Применение клеточных культур фибробластов в лечении атрофических рубцов кожи (экспериментально-клиническое исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Применение клеточных культур фибробластов в лечении атрофических рубцов кожи (экспериментально-клиническое исследование)

14.00.11 - кожные и венерические болезни

14.00.15 - патологическая анатомия

кандидата медицинских наук

Золотовицкая Наталья Николаевна

Москва, 2007

Работа выполнена на базе ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Орлов Евгений Владимирович

доктор медицинских наук, доцент Колсанов Александр Владимирович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Курдина Мария Игоревна

доктор медицинских наук, профессор Туманов Владимир Павлович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 6 ноября 2007 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.03 при ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан 5 октября 2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук, профессор И.В. Хамаганова

атрофический рубец гистоморфологический фибробласт

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Проблема лечения больных с рубцовыми дефектами кожи относится к одному из актуальных разделов медицины (Картамышев А.И., 1953; Серебренников И.М., 1962; Давыдовский И.В., 1969; Мяделец О.Д., 1997; Белоусов А.Е., 1998; Озерская О.С., 2002, Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003). Причины возникновения рубцов разнообразны. Это - физические, механические и химические травмы, воспалительные процессы, кожные заболевания, хирургические вмешательства и другие факторы (Фисенко Г.И. с соавт., 2006). Ответ кожи на эти воздействия является стереотипным и выражается в заживлении дефекта рубцом при ее глубоком повреждении (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990).

Проблема рубцов является актуальной, т.к. их формирование приводит к деформации кожи и нарушению функции органа. При расположении рубцов в области лица отмечаются различного рода нарушения симметрии, мимики и формы (Серебренников И.М., 1962). По данным И.В. Борисевича, К.Н. Малахова (2005), среди обратившихся в косметологическое учреждение за помощью в возрасте до 20 лет, 46,2% имели рубцовые изменения на лице. Молодые люди очень переживают из-за образовавшегося дефекта. Это приводит к снижению социальной адаптации, как в личном, так и в профессиональном плане, изменениям в психоэмоциональной сфере, вплоть до суицида (Шамов С.А., 1982).

По клинико-морфологической классификации (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003) выделяют следующие типы рубцов: атрофические, нормотрофические, гипертрофические и келоидные.

Среди пациентов, обратившихся с проблемой лечения рубцов, нормо- и атрофические варианты наблюдаются наиболее часто, в 60,3% случаев (Озерская О.С., 2002). По данным Н.А. Данилина (2002), причиной нормо- и атрофических рубцов являются: последствия угревой болезни (65%), травмы (25%), швы после хирургических операций (7%), последствия инъекций кортикостероидов (3%).

В настоящее время предлагается большое количество методов лечения рубцов, не нуждающихся в хирургической коррекции. Для атрофических рубцов - это различные варианты пилингов (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003; Забненкова О.В., 2005; Glogau R., 1995; Rubin M.K., 1995; Fitzpatrick R.E., 1996), микрокристаллическая дермабразия (Короткий Н.Г. с соавт., 2001; Кадонцева Н., 2005; Tsai R.U. et al, 1995; Koch R.J., 2001), механическая дермабразия (Конченко Л.В., 1993; Коновалова Н.Н., 1999; Фисенко Г., 2003; Оrentreich N., 1995), лазерная дермабразия (Данилин Н.А., Доронин В.А., 2002; Белоусов А.Е., 2005; Lowe N.J. et al., 1995; Alster T.S., 1997; Goldman L., 1998). Все эти виды шлифовок приводят к некоторой сглаженности рубцов, но не решают проблемы полностью.

Несмотря на совершенствование методов лечения, результаты полностью не удовлетворяют ни врачей, ни больных. Это требует дальнейшего изучения, разработки и совершенствования методов лечения рубцов кожи.

Новые подходы к решению проблемы наметились с развитием биотехнологий получения клеточных культур кератиноцитов и фибробластов (Саркисов Д.С. с соавт., 1995; Туманов В.П., с соавт., 1996; Алексеев А.А., Яшин А.Ю., 1996; Алейник Д.Я. с соавт., 2000; Васильев А.В. с соавт., 2001; Smola H. еt al., 1993; Harris I.R. et al., 1995). Они позволяют влиять на морфологию рубцовой ткани, приближая ее к структуре нормальной дермы.

