

Доктор биологических наук Мурина М.А.

Ведущее учреждение: Институт биофизики клетки РАН

Защита состоится «19» февраля 2007 г. в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета К 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете, по адресу:117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан «16 января» 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент И.В.Буромский.

фотогемолитический мембрана эритроцит протопорфирин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Фотодинамическая терапия (ФДТ) является бурно развивающимся методом лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанным на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС). Один из главных путей совершенствования ФДТ - создание новых более эффективных ФС, как правило, путем модификации порфиринов - ФС, применяемых в ФДТ [Dougherty, 2002; Hopper, 2000]. Т.к. таких ФС создается очень много, то необходим скрининг их биологической эффективности. Одна из самых простых и хорошо изученных моделей для скрининга - фотогемолиз эритроцитов человека. Поэтому, определение гемолитической эффективности и выявление связи “структура ФС-биологическая активность” новых ФС для ФДТ является актуальной задачей.

Известно, что ФДТ с такими ФС, как порфирины, часто сопровождается угнетением Т-клеточного звена иммунитета [Simkin et al., 2000, Musser and Oseroff, 2001; Nowis et al., 2005]. ФДТ-индуцированная иммуносупрессия может быть основным механизмом терапевтических эффектов при неонкологических, например, кожных и аутоиммунных заболеваниях [Kurwa and Barlow, 1999]. Фотохимический механизм иммуносупрессии при ФДТ не известен. Одним из ФС, используемых в ФДТ, является протопорфирин IX (ППIX) [Sternberg et al., 1998]. В ходе проведения ФДТ происходит фотолиз ППIX с образованием его стабильных фотопродуктов [Cox and Written, 1982; Wessels et al., 1993], которые можно обнаружить как в растворах, так и в клетках [Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002]. В литературе нет данных о том, могут ли стабильные фотопродукты ППIX вносить вклад в супрессорное действие ФДТ. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов ППIX на Т-клеточный иммунный ответ in vivo также является актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнить гемолитическую и иммуносупрессорную активность производных дейтеро-порфирина IX (ДП), протопорфирина IX (ППIX) и его фотопродуктов и порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сравнить темновые и фотогемолитические эффекты производных ДП и определить прочность связывания данных соединений с мембраной эритроцита.

2. Оценить темновые и фотогемолитические эффекты ППIX и его фотопродуктов, а также порфиринов, содержащих аминофосфонатную группу.

3. Изучить влияние фотопродуктов ППIX на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности у мышей.

Научная новизна исследования. В диссертационной работе проведено исследование темновой и фотогемолитической эффективности 2- или 4-монозамещенных и 2,4-дизамещенных производных ДП. Показано, что все исследованные производные ДП обладают темновым гемолитическим действием. Фотогемолитическая активность зависит от структуры производных. Разработана методика оценки прочности связывания ФС с мембранами эритроцитов, основанная на сравнении скоростей фотосенсибилизированного гемолиза в отмытых и не отмытых от ФС суспензиях эритроцитов.

Показано, что фотопродукты ППIX обладают фотогемолитическим действием. Фотогемолитические эффективности фотопротопорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина 2 (ФПП2) превышают фотогемолитическую эффективность ППIX. Удаление из молекулы ФПП1 ОН-группы приводит к снижению темновой и увеличению фотогемолитической эффективности. Определены фотогемолитические эффективности диметилового эфира O,O-диэтил-(N-третбутил)-фосфонометил фотопротопорфирина IX (АФ1) и диметилового эфира 3-[О,O-диэтил-(N-третбутил)-фосфонометил]-8-винилдейтеропорфирина IX (АФ2). АФ1, содержащий ОН-группу в первом положении, в отличие от АФ2, обладает выраженным детергентоподобным темновым гемолитическим действием.

Впервые показано, что предоблученный ППIX способен супрессировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Глубина супрессии определялась дозой облучения ППIX .Впервые обнаружено, что супрессорный эффект предоблученного ППIX обусловлен действием его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2 в количестве 2,5 нг/кг веса животных. В основе супрессорного действия фотопродуктов ППIX на КЧ лежит угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим супрессорным потенциалом.

Практическая значимость. Работа является фундаментальным исследованием, направленным на усовершенствование ФДТ. Отдельные ее положения имеют прямое практическое приложение. Обнаруженная в работе иммуносупрессорная активность фотопродуктов ППIX создает предпосылки для поиска новых лекарственных форм для терапии неонкологических заболеваниях, для которых характерна гиперреактивность иммунной системы.

Внедрение в практику. Данные, полученные в ходе исследования, внедрены в исследовательскую деятельность кафедры медицинской и биологической физики РГМУ, а также кафедры фармакологии РГМУ.

Положения, выносимые на защиту.

1. Фотогемолитическая активность производных ДП и ППIX зависит от структуры, числа и положения боковых заместителей.

2. Регистрация скорости фотосенсибилизированного гемолиза позволяет оценить прочность связывания ФС с мембраной эритроцита.

3. Фотопродукты ППIX обладают неспецифическим супрессорным действием на Т-клеточный иммунный ответ in vivo.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 12th International Congress on Photobiology, Austria (September 1-6, 1996), на Deutsche Gesellschaft fur Biophysik. Jahrestagung, Leipzig (18-21 September 1996), на 9^th Congress of the European Society for Photobiology, Norway (3-8 September 2001), на III Съезде фотобиологов России, Воронеж (28 июня-4 июля 2001), на 10^th Congress of the European Society for Photobiology, Austria (September 6-11, 2003), на III съезде биофизиков России, Воронеж (24-29 июня 2004 г), на III съезде иммунологов России, Екатеринбург (24-29 июня 2004 г). 1^st Internatiional Conference Skin & Environment. Moscow-St. Petersburg, Russia. (1-6 June 2005), объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры медицинской и биологической физики педиатрического факультета, кафедры биофизики факультета МБФ и ПНИЛ Биофизика РГМУ (24 октября 2006г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 24 рисунка, 5 схем, 4 таблицы. Состоит из разделов “Введение”, “Обзор литературы”, “ Материалы и методы”, “Результаты и обсуждение”, выводы. Список литературы включает 164 источников.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Реактивы. В работе использовались коммерческие препараты диметиловый эфир ППIX («Sigma», США), полиэтилен гликоль (ПЭГ)-400 («Sigma», США), динитрохлорметан («Sigma», США), гаптены 2,4-динитрофторбензол (ДНФБ) и оксазолон («Sigma», США). Производные ДП: 2,4-тетраоксо-ДП (ДП1), 2,4-дигидрокси-ДП (ДП2); 4-диоксо-ДП (ДП3), 4-оксо-ДП (ДП4), 4-гидрокси-ДП (ДП5), 2-диоксо-ДП (ДП6), ФПП1 и ФПП2 синтезированы в лаборатории проф. Пономарева Г.В. (ИБМХ РАМН). АФ1 и АФ2 синтезированы Зобниной Е.В. в лаборатории проф. И.П. Белецкой (МГУ им. Ломоносова, Москва).