В связи с вышеизложенным, разработка новых методов лечения рубцов кожи является весьма актуальной.

Цель исследования. Повысить эффективность лечения больных с атрофическими рубцами кожи с использованием культуры дермальных фибробластов.

Задачи исследования.

1. Разработать модель формирования атрофических рубцов на коже животных в эксперименте и провести оценку морфологических изменений рубцовой ткани на различных этапах её развития.

2. Провести оценку гистоморфологических изменений рубцовой ткани под влиянием аутологичных и аллогенных фибробластов у экспериментальных животных.

3. Разработать методику лечения атрофических рубцов, развивающихся у больных с акне.

4. Оценить эффективность и безопасность применения дермальных аутофибробластов в процессе лечения атрофических рубцов кожи.

Научная новизна. Впервые разработана модель формирования атрофических рубцов на коже лабораторных животных. Изучены с помощью гистоморфологических методов, клеточный состав и структурные особенности рубцов данного типа, проведена оценка эффективности и обоснованности трансплантации дермальных фибробластов в рубцовую ткань у экспериментальных животных.

Впервые разработан и внедрен в клиническую практику способ лечения больных с атрофическими рубцами кожи с применением культуры аутологичных дермальных фибробластов.

Практическая значимость работы. Созданная в эксперименте модель атрофического рубца кожного покрова может быть использована при оценке эффективности различных методов местного лечения.

Разработанный и внедренный в клиническую практику метод лечения атрофических рубцов кожи с применением культуры дермальных аутофибробластов на 66,7% эффективнее по сравнению с традиционным лечением.

Разработанная методика является безопасной, т.к. не были выявлены осложнения на введение клеточной культуры. Достигнутые клинические результаты позволяют повысить качество жизни пациентов.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Разработана в эксперименте модель воспроизводства атрофических рубцов на коже крыс, изучены клеточный состав и морфологические особенности в различные сроки формирования рубца.

2. Разработан и внедрён в клиническую практику метод реабилитации больных с атрофическими рубцами, возникшими в результате угревой болезни.

Внедрение результатов исследования. Модель создания атрофического рубца кожи внедрена в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава».

Разработанный способ лечения атрофических рубцов используется в терапии больных с данной патологией в клинике кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава», ООО «Институт Красоты» (Самара), ГУЗ Самарский областной кожно-венерологический диспансер.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на 1-м Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005), на 2-м Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2006), научно-практической конференции «Медицинская косметология» (Самара, 2006), на Поволжском форуме «Восстановительная медицина, курортология и физиотерапия» (Самара, 2006), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007). Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры дерматовенерологии, кафедры общей хирургии с курсом оперативной хирургии, кафедры патологической анатомии, Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» (июнь 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в т.ч. 2 статьи в реферируемом журнале ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 408 источников, в том числе 207 отечественных и 201 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 48 рисунками.

Основное содержание работы

Характеристика объектов, материала и методов исследования. Диссертационная работа основана на результатах экспериментально-клинического исследования, направленного на изучение эффективности и безопасности лечения атрофического рубца кожи под воздействием клеточных культур фибробластов.

Экспериментальный раздел работы выполнен на базе Центральной научно-исследовательной лаборатории СамГМУ (директор - профессор, д.м.н. Л.Т. Волова) в рамках научной тематики ЦНИЛ: «Регуляция регенераторных процессов в опорных и покровных тканях организма за счет дифференцированного применения аллогенных тканей, культуры клеток, тканевых компонентов, лекарственных и немедикаментозных факторов воздействия». ЦНИЛ СамГМУ имеет лицензию (№ 9901002104 от 09.02.06), позволяющую в соответствии с Российским законодательством проводить работы с культурами нестволовых клеток.

Экспериментальные исследования проведены на 57-и белых лабораторных крысах обоего пола весом до 300 г. Все крысы проходили карантин в виварии, где они содержались в индивидуальных клетках, в закрытом, теплом помещении. Пищевой режим обычный.

Для оценки влияния культуры аутологичных и аллогенных фибробластов на лечение рубцового дефекта кожи всем 57-и крысам, участвующим в эксперименте были искусственно созданы модели кожных рубцов.

Модель рубца получали следующим образом. Животное обезболивали с помощью эфирного наркоза, фиксировали к операционному столу. Шерсть удаляли методом химической депиляции. Операционное поле обрабатывали 70% этиловым спиртом, затем проводили линейное рассечение кожи с подкожно-жировой клетчаткой до фасции длиной 5 см, в области спины. К краям раны (для предотвращения контракции) подшивали прямоугольную рамку из индифферентного синтетического материала, которую удаляли на 7-е сутки после начала эксперимента. У всех крыс рану закрывали стерильными салфетками. Через 28 дней рана заживала с образованием атрофического рубца.

Все животные, участвовавшие в эксперименте, были разделены на 3 серии. В первой серии (18 крыс) животными внутрикожным введением трансплантировали культуру аутологичных фибробластов; во второй серии (18 крыс) - в область рубца вводилась культура аллогенных фибробластов; в третьей серии (21 крыса) - рубцы не лечились и служили контролем. Трансплантация клеточной культуры проводилась 3-х кратно с интервалом 2 недели, начиная с 28-х суток после операции.

В течение всего срока эксперимента животных ежедневно осматривали, отмечали их общее состояние, активность, характер шерстяного покрова, состояние раны и рубца. Животные выводились из эксперимента на 7-е сутки после 1-й, 2-й, 3-й трансплантаций и через 2, 4, 8 недель после окончания лечения. Во все указанные сроки забирали материал для цитоморфологического исследования (таб.1).

Морфологический анализ осуществляли в области рубцового дефекта с прилежащей кожей. Серийные парафиновые срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, орсеином по Унна-Тенцеру для выявления эластических волокн. По всем сериям и срокам эксперимента было изготовлено и изучено - 564 гистологических препаратов. Гистологические срезы изучали, анализировали и фотографировали с помощью системы анализа изображений на базе Pentium 4, состоящей из светового микроскопа Olympus и цифрофой фотокамеры Olympus С 310.

Для объективизации морфологической картины работа была дополнена проведением морфометрии гистологических срезов. Измеряли толщину эпидермиса, дермы и гиподермы, считали суммарную плотность волосяных фолликулов в дерме с использованием аналитической системы визуализации «Видео Тест - Морфо» («ВТ - М» - Россия, г. Санкт - Петербург; рег. уд. МЗ РФ № 29/20010702/6102 - 04).

Таблица 1. Характеристика серий эксперимента на лабораторных животных и сроки взятия биопсии

Серии животных Сроки биопсии	Животные после трансплантации аутологичных фибробластов (1 серия)	Животные после трансплантации аллогенных фибробластов (2 серия)	Животные без лечения (3 серия)	всего
Рубец 28 суток без лечения	-	-	3	3
Рубец 35 суток, через 7 суток, после 1-й трансплантации	3	3	3	9
Рубец 49 суток, через 7 суток после 2-й трансплантации	3	3	3	9
Рубец 63 суток, через 7 суток после 3-й трансплантации	3	3	3	9
Рубец 70 суток, через 14 суток после 3-й трансплантации	3	3	3	9
Рубец 84 суток, через 28 суток после 3-й трансплантации	3	3	3	9
Рубец 102 суток, через 56 суток после 3-й трансплантации	3	3	3	9
Всего	18	18	21	57

Первичную культуру фибробластов получали по общепринятой методике первичных эксплантов (Адамс Р., 1983; Гринберг К.Н. с соавт., 1988; Парамонов Б.А. с соавт., 2000).

Весь цифровой материал исследований на лабораторных животных обработан с помощью метода вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Значимость отличий средних арифметических опыта и контроля оценивалась при постоянно заданном уровне значимости (р < 0,05).

Клинический раздел работы основан на результатах лечения 61 пациента с атрофическими рубцами постакне, проходившим амбулаторное лечение в косметологическом отделении ООО «Институт Красоты» (Самара). В клинической практике определена эффективность интрадермальной трансплантации культуры аутологичных фибробластов по сравнению с традиционным лечением методом химического пилинга на основе 15% трихлоруксусной кислоты, «модифицированной».

Критериями включения пациентов в группы сравнения были: атрофические рубцы постакне, наличие информированного добровольного согласия пациента.

Критериями исключения пациентов из основной группы являлись: тяжелые хронические заболевания, острые и хронические заболевания кожи, наличие злокачественного новообразования, беременность и лактация, курение и нежелание отказа от него на период лечения.