Методы исследования. Спектрофотометрия, турбидиметрическая регистрация гемолиза, фотохимические методы, тонкослойная хроматография, реакция КЧ к гаптенам у мышей, методы адоптивного переноса реакции КЧ и ее супрессии.

Результаты и обсуждение

1. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов производных ДП

Фотосенсибилизированный гемолиз эритроцитов является удобной и хорошо изученной моделью для изучения фотоповреждения биологических мембран. В настоящем разделе сопоставлена темновая и фотогемолитическая активность производных ДП, считающихся перспективными для применения в ФДТ опухолей [Иванов и др., 1998]. Эксперимент проводили по схеме: суспензию эритроцитов с производным ДП инкубировали в темноте в течение 30 минут, после чего облучали УФ-А светом. Далее пробы инкубировали в темноте и регистрировали гемолиз.

Чаще всего, гемолиз, вызываемый ФС, развивается по коллоидно-осмотическому механизму и зависимость скорости гемолиза V от дозы облучения D может быть описана уравнением вида: V=V₀+aD^b, где V₀ - скорость темнового гемолиза, D - доза облучения, a - коэффициент, характеризующий фотогемолитическую эффективность красителя, b - показатель степени при дозе облучения. Величина a зависит от концентрации ФС, его поглощения при данной длине волны, квантового выхода фотохимической реакции и связывания с мембраной эритроцита вблизи критической мишени. Показатель степени при дозе облучения дает информацию о числе квантов света, необходимых для одного акта повреждения мембраны. Считают, что если b равен 2, то катионный канал образуется вследствие независимого повреждения двух субъединиц белка полосы 3 [Pooler, 1985; Grossweiner, 1999].

На рис. 1 приведены кривая гемолиза (А) и дозовая зависимость скорости гемолиза (Б), сенсибилизированного производным ДП5. Видно, что лизису подвергались все клетки суспензии, т.е. гемолиз был завершенным. Из кривых гемолиза рассчитывалась скорость гемолиза V=1/ t₅₀, где t₅₀ - время, за которое лизируют 50% клеток в суспензии. Аналогичные по форме кривые и дозовые зависимости скорости фотогемолиза получены с другими ДП.

АБ

Рис. 1. Типичная кривая фотогемолиза при дозе облучения 6,24 кДж/м² (А) и дозовая зависимости скорости фотогемолиза (Б), сенсибилизированного ДП5.

Интенсивность УФА-излучения 26 Вт/м², длина волны 365 нм. Концентрация фотосенсибилизатора в суспензии эритроцитов 10^-5 М. Концентрация эритроцитов в суспензии 10⁷ кл/мл. Температура инкубации 37 ⁰С.

Все исследованные производные ДП характеризовались практически одинаковыми значениями b?2, но величины V₀ и а у них были различны (табл. 1). Величины а и b рассчитывались методом наименьших квадратов из спрямленных в двойных логарифмических координатах дозовых зависимостей. Концентрация производных ДП была одинаковой (10^-5 M), но значения (1-T) при 365 нм отличались. Поэтому мы ввели нормированный к поглощению коэффициент а_Т=а/(1-Т)₃₆₅ (табл. 1). Он зависел только от физико-химических свойств ФС и его способности связываться с мембраной.

Все использованные производные ДП увеличивали скорость темнового гемолиза. Из таблицы 1 видно, что для разных производных ДП величина V₀ была в 1,6 - 7,3 раза выше скорости спонтанного гемолиза эритроцитов (контроль без ФС).

Таблица 1. Сравнительные характеристики производных ДП.

Производное ДП*	Показатель сте-пени при дозе облучения, b	Гемолитическая эффективность, нормированная к коэффициенту поглощения (1-Т)365 aT, 10-3, м4/(кДж2ч)	Скорость темнового гемолиза, V0, 10-2, ч-1
	2,1±0,10	0,0049±0,00092	0,95±0,11
	1,85±0,03	0,63±0,042	1,26±0,30
	2,1±0,12	36,7±3,25	3,44±0,93
	1,8±0,05	42,7±4,24	2,18±1,53
	1,9±0,05	140,2±8,66	2,77±0,69
	1,8±0,09	206,2±10,19	4,29±0,84
Контроль без ФС 0,59±0,03

*Приведена только та часть тетрапиррольного кольца, которая подвергалась модификации.

Фотогемолитические эффекты ФС различаются гораздо сильнее, чем темновые. Более эффективными оказались 2- и 4-монозамещенные производные: ДП6, ДП4, ДП3 и ДП5, причем предпочтительнее наличие заместителя во втором положении тетрапирольного кольца. Видно, что структура боковых заместителей влияет на фотогемолитическую активность. Производное ДП4 с оксогруппой в боковом заместителе имеет большую фотогемолитическую эффективность по сравнению с производным ДП5, имеющим ОН-группу в том же положении и производным ДП3 с двумя оксогруппами.

Показатель степени при дозе облучения у всех соединений равен 2 (табл.1), что указывает на то, что мишень для данных ФС была одна и та же. Ею может быть двухсубъединичная молекула белка полосы 3 в мембране эритроцита [Grossweiner, 1999; Pooler, 1985]. Поэтому различия гемолитических эффективностей ФС можно объяснить различиями в их структурах (табл.1), обеспечивающими способность связываться с мембраной как можно ближе к белку полосы 3.

Считается, что в повреждающем действии большинства порфириновых ФС преобладают реакции, в которых с биосубстратом взаимодействует синглетный кислород (¹О₂). В работе [Ivanov et al., 2004] было показано, что диффузия кислорода в липидной фазе мембран затруднена. По нашим расчетам, учитывая данные этой работы, длина пробега ¹О₂ в мембране за 50 нс [Красновский, 2001] составляет 0,4 нм, что на порядок меньше толщины мембраны и даже меньше размеров молекулы порфирина. Поэтому близость расположения ФС к критической мишени чрезвычайно важна для повреждения мембраны. Можно предположить, что различия в структуре исследуемых производных ДП приводят к тому, что они оказываются локализованными на разных расстояниях от критической мишени.

2. Определение прочности связывания производных ДП с эритроцитами человека

Одним из факторов, влияющих на гемолитическую эффективность ФС, может быть прочность связывания ФС с мембраной эритроцита. Поэтому мы оценили прочность связывания с эритроцитами вблизи критической для гемолиза мишени производных ДП2 и ДП5, отличающиеся количеством боковых заместителей с ОН-группой и величинами а_Т (табл. 1).

Для этого суспензию эритроцитов с добавленным ФС инкубировали в темноте, затем разделяли на равные объемы и центрифугировали. После этого один образец ресуспензировали в той же надосадочной жидкости, а в другом заменяли супернатант на фосфатный буферный раствор (ФБР). Затем образцы облучали при одинаковых условиях, инкубировали в темноте и регистрировали гемолиз.

На рис. 2, А представлены скорости фотогемолиза, сенсибилизированного ДП5, в отмытом (столбец 2) и не отмытом (заштрихованный столбец 1) образцах. Видно, что отмывание эритроцитов от красителя приводит к возрастанию скорости фотогемолиза, что указывает на сильный экранирующий эффект свободного ФС. Если уменьшить толщину облучаемого образца (рис. 2, Б) и тем самым - экранирующий эффект, то после отмывания эритроцитов происходит уменьшение скорости фотогемолиза, что свидетельствует о том, что часть ФС удаляется из мембраны.

Если экранирующий эффект учесть расчетным путем (не заштрихованные столбцы 1, рис. 2), то разность в скоростях гемолиза в не отмытом и отмытом образцах становиться еще больше.

АБ

Рис. 2. Влияние отмывания эритроцитов от ДП5 на скорость фотогемолиза.

1 - центрифугирование, ресуспензирование, облучение (заштрихованный столбец);

2 - центрифугирование, замена супернатанта на ФБР, облучение;

3 - центрифугирование, ресуспензирование;

4 - центрифугирование, замена супернатанта на ФБР.

1 - скорость гемолиза, исправленная с учетом эффекта экранировки.

Доза облучения при 365 нм 6,24 кДж/м². Концентрация фотосенсибилизатора в суспензии эритроцитов 10^-5 М. Концентрация эритроцитов в суспензии 10⁷кл/мл. Температура суспензии клеток при инкубации 37 ⁰С.

а - толщина слоя 1 см; б - толщина слоя 0,1 см.

При расчете доли ФС, прочно связанного с мембраной эритроцита, были использованы выражение для интенсивности света, поглощенного связанным красителем в присутствии экранирующей примеси [Владимиров, Потапенко, 2006],квадратичные зависимости скорости гемолиза от дозы облучения и концентрации ФС [Pooler, 1985; Grossweiner, 1999]. Коэффициент прочности связывания в (т.е. доля ФС, прочно связанного с мембраной) рассчитывался по формуле:

,

где С₁ - количество ФС, первоначально связавшегося с мембраной; С₂ - количество ФС, оставшегося после отмывания; Т_общ и А_общ - пропускание и оптическая плотность ФС до отмывки; V_отм и V_экр - скорости гемолиза в отмытом и не отмытом образцах, соответственно.

Коэффициент в для ДП5 равен 0,86, для ДП2 - 0,61. Коэффициенты распределения красителей ДП5 и ДП2, измеренные в системе октанол/вода, составили соответственно 20,7 и 17,0 (определены Решетниковым А.В., ИБМХ РАМН). Значения коэффициента прочности связывания коррелируют со значениями коэффициента распределения октанол/буфер, но не позволяют объяснить различия фотогемолитических эффективностей.

3. Сравнение темновых и фотогемолитических эффектов ППIX и его фотопродуктов на эритроциты

Одним из ФС, используемых в ФДТ является ППIX [Sternberg et al., 1998]. При воздействии света на ППIX происходит фотолиз с образованием фотопродуктов, в основном изомеров ФПП1 и ФПП2 [Cox and Written, 1982; Wessels et al., 1993]. Эти продукты фотолиза образуются и в тканях при проведении ФДТ [Bagdonas et al., 2000; Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002]. Известно, что ППIX обладает гемолитическим эффектом, как в темноте, так и при фотодинамическом воздействии [Lagerberg et al., 1996]. Однако гемолитическое действие фотопродуктов ППIX не изучено. В этой связи нами были исследованы темновые и фототоксические эффекты ФПП1 и ФПП2 на мембраны эритроцитов, которые мы сравнили с таковыми ППIX.

Общие закономерности фотогемолиза, сенсибилизированного ППIX и его производными оказались такими же, как для исследованных производных ДП. Кривые фотогемолиза имели сигмоидную форму, а дозовые зависимости скорости фотогемолиза были квадратичными. Значительно различались только величины нормированной к поглощению при 365 нм фотогемолитической эффективности а_Т (см. табл. 2).