Критериями вывода пациентов из основной группы являлись: требование пациента об отказе от исследования на любом его этапе, заключение врача о неблагоприятном влиянии проводимой терапии на пациента, индивидуальная непереносимость.

При проведении исследования проводилась оценка безопасности трансплантации культуры аутологичных фибробластов.

Оценивался вид реакции на введение клеточной культуры: фармацевтическая (за счет неклеточных компонентов препарата), фармакодинамическая (прямое действие клеток), токсическая воспалительная реакция кожи, острая аллергическая, отсроченная аллергическая.

Степень тяжести реакции оценивалась как: легкая, умеренная, тяжелая, очень тяжелая.

Определялась степень достоверности побочной реакции клеточного материала по следующей градации: прямая степень достоверности, вероятная степень достоверности, возможная степень достоверности, сомнительная степень достоверности, отсутствие связи побочной реакции с введением препарата, серьезная побочная реакция, представляющая угрозу жизни пациента SAE!

Для клинико-диагностической оценки эффективности проводимой терапии использовались следующие критерии:

Отличный результат: выравнивание «минус-ткани» на уровне с нормальной кожей, нормальный цвет рубца.

Хороший результат: выравнивание «минус-ткани» на 50% и более, нормальный цвет рубца.

Удовлетворительный результат: выравнивание микрорельефа кожи и уменьшение глубины рубца менее чем на 50%.

Неудовлетворительный результат: отсутствие выравнивания «минус-ткани».

Оценку результатов проводили после окончания лечения, а также 1, 3 и 6 месяцев спустя.

Переносимость клеточного материала и выраженность возможных нежелательных реакций на клеточный материал (побочных эффектов) при лечении оценивалась по бальной шкале:

- 0 баллов (побочных действий нет);

- 1 балл (побочное действие есть, субъективно не ощущается, регистрируется врачом, не опасно и не требует отмены введения культуры клеток);

- 2 балла (побочное действие есть, субъективно ощущается, регистрируется врачом, не опасно и требует отмены введения культуры клеток);

- 3 балла (побочное действие есть, субъективно ощущается, регистрируется врачом и требует лечения).

При лечении больных применяли культуру аутологичных фибробластов кожи, использование которых одобрено Этическим комитетом на заседании № 34 от 21.09.05 и Ученым советом ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» от 29.10.2004 (протокол №3).

Клеточную культуру дермальных аутофибробластов получали по стандартной технологии в лаборатории культур клеток ЦНИЛ СамГМУ.

Перед выдачей клеточной культуры проводили контроль контаминации на ВИЧ, сифилис, вирусные гепатиты В и С, микоплазму, цитомегаловирус, герпес методом ПЦР и ИФА. На каждый клеточный материал выдавался паспорт. Для трансплантации использовали культуру 4-10 пассажей в виде суспензии, в физрастворе.

В группы сравнения вошел 61 пациент с атрофическими рубцами постакне с локализацией на лице. В основной группе было 30 человек, группу сравнения составил 31 больной, с сопоставимой патологией.

Все пациенты имели множественные депрессированные рубцы в виде ямок, диаметром от 1,5 до 5-6 мм. Местами они сливались с образованием рубцового дефекта с фестончатыми краями.

По степени зрелости выделяли «молодые» рубцы, со сроком существования от 3 до 12 месяцев и «старые» или «окончательно зрелые», со сроком существования 1 год и более. По степени зрелости рубцы распределились таким образом.

В основной группе 16 человек (53,3 %) имели «молодые» рубцы, а 14 человек (46,7%) - «старые» рубцы.

В группе сравнения 15 человек (48,4%) имели «молодые» рубцы, а 16 человек (51,6%) - «старые» рубцы (таб. 2).

Таблица 2. Распределение пациентов в группах наблюдения

	Основная группа	Группа сравнения
Больные с «молодыми» рубцами	16	15
Больные со «старыми» рубцами	14	16
Всего	30	31

У всех пациентов в обеих группах сравнения рубцы локализовались на лице и являлись эстетически неприемлемыми. Субъективные ощущения в области рубцов и признаки воспалительного процесса на лице отсутствовали.