В таблице 2 можно увидеть, что скорость темнового гемолиза в присутствии ППIX и ФПП2 увеличивается по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов (контроль без ФС) лишь на 25 %. Темновой эффект ФПП1 оказался значительнее: увеличение скорости V₀ по сравнению с контролем составляет 200 %. Однако, наибольшим фотогемолитическим эффектом обладает не ФПП1, а ФПП2: его гемолитическая эффективность а_Т в 9 и 1,8 раз больше, чем а_Т для ППIX и ФПП1, соответственно.

Для оценки влияния ОН-группы был поставлен гемолиз в присутствии альдегида. Этот ФС не имеет гидроксильной группы, а имеет только один заместитель - альдегидную группу во втором положении, как и ФПП1.

Таблица 2. Сравнительные характеристики производных ППIX, его фотопродуктов и альдегида.

ФС*	Показатель степени при дозе облучения, b	Гемолитическая эффективность, нормированная к коэффициенту поглощения (1-Т)365 aT, 10-3, м4/кДж2ч	Скорость темнового гемолиза, V0, 10-2, ч-1
ППIX	1,90 ± 0,027	11,9 ± 1,58	0,26±0,009
ФПП1	1,77 ± 0,015	70,5 ± 9,74	0,63±0,048
ФПП2	1.91 ± 0,020	129,7 ± 26,67	0,26±0,011
Альдегид	1,75 ± 0,021	217,0 ± 31,9	0,23±0,010
Контроль без ФС 0,21±0,008

*Приведена только та часть тетрапиррольного кольца, которая подвергалась модификации.

При сравнении темновых и фотогемолитических эффектов ФПП1 и альдегида, видно, что присутствие ОН-группы рядом с альдегидной (ФПП1) приводит к увеличению скорости темнового гемолиза на 200 %, а наличие только альдегидной группы увеличивает скорость темнового гемолиза лишь на 10 %. В то же время на фотогемолитическую эффективность ОН-группа влияет противоположным образом: а_Т альдегида в 3 раза больше, чем а_Т ФПП1.

Для определения влияния заместителя во втором положении тетрапирольного кольца на темновой и фотогемолитический эффекты были исследованы порфирины, содержащие б-аминофосфонатную группу во втором положении - АФ1 и АФ2 (см. табл. 3). б-Аминофосфонаты были включены в тетрапиррольное кольцо, т.к. это могло усилить фототоксические свойства порфиринов. Однако биологическая активность этих соединений до настоящего времени не была исследована.

При выбранной концентрации (2 мкМ) кривые как темнового, так и фотосенсибилизированного АФ1 гемолиза, оказались отличными от таковых для всех остальных сенсибилизаторов. Эти кривые приведены на рис. 3. Их сложная форма указывает на осуществление нескольких процессов, приводящих к гемолизу. Мы можем выделить две компоненты: “быстрый” гемолиз (ранний компонент) и “медленный” гемолиз (поздний компонент), как показано на рисунке 3 для кривой 1.

Рис. 3. Кривые гемолиза, сенсибилизированного АФ1.

Дозы облучения, кДж/м²:

1 - 0; 2 - 26,1; 3 - 34,8; 4 - 52,2.

Концентрация суспензии эритроцитов 1,7^.10⁷ кл/мл. Конечная концентрация АФ1 2 мкМ. Температура суспензии клеток 22 ⁰С.

Аналогичной двухкомпонентной формы получаются кривые гемолиза при добавлении к суспензии эритроцитов детергента Na-додецилсульфата (Na-ДДС) [Chernitskii et. al., 1996; Rideal, Taylor, 1958]. Можно предположить, что АФ1 обладает детергентоподобным гемолитическим действием, характери-зующимся наличием “быстрой” и “медленной” компонент.

Амплитуда “быстрого” гемолиза не зависела от дозы облучения: в этом процессе при любой дозе облучения участвовало около четверти всех эритроцитов суспензии (рис. 3, кривые 2-4). Облучение приводило к увеличению скорости обеих компонент. Фотогемолитические характеристики АФ1 мы определили для “быстрого” и “медленного” гемолиза отдельно (рис. 3).

Таблица 3. Сравнительные характеристики АФ1 и АФ2.

ФС*	Показатель степени при дозе облучения, b	Гемолитическая эффективность, нормированная к коэффициенту поглощения (1-Т)365 aT, 10-3, м4/кДж2ч	Скорость темнового гемолиза, V0, 10-2, ч-1
АФ1	“быстрый” гемолиз
	2 ?	497	49,3±2,73
	“медленный” гемолиз
	2 ?	45,9	6,03±0,133
АФ2	1,92±0,012	97,4±7,34	0,66±0,011
Контроль без ФС (с растворителем) 0,21±0,008

*Приведена только та часть тетрапиррольного кольца, которая подвергалась модификации.

Большим темновым эффектом обладает АФ1: скорость “медленной” компоненты темнового гемолиза по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов возрастает на 2800 %, а “быстрой” компоненты - еще больше. АФ2 увеличивает скорость темнового гемолиза на 210 %. По-видимому, такое различие в темновых эффектах связано с наличием ОН-группы в первом положении тетрапиррольного кольца рядом с аминофосфонатной группой у АФ1 (см. табл. 3). Фотогемолитические эффекты этих соединений по нашим оценкам (если принять величины b равными 2) различаются гораздо меньше. Более того, величина а_Т АФ1 (“медленная” компонента) в 2,2 раза меньше, чем таковая у АФ2.

Аналогичное влияние гидроксильной группы в первом положении тетрапиррольного кольца на темновое или фотогемолитическое действие ФС прослеживается при сравнении ФПП1 и альдегида. Видно (табл. 2), что усиление темнового эффекта наблюдается у ФПП1, содержащего гидроксильную группу, но при этом уменьшается его фотогемолитическое действие.

Сравнение АФ1 и ФПП1, а также АФ2 и альдегида, позволяет предположить, что наличие аминофосфонатной группы во втором положении тетрапиррольного кольца приводит к значительному увеличению темнового действия ФС. Тогда как замена аминофосфонатной группы на альдегидную группу приводит к увеличению фотогемолитической эффективности производных ППIX.

4. Влияние фотопродуктов ППIX на реакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей

Известно, что ФДТ часто сопровождается индукцией системной супрессии Т-клеточного звена иммунитета [Dougherty, 2002; Simkin et al., 1997]. В ходе проведения ФДТ происходит фотолиз ФС с образованием его стабильных фотопродуктов. Известно, что стабильные фотопродукты псоралена и мероцианина 540 могут окислять биологические мишени в ходе последующих темновых реакций [Potapenko, 1997; Потапенко и др., 2004], приводя к иммуносупрессии. Могут ли фотопродукты ППIX вносить вклад в супрессорное действие ФДТ остается не ясным. В этой связи была изучена способность продуктов фотолиза ППIX влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo, оцениваемый по реакции КЧ у мышей.

4.1. Супрессорное действие предоблученного ППIX и его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2 на реакцию КЧ к ДНФБ

Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили как в работах [Kim T.Y. et al., 1990; Yee G,K. et al., 1990], с незначительными модификациями (схема 1). Мышей линии СВА (самцы весом 18-20 г, возраст 8-10 недель) сенсибилизировали путем аппликации на выбритую кожу брюшка 50 мкл 0,3 % раствора ДНФБ в ацетоне. Через 144 часа после сенсибилизации на внутреннюю поверхность одного из ушей наносили разрешающую дозу ДНФБ (5 мкл 0,2 % раствора в ацетоне). На поверхность другого уха наносили 5 мкл растворителя (ацетона) в качестве контроля. Положительным контролем (К⁺) служили мыши, сенсибилизированные ДНФБ и получившие повторно аппликацию ДНФБ на ухо. Отрицательным контролем (К^-) служили интактные мыши, получившие только аппликацию ДНФБ на ухо. Через 24 часа оценивали интенсивность реакции КЧ по разнице отека опытного (аппликация ДНФБ) и контрольного (аппликация ацетона) ушей.

В экспериментальных группах (Е) мышам за 24 ч до сенсибилизации ДНФБ вводили в/в по 0,5 мл предоблученного раствора ППIX. В группах К⁺ и К^- вместо растворов ППIX мышам вводили 0,5 мл ФБР, содержащего 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола. Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле: % супрессии = [1 - (Е - К^-)/(К⁺- К^-)]•100%.

АБ

Рис. 4. Влияние предоблученного ППIX на КЧ к ДНФБ у мышей (А). Спектры поглощения ППIX в ходе его облучения (Б).

Раствор ППIX (10 мкМ в ФБР, содержащем 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола, облучали УФА-светом (28 Вт/м², 365 нм) при 22 ⁰С в течении разного времени.

А. Мышам вводили внутривенно по 0,5 мл облученного разными дозами раствора ППIX за 24 ч до сенсибилизации ДНФБ.

К⁺ (положительный контроль) и К^- (отрицательный контроль) - сенсибилизированные и интактные мыши, соответственно, получившие в/в 0,5 мл ФБР с 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола. Каждая точка на кривой - среднее для 10 мышей ± SEM.

*р < 0,001 по сравнению с К⁺.

Б. Фотолиз ППIX оценивали путем регистрации спектров поглощения облученных растворов (цифры у кривых - доза облучения раствора, кДж/м²). Толщина кюветы при регистрации спектров поглощения 1 см.

На рис. 4 видно, что введение животным необлученного ППIX не влияет на реакцию КЧ. Предоблученный же ППIX вызывает зависимую от дозы облучения супрессию реакции КЧ. При дозе облучения 200 кДж/м² супрессия составляет 61±13 %.

В ходе приготовления проб предоблученного ППIX для введения животным контролировали спектрофотометрически фотолиз раствора ППIX (рис. 4, Б). На этом рисунке видно, что фотолиз раствора ППIX приводил к появлению длинноволнового максимума (680 нм) в спектре поглощения, что указывает на образование преимущественно двух видов фотопродуктов - ФПП1 и ФПП2 [Wessels et al., 1993; Bagdonas et al., 2000; Juzenas et al., 2001; Theodossiou and MacRobert, 2002].

Предоблученный раствор ППIX (200 кДж/м², 10 мкМ) был проанализирован методом тонкослойной хромотографии (ТСХ) с использованием в качестве свидетелей аналитически чистых образцов ППIX, ФПП1 и ФПП2 (выполнено совместно с сотрудниками ИБМХ РАМН проф. Г.В. Пономаревым и к.х.н. В.И. Павловым). По данным ТСХ-анализа в образце предоблученного ППIX присутствовало три основных соединения (пятна на ТСХ-пластинке) - ППIX, ФПП1 и ФПП2 (данные не приводятся).

Анализ спектров поглощения предоблученного раствора ППIX (200 кДж/м²) показал, что суммарная концентрация ФПП1 и ФПП2 в этом образце составляет 0,51 мкМ.

На следующем этапе было изучено действие химически чистых фотопродуктов ППIX - ФПП1 и ФПП2, полученных методом химического синтеза, как описано в работе [Pavlov et al., 2003]. Инициацию реакции КЧ к ДНФБ у мышей проводили согласно схеме 1. Мышам вводили в/в по 0,5 мл эквимолярной смеси ФПП1 и ФПП2 (в ФБР, содержащем 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола) в различных концентрациях за 20 часов до сенсибилизации животных ДНФБ.

На рис. 5, А видно, что смесь ФПП1 и ФПП2 обладает супрессорным действием на КЧ. Величина супрессии определяется концентрацией фотопродуктов, и при концентрации 0,1 мкМ она составляла 65±13 %. Если сравнить данные рис. 4, А и 5, А, то видно, что степень супрессии КЧ, индуцированной при действии растворов предоблученного ППIX или смеси фотопродуктов ФПП1 и ФПП2 была практически одинаковой, если данные растворы содержали близкую концентрацию смеси ФПП1 и ФПП2 (0,1 мкМ). Отсюда можно заключить, что супрессорный эффект предоблученного ППIX на КЧ обусловлен действием только фотопродуктов ФПП1 и ФПП2. Осталось не ясным, какой из данных фотопродуктов более эффективен как супрессорный агент. Для ответа на этот вопрос сравнили влияние каждого из индивидуальных растворов ФПП1, ФПП2 и эквимолярной смеси этих фотопродуктов, приготовленных в одинаковых концентрациях на реакцию КЧ.