Проанализировав известные на сегодня методы лечения атрофических рубцов кожи, мы выбрали неинвазивный, современный, не дающий серьезных осложнений метод - химический пилинг на основе 15% трихлоруксусной кислоты (ТСА), «модифицированной». По глубине проникновения пилинг был срединным.

Пациентам из группы сравнения (31 человек), с целью выравнивания рельефа кожи в области рубцов, проводили местное лечение по предложенному способу. Пилинг проводился 4-х кратно с интервалом в 2 недели, затем через 6 недель курс повторяли. Лечение в данной группе на этом было закончено.

Пациентам основной группы (30 человек) с целью улучшения внешнего вида рубцов проводили трансплантацию аутологичных фибробластов в рубцовую зону. В условиях асептики, без предварительной анестезии клеточный препарат вводился в область рубцов интрадермально, инъекционным способом, с помощью шприца. Использовалась папульная техника введения, по методике мезотерапии. Курс лечения состоял из 3-х процедур с интервалом введения 1 месяц.

Общее лечение в обеих группах было одинаковым и заключалось в назначении комплекса витаминов и микроэлементов необходимых для синтеза коллагена и нормальной регенерации кожи: К, Mg, Zn, Cu, Se, витамины: А, Е, С. Препараты назначались per os в период всего лечения рубцов.

Для объективизации процесса лечения и оценки состояния рубцовой ткани применялся метод двухмерного ультразвукового сканирования кожи. При ультразвуковом дермосканировании кожи в области рубцов постакне отмечалось истончение эпидермиса, в дермальном слое визуализировались гипоэхогенные участки.

Полученные результаты и их обсуждение

Результаты экспериментальных исследований

При морфологическом исследовании рубцов кожи лабораторных крыс до и после трансплантации дермальных фибробластов были выявлены следующие изменения.

Экспериментальный рубец на 28-е сутки имеет линейную форму, широкий, располагается несколько ниже уровня нормальной кожи, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. В этой зоне волосяной покров отсутствует. При исследовании гистологических препаратов мы отметили сглаженность и истончение эпидермиса в зоне экспериментального рубца:19,25 ± 1,30 мкм; при норме 40,83±2,35 мкм (р<0,05). В нем удается четко дифференцировать только базальный и роговой слои. При окраске орсеином наблюдаем нечетко контурирующую базальную мембрану, резкую сглаженность и уплощение сосочков дермы. При окраске пикрофуксином по ван Гизон видно, что коллагеновые волокна дермы тоньше, чем в норме. Они располагаются параллельно базальной мембране в прилежащих к рубцу областях, а в центре рубца как перпендикулярно базальной мембране, так и неупорядоченно, хаотично. Дерма в области рубца отечна, что выражается увеличением ее толщины: 1018,00±98,20 мкм; при норме 604,30±58,43 мкм (р<0,05) и наличием многочисленных полостей между волокнами и в интерстициальном пространстве. В самом рубце кожные дериваты отсутствуют. В сосочковом слое дермы отмечается интенсивная клеточная инфильтрация нейтрофилами, моноцитами и макрофагами. Подкожно-жировая клетчатка истончена и атрофична, ее толщина составляет 102,00±11,23 мкм; при норме - 558,40±42,53 мкм (р<0,05).

В середине эксперимента, на 63-и сутки рубец без лечения макроскопически имеет линейную форму, располагается ниже уровня нормальной кожи, достаточно широкий, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. Волосяной покров на самом рубце - отсутствует. Микроскопически сохраняется истончение эпидермиса (23,81±2,01 мкм; р< 0,05), по-прежнему наиболее выражены базальный и роговой слои. Сосочки дермы сглажены. В дерме клеточная инфильтрация, представленная как макрофагами, так и молодыми фибробластами, выражена меньше и в целом толщина дермы снижается и составляет 813,00±81,50 мкм (р<0,05). Отмечается более активное по сравнению с предыдущим сроком формирование кожных придатков - идет образование волосяных луковиц с зачатками волос, но этот процесс представлен в основном на ранних стадиях. Общая плотность волосяных фолликулов снижена и составляет 1,61±0,32%; при норме 3,31±0,31% (р<0,05). Молодые коллагеновые волокна в области послеоперационного рубца неупорядочены, расположены хаотично. Кровеносных сосудов в дерме и гиподерме обычное количество, их просвет не расширен. Подкожно-жировая клетчатка по-прежнему истончена и атрофична (105,70±9,70 мкм; р<0,05).