АБ

Рис. 5. Супрессорное действие на КЧ к ДНФБ ФПП1 и ФПП2.

Мышам за 20 ч до сенсибилизации ДНФБ в/в вводили по 0,5 мл:

А. эквимолярной смеси ФПП1 и ФПП2(1:1) в разных концентрациях;

Б. смеси ФПП1 и ФПП2 (1:1), ФПП1 или ФПП2 в концентрации 0,1 мкМ (в ФБР, содержащем 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола).

К⁺ (положительный контроль) и К^- (отрицательный контроль) - сенсибилизированные и интактные мыши, соответственно, получившие в/в 0,5 мл ФБР с 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола. Каждая точка - среднее в группе из 5-10 животных SEM.

*р<0,001 по сравнению с К⁺.

Видно (рис. 5, Б), что введение животным либо смеси ФПП1 и ФПП2, либо каждого из данных фотопродуктов в эквимолярных концентрациях супрессирует КЧ на 55-65 %. Таким образом эффективности супрессорного действия ФПП1 и ФПП2 были сравнимы. По-видимому это является следствием наличия одинаковых боковых заместителей в химической структуре данных соединений и, при этом локализация боковых групп в тетрапиррольном кольце не играет роли для проявления супрессорных свойств ФПП1 и ФПП2.

4.2. Иммунные механизмы супрессорного действия ФПП1 на КЧ

Действие ФПП1 на разные фазы развития КЧ

Известно, что развитие КЧ протекает в две стадии: афферентная (сенсибилизации) и эффекторная (разрешения) [Watanabe et al., 2002; Saint-Mezard et al., 2004]. Фазы сенсибилизации и разрешения наступают при первичном и повторном контакте кожи с гаптеном. Во всех экспериментах, приведенных в разделе 4.1. растворы фотопродуктов ППIX вводили мышам на фазе инициации КЧ, т.е. до сенсибилизации ДНФБ. Не ясно, обладают ли ФПП1 и ФПП2 супрессорной активностью на других фазах КЧ?

Для ответа на этот вопрос раствор ФПП1 вводили мышам в разное время относительно сенсибилизации ДНФБ. Было выявлено, что ФПП1 супрессирует КЧ на разных этапах (за 20 ч до или через 27, 80 или 122 ч после сенсибилизации) ее развития. Однако, полная супрессия КЧ (87 ± 15 %) наблюдалась, если ФПП1 вводили за 20 ч до сенсибилизации животных ДНФБ.

Эти данные не позволяют сделать вывод о механизме ограничения развития КЧ при действии ФПП1. Тем не менее, с учетом представленной в литературе информации о патофизиологических и иммунологических механизмах, обеспечивающих протекание реакции КЧ [Gorbachev and Fairchild, 2001a; Grabbe and Schwarz, 1998], можно предположить, что действие ФПП1 могло быть направлено на модуляцию (угнетение или активацию) функций иммунокомпетентных клеток, опосредующих или регулирующих развитие реакции КЧ.

Угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с супрессорным потенциалом

Известно, что развитие КЧ на ДНФБ опосредуют эффекторные АГ-специфические CD8⁺ Т-лимфоциты [Grabbe and Schwarz, 1998; Kobayashi et al., 2001; Li et al.,1994]. В этой связи нами была изучена возможность реализации супрессорного действия ФПП1 через угнетение функций АГ-специфических эффекторов КЧ. Реакция КЧ может быть перенесена от сенсибилизированного животного интактному (несенсибилизированному) АГ-специфическими Т-клетками, а не сывороткой [Black, 1999; Grabbe and Schwarz, 1998]. Поэтому, общепринятым подходом для выявления действия различных агентов, включая ФДТ, являются опыты по адоптивному переносу эффекторов КЧ [Simkin et al., 1997; Musser and Oseroff, 2001]. Данный подход был использован нами для выявления действия ФПП1 на эффекторные Т-лимфоциты КЧ (схема 2, А).

Для этого 0,5 мл раствора ФПП1 (0,1 мкМ в ФБР, содержащем 0,4 % этанола и 0,6 % ПЭГ) вводили внутривенно мышам-донорам за 21 час до сенсибилизации ДНФБ. Мышей-доноров сенсибилизировали путем накожной аппликации 0,3 % раствора ДНФБ в ацетоне. Через 142 часа после сенсибилизации ДНФБ выделяли спленоциты мышей-доноров, отмывали, после чего вводили 10⁸ этих клеток внутривенно сингенным интактным мышам-реципиентам. Через 2 часа вслед за этим мышей-реципиентов тестировали путем аппликации на ухо 5 мкл 0,2% ДНФБ. Через последующие 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов А. В группах сравнения мышам-донорам вводили внутривенно 0,5 мл растворителя (ФБР, содержащий 0,6 % ПЭГ и 0,4 % этанола).



На рисунке 6, А видно, что перенос спленоцитов сенсибилизированных доноров интактным мышам-реципиентам приводил к иммунизации последних, что проявлялось в развитии у мышей-реципиентов реакции КЧ при тест-аппликации ДНФБ (А, группа К⁺⁺(1)). Перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию ФПП1, интактным мышам-реципиентам подавлял практически полностью реакцию КЧ у последних (рис. 6, А). Следовательно, ФПП1 in vivo ослаблял функции эффекторов КЧ у мышей доноров, но оставалось неясным, может ли ФПП1 активировать клетки с супрессорным потенциалом.

В то же время известно, что ФДТ может ограничивать развитие КЧ путем активации таких иммунокомпетентных клеток [Gollnick et al., 2001; Musser and Oseroff, 2001]. Нами была изучена возможность активации клеток с супрессорными свойствами на КЧ под действием ФПП1 на модели адоптивного переноса супрессии КЧ (схема 2,Б). Реципиентами в этих экспериментах были ДНФБ-сенсибилизированные мыши.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. ФПП1 угнетает способность клеток-эффекторов переносить реакцию КЧ (А) и активирует клетки с супрессорным потенциалом (Б).

Эксперимент проводили по схеме 3. К⁺ и К^- - положительный и отрицательный контроли без адоптивного переноса клеток, соответственно. К⁺⁺(1) и К⁺⁺(2) - положительные контроли, в которых спленоциты сенсибилизированных ДНФБ мышей-доно-ров были перенесены интактным или ДНФБ-сенсибилизированным мышам-реципиентам, соответственно.

Каждая опытная и контрольная группа без переноса состояла из 5 животных. Каждая опытная и контрольная группа с адоптивным переносом состояла из 6 пар сингенных мышей-доноров и мышей-реципиентов. Представлено среднее SEM.

*р<0,001 по сравнению с соответствующим положительным контролем.

На рис. 6, Б видно, что перенос эффекторов КЧ мышей-доноров сенсибилизированным мышам-реципиентам увеличил интенсивность КЧ реципиентов (отек уха в группе К⁺⁺(2) больше, чем в К⁺⁺(1)). Перенос же спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию ФПП1, подавлял интенсивность КЧ сенсибилизированных мышей-реципиентов. Таким образом, после введения ФПП1 сенсибилизированным мышам-донорам в популяции спленоцитов появлялись клетки, угнетающие развитие КЧ при их адоптивном переносе сенсибилизированным реципиентам. Т.е. ФПП1 in vivo вызывал появление иммунокомпетентных клеток, обладающих супрессорной активностью.

В следующей серии экспериментов мы оценили специфичность супрессорного действия ФПП1 на КЧ. Для этого были проведены эксперименты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ с использованием двух разных гаптенов: ДНФБ и оксазолона (схема 3). Донорами, которым вводили ФПП1, в этих экспериментах служили ДНФБ-сенсибилизированные мыши. Тогда как реципиентами, которым переносили спленоциты от доноров были либо ДНФБ-сенсибилизированные (А), либо оксазолон-сенсибилизированные (Б) животные.



На рис. 7 видно, что введение мышам-реципиентам спленоцитов от доноров, получивших инъекцию ФПП1, приводило к супрессии реакции КЧ у реципиентов, сенсибилизированных как ДНФБ (А), так и оксазолоном (Б).



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7. ФПП1 вызывает адоптивно-переносимую супрессию реакции КЧ. Эта супрессия является неспецифичной.

А - перенос спленоцитов реципиентам, сенсибилизированным ДНФБ, Б - перенос спленоцитов реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном. К^?₁ и К⁺₁ - отрицательный и положительный контроли на ДНФБ в переносе. К^?₂ - отрицательный контроль на оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров к интактным реципиентам с последующим разрешением реакции КЧ оксазолоном). К⁺₂ - положительный контроль на оксазолон в переносе (перенос спленоцитов от ДНФБ-сенсибилизированных доноров к реципиентам, сенсибилизированным оксазолоном). *р<0,002 по сравнению с К⁺₁,**р<0,03 по сравнению с К⁺₂.

Таким образом, ФПП1 in vivo инициировал в селезенках сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров появление клеток, которые подавляли КЧ на чужеродный гаптен - оксазолон. Можно предположить, что клетками-супрессорами КЧ являются макрофаги, как описано в литературе для супрессии КЧ при ФДТ с гематопорфирином [Lynch et al., 1989].

Можно заключить, что супрессорное действие фотопродуктов ППIX является неспецифическим. ФПП1 in vivo активируют клетки с неспецифическим супрессорным потенциалом.

Выводы

1. Исследование фотогемолитической эффективности производных дейтеропорфирина IX (ДП) показало, что она возрастает в ряду:

2,4-тетраоксо-ДП (ДП1) < 2,4-дигидрокси-ДП (ДП2) < 4-гидрокси-ДП (ДП5) < 4-диоксо-ДП (ДП3) < 4-оксо-ДП (ДП4) < 2-диоксо-ДП (ДП6).

Все исследованные производные ДП увеличивают скорость темнового гемолиза не более чем в 7,3 раза, по сравнению со скоростью спонтанного гемолиза эритроцитов. 2- или 4-монозамещенные производные ДП являются более мембранофототоксичными по сравнению с 2,4-дизамещенными производными. Важную роль играет структура самих заместителей: производное ДП4 с оксогруппой в боковом заместителе имеет большую фотогемолитическую эффективность по сравнению с производным ДП5, имеющим ОН-группу в том же положении и производным ДП3 с двумя оксогруппами.

2. Разработана методика оценки прочности связывания ФС с мембранами эритроцитов, основанная на сравнении скоростей фотосенсибилизированного гемолиза в отмытой и не отмытой от ФС суспензиях эритроцитов. Значения коэффициента прочности связывания с мембраной (в), определенные для ДП5 и ДП2 составили 0,86 и 0,61, соответственно, что коррелирует со значениями их коэффициентов распределения в системе октанол/буфер. Однако, различия в фотогемолитических эффективностях этих производных ДП существенно больше, чем различия в величинах в. Это указывает на то, что прочность связывания ФС с мембранами не играет решающей роли в их фотогемолитическом действии.

3. Показано, что фотопродукты протопорфирина IX (ППIX) обладают мембранотоксическими свойствами. Фотогемолитические эффективности фотопротопорфирина 1 (ФПП1) и фотопротопорфирина 2 (ФПП2) превышают фотогемолитическую эффективность ППIX в 5 и 9 раз, соответственно. Удаление из молекулы ФПП1 ОН-группы приводит к снижению темновой эффективности и увеличению фотогемолитической эффективности.