Рубец на 63-и сутки, после введения аутофибробластов (7-е сутки после 3-ей трансплантации). Макроскопически имеет линейную форму, располагается на уровне здоровой кожи, имеет вид тонкой линии, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. Микроскопически на данном сроке лечения отмечается бурная регенерация всех слоев кожи. Характерно восстановление толщины всех слоев эпидермиса и возрастание его общей толщины до нормы 39,15±2,69 мкм. Толщина дермы снижается за счет полного исчезновения явлений посттравматического отёка и составляет 932,60±98,00 мкм (р<0,05). Архитектоника сосочков дермы восстанавливается, они незначительно вдаются в базальную мембрану, благодаря чему её рельеф становится извилистым. В сосочковом слое в зоне рубца определяются очаги повышенной клеточности за счет скопления молодых фибробластов. Во всех слоях дермы видно большое количество новообразованных кожных дериватов на разных стадиях развития - характерен активный рост формирующихся волос к поверхности кожи. Их плотность возрастает до 21,16 ± 1,21% (р< 0,05), что подтверждает мощное стимулирующее влияние имплантированных фибробластов на регенерацию волосяных фолликулов. Молодые коллагеновые волокна имеют несколько неупорядоченное направление в зоне регенерата, и упорядоченное - в окружающих регенерат зонах. Идет активная регенерация мышечных волокон с восстановлением мышечного слоя. В подкожно-жировой клетчатке большое количество активно пролиферирующих фибробластов и молодых коллагеновых волокон. Толщина гиподермы снижена и составляет 251,18±21,69 мкм (р< 0,05). Кровеносных сосудов умеренное количество, их просвет не расширен.

Рубец на 63-и сутки, после введения аллофибробластов (7-е сутки после 3-ей трансплантации). Макроскопически имеет линейную форму, располагается ниже уровня здоровой кожи, имеет вид тонкой линии, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. На гистологических микропрепаратах также отмечается активная регенерация всех слоев кожи. Эпидермис имеет меньшую толщину, чем в норме (29,99±2,8 мкм; р<0,05), но количество его слоёв восстанавливается. Рельеф базальной мембраны начинает восстанавливаться за счет формирования дермальных сосочков, но они по-прежнему сглажены по сравнению с нормой. Толщина дермы приближается к интактной и составляет 694,00±66,08 мкм. Общая морфологическая картина схожа с регенерацией леченного рубца того же срока с введением аутофибробластов, но формирующиеся придатки кожи находятся в основном на более ранних сроках развития - в зоне регенерата нет волос, достигших поверхности кожи. Однако плотность волосяных фолликулов также значительно выше нормы и составляет 15,75±1,42% (р<0,05). Регенерация мышечных и коллагеновых волокон идет аналогично лечению с использованием аутофиброластов. Толщина слоя подкожно-жировой клетчатки возрастает, но не достигает нормы (245,00±18,22 мкм; р<0,05).

В конце эксперимента, на 102-е сутки рубец без лечения имеет вид широкой линии, лежащей на уровне поверхности кожи, белого цвета, незначительно отличающегося от цвета окружающей нормальной кожи. Отмечается отсутствие волосяного покрова на самом рубце.

В эпидермисе четко визуализируются все четыре слоя, но число клеточных рядов в них по-прежнему уменьшено, поэтому общая толщина эпидермиса остается ниже нормы и составляет 30,84±1,47 мкм (р<0,05).

Регенерация коллагеновых и мышечных волокон продолжается в виде процессов перестройки направления их хода и пространственной ориентировки. Тем не менее, в зоне рубца по-прежнему многие коллагеновые волокна так и не достигают хода, параллельного поверхности кожи, и располагаются неупорядоченно, хаотично. Общая толщина дермы снижается по сравнению с предыдущими сроками и составляет 787,00±74,80 мкм (р<0,05). Дериваты кожи на данном сроке продолжают свое развитие и созревание - плотность волосяных фолликулов сохраняется ниже нормы и составляет 1,82 ± 0,50 % (р<0,05). Выявляются также единичные случаи волосяных луковиц и желез на ранних стадиях развития, что соответствует уже не репаративной, а текущей физиологической регенерации. Подкожно-жировая клетчатка слабо выражена, ее толщина составляет 201,10±18,05 мкм (р<0,05). Мышечные волокна нормальных размеров и структуры. Отмечается разрастание соединительно-тканных прослоек, в которых встречающиеся в небольшом количестве сосуды имеют нормальный просвет.

Рубец на 102-е сутки, после введения аутофибробластов (56-е сутки после 3-ей трансплантации). Рубец имеет вид очень тонкой, едва различимой линии, находящейся на одном уровне и имеющей одинаковый цвет с окружающей интактной кожей. Отмечается полное восстановление волосяного покрова в месте операционного вмешательства.

Микроскопическая картина кожи в зоне рубца приближается к норме. В области рубца выражены все слои эпидермиса, его толщина соответствует нормальным значениям и составляет 39,37±3,36 мкм.

Толщина дермы по-прежнему превышает норму за счет активно идущих регенераторных процессов и формирования новых клеточных элементов и равна 943,00±97,50 мкм (р<0,05). Сосочки дермы хорошо выражены, вдаются в эпидермис. Базальная мембрана по структуре соответствует интактной. В дерме полностью завершается созревание волосяных фолликулов и сальных желез, волосы выходят на поверхность кожи. Общая плотность волосяных фолликулов по-прежнему превышает норму и составляет 22,85±1,81% (р<0,05), что говорит о сохраняющемся высоком уровне регенераторных процессов. Коллагеновые волокна - зрелые, извитые, нормальной толщины, имеют упорядоченное направление и ход. Кровеносные сосуды имеют размеры и форму, соответствующие интактным, просвет не расширен, их количество идентично здоровой коже. Морфологическая структура подкожно-жировой клетчатки и адипоцитов соответствует норме, но ее толщина снижена и составляет 281,30±25,57 мкм (р<0,05). Характерным является продолжение регенераторных процессов, в которых активная репаративная регенерация сосуществует с не менее активной физиологической, что подтверждается наличием наряду со зрелыми кожными дериватами большого количества молодых, формирующихся придатков кожи.

Рубец на 102-е сутки, после введения аллофибробластов (56-е сутки после 3-ей трансплантации). Рубец имеет вид тонкой, но более заметной (чем при введении аутофибробластов) линии, находящейся на одном уровне и имеющей одинаковый цвет с окружающей интактной кожей. Наблюдается полное восстановление волосяного покрова в месте операционного вмешательства.

На микропрепаратах динамика морфологических изменений во многом сходна с рубцом после трансплантации культуры аутофибробластов. Результаты лечения путем введения аллофибробластов менее выражены, чем при введении аутофибробластов, но лучше, чем в контрольной серии без лечения. Микроскопически это проявляется восстановлением толщины эпидермиса до нормы - 37,92±3,05 мкм. Толщина дермы выше, чем в норме и составляет - 985,60±68,27 мкм (р<0,05). Общая плотность волосяных фолликулов превышает норму и равна 16,28 ± 0,78 % (р<0,05), что подтверждает сохранение активного новообразования и регенерации волосяных фолликулов с их дальнейшим созреванием и развитием. Коллагеновые волокна - зрелые, извитые, нормальной толщины, имеют упорядоченное направление и ход. Количество кровеносных сосудов, их размеры и форма идентично здоровой коже. Морфологическая структура подкожно-жировой клетчатки и адипоцитов соответствует норме. Толщина гиподермы снижена и составляет 237,87 ± 10,23 мкм (р<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты показали, что после лечения кожных рубцов путем введения фибробластов:

1. Структура зоны рубца приближается к структуре нормальной кожи за счет активных процессов регенерации.

2. К концу эксперимента в обеих сериях опытов с введением фибробластов отмечается полное восстановление толщины эпидермиса (39,37 ± 3,36 мкм при введении аутофибробластов и 37,92 ± 3,05 мкм при введении аллофибробластов; при норме 40, 83 ± 2,35 мкм), в то время как в рубце без лечения этот показатель остается ниже нормы (30,84 ± 1,47 мкм; р<0,05).

3. В обеих опытных сериях с введением фибробластов на всех сроках наблюдается активное формирование кожных дериватов - волосяных фолликулов и сальных желез с полным восстановлением волосяного покрова. Плотность волосяных фолликулов к 102-м суткам наблюдения составляет: 22,85 ± 1,81% при введении аутофибробластов, 16,28 ± 0,78% при введении аллофибробластов, при норме 3,31 ± 0,31%, в то время как в рубце без лечения этот показатель остается ниже нормы - 1,82 ± 0,50 % (р<0,05).

4. При введении аутофибробластов все регенераторные процессы более выражены, чем при введении аллофибробластов. Это подтверждается более ранним восстановлением нормальных величин толщины эпидермиса (на 63-и сутки по сравнению со 102-ми сутками); большей плотностью (на 29%) волосяных фолликулов к концу эксперимента; более полноценным восстановлением дермы в зоне рубца с формированием сосочкового и сетчатого слоев.

Учитывая результаты экспериментального исследования, биоэтические и юридические аспекты, для проведения клинического исследования мы остановились на применении культуры аутологичных фибробластов.

Результаты клинических результатов

В качестве традиционного способа выравнивания рельефа атрофических рубцов кожи мы применили методику срединного пилинга на основе 15% ТСА (трихлоруксусной кислоты), «модифицированной».

С этой целью всем пациентам из группы сравнения (31 человек) было проведено 2 курса срединного пилинга на основе 15% ТСА, «модифицированной» с интервалом в 6 недель. В процессе проведения одного курса пилинга (4 процедуры с интервалом в 14 дней) были получены следующие результаты:

- отличный результат - 0 пациентов (0%),

- хороший результат - 0 пациентов (0%),

- удовлетворительный результат - 8 пациентов (25,8%),

- неудовлетворительный результат - 23 пациента (74,2%).

Затем был проведен еще один курс пилинга. Повторный курс повысил результаты лечения:

- отличный результат - 0 пациентов (0%)

- хороший результат - 0 пациентов (0%),

- удовлетворительный результат - 16 пациентов (51,6%),

- неудовлетворительный результат - 15 пациентов (48,4%).

Таким образом, у 16 пациентов (51,6%) из группы сравнения, после 2-х курсов пилинга был достигнут удовлетворительный результат. Рубцы приняли более сглаженный вид и несколько уплотнились. В таком виде рубцы стали доступными для косметического камуфляжа. У 48,4% пациентов рубцовые изменения остались без клинической динамики (рис.1).

Рис. 1. Сравнительные результаты эффективности различных вариантов лечения.

Пациентам основной группы (30 человек) была введена клеточная культура. В условиях асептики, без предварительной анестезии клеточный препарат вводился интрадермально, инъекционным способом. Использовалась папульная техника введения, по методике мезотерапии. Количество клеток в препарате варьировалось в зависимости от площади рубцовой поверхности, и составляло в среднем от 1 до 10 млн. Объем вводимого препарата составлял от 1 до 5 мл. Курс состоял из 3-х процедур с интервалом введения 1 месяц.

Через 6 месяцев после проведенного лечения, в основной группе были отмечены следующие результаты (рис.1):

- отличный результат - 12 пациентов (40%),

- хороший результат - 8 пациентов (26,7%),

- удовлетворительный результат - 10 пациентов (33,3%),

- неудовлетворительный результат - 0 пациентов (0%).

Таким образом, трансплантация аутофибробластов значительно повысила результаты лечения в основной группе. Количество «отличных» и «хороших» результатов увеличилось с 0% до 40% и 26,7% соответственно, количество неудовлетворительных результатов уменьшилось с 48,4% до 0% (рис. 1).

У 16-и пациентов основной группы имеющих «молодые» рубцы, клиническая эффективность проводимой терапии начинала проявляться через 1 месяц после начатого лечения и постепенно нарастала, достигая стойкого клинического эффекта к концу 3-6 месяца. При «отличном» результате это выражалось в выравнивании дна рубцов практически с уровнем здоровой кожи, при «хорошем» - в выравнивании «минус-ткани» на 50% и более. Цвет кожи, ее эластичность, тургор в области лечения рубцов был сопоставим с окружающей здоровой кожей. Этот клинический эффект наблюдался на 90-95 % пролеченной поверхности рубцов.

При сравнении результатов лечения у пациентов основной группы с «молодыми» рубцами (16 человек) с группой сравнения