4. Исследованы мембранотоксические эффекты порфиринов с аминофосфонатной групой во 2 положении тетрапирольного кольца: диметиловый эфир O,O-диэтил-(N-третбутил)-фосфонометил фотопротопорфирина IX (АФ1) и диметиловый эфир 3-[О,O-диэтил-(N-третбутил)-фосфонометил]-8-винил-дейтеропорфирина IX (АФ2). АФ1, содержащий ОН-группу в первом положении, в отличие от АФ2, обладает выраженным детергентоподобным темновым гемолитическим действием. Фотогемолитическая эффективность АФ2 в 2 раза больше, чем у АФ1.

5. Обнаружено, что предоблученный ППIX способен супрессировать Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. Глубина супрессии определялась дозой облучения ППIX .

6. Выявлено, что супрессорный эффект предоблученного ППIX обусловлен действием его фотопродуктов ФПП1 и ФПП2. ФПП1 и ФПП2 приводят к 60 % супрессии КЧ при введении данных соединений животным в количестве 2,5 нг/кг веса. В основе супрессорного действия фотопродуктов ППIX на КЧ лежит угнетение функций эффекторов КЧ и активация клеток с неспецифическим супрессорным потенциалом.

Практические рекомендации

Обнаруженные иммуносупрессорные эффекты ФПП1 и ФПП2 указывают на возможность разработки лекарственных препаратов, направленных на лечение заболеваний, обусловленных гиперреактивностью Т-клеточного звена иммунитета.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. I. V. Belichenko, A. A. Kyagova, N. N. Zhuravel, G. V. Mansurova, L. N. Bezdetnaya, F. Guillemin, S. Wunderlich, F. Pliquett, E. P. Lysenko, A. Ya. Potapenko. Photodynamic haemolysis sensitized by psoralen: effects of butilated hydroxytoluene. Phys. Chem. Biol. & Med., 2, № 3, 151-157, 1995.

2. I. Belichenko, S. Kirsten, G. Mansurova, L. Bezdetnaya, V. Melnikova, E. Lysenko, A. Potapenko, F. Guillemin. Biological testing of photobleaching of hematoporphyrin derivative (HpD) in solutions: hemolysis as a test system. 12th International Congress on Photobiology. September 1-6, 1996. Vienna, Austria. Abstracts. P. 312.

3. S. Kirsten, I. V. Belichenko, L. N. Bezdetnaya, G. V. Mansurova, A. Ya. Potapenko, F. Guillemin. Formation of biologically active porphyrin photoproducts as a result of hematoporphyrin derivative photobleaching in solution. Deutsche Gesellschaft fur Biophysik. Jahrestagung 1996. vom 18.-21. September 1996 an der Universitat Leipzig. P 135.

4. G. V. Mansurova, O. G. Pogrebnaya, G. V. Ponomarev, A. V. Reshetnickov, A. Ya. Potapenko, L. N. Bezdetnaya, F. Guillemin. Comparison of photoheolytic efficiencies of deuteroporphyrin-IX derivatives. http://www.photobiology.com/ photobiology2000/mansurova/index.htm

5. Г.В. Мансурова, О.Г. Погребная, Г.В. Пономарев, А.В. Решетников, А. Я. Потапенко, Л.Н. Бездетная, Ф. Гимя. Скрининг фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии по их фотогемолитической эффективности. III Съезд фотобиологов России. 28 июня-4 июля 2001 г. Воронеж. 2001. Материалы съезда. С. 133-134.

6. G. V. Mansurova, O. G. Pogrebnaya, G. V. Ponomarev, A. V. Reshetnickov, L. N. Bezdetnaya, F. Guillemin, A. Ya. Potapenko. A method of selection of sensitizers for photodynamic therapy by their photohemolytic efficiencies. 9^th Congress of the European Society for Photobiology. Lillehammer, Norway. 3-8 September 2001. Programme and Book of Abstracts. P. 204.

7. Kyagova A.A., Kozir L.A., Mansurova G.V., Zorin V.P. and A.Ya. Potapenko. Modulation of delayed type hypersensitivity in mice treated with photoproducts of various photosensitizers used in photodynamic therapy. Russ. J. Immunol., 2002. Vol. 7, No. 4, pp. 328-334.

8. Г.В. Мансурова, О.Г. Погребная, Г.В. Пономарев, А.В. Решетников, А.Я. Потапенко, Л.Н. Бездетная, Ф. Гимя. Фотогемолиз, сенсибилизированный производными дейтеропорфирина IX: определение прочности связывания красителей с эритроцитами. Биофизика, 2003, 48, № 2, 251-255.

9. A.Y. Potapenko, A.A. Kyagova, G.V. Mansurova, L.A. Kozir, V.Y. Pavlov, I.O. Konstantinov, G.V. Ponomarev. Suppression of contact hypersensitivity in mice by products of protoporphyrin IX photooxidation. 10^th Congress of the European Society for Photobiology. September 6-11, 2003. General Hospital Vienna, Austria. Programme and book of abstracts. P.50.

10. Мансурова Г.В., Козырь Л.А., Потапенко А.Я., Пономарев Г.В., Павлов В.Ю., Константинов И.О., Кягова А.А. Супрессорное действие продуктов фотоокисления протопорфирина IX на реакцию контактной чувствительности у мышей. III съезд биофизиков России. 24-29 июня 2004 г. Воронеж. Тезисы докладов. Том 2, стр. 544-545.

11. Potapenko A. Ya., Kozir L. A., Mansurova G. V., Kozhinova E. A., Ponomarev G.V., Kyagova A. A. Photooxidation products of photosensitizers are responsible for systemic immunomodulation. 1^st Internatiional Conference Skin & Environment. Moscow-St. Petersburg, Russia. 1-6 June, 2005. Program and book of Abstracts. P. 38.

12. Kyagova A.A., Mansurova G.V., Kozir L.A., Ponomarev G.V., Pavlov V.Y., Konstantinov I.O., Potapenko A.Y. Systemic Suppression of Contact Hypersensitivity by Products of Protoporphyrin IX Photooxidation. Photochem Photobiol. 2005, 81; 1380-1385.

Размещено на Allbest.ru

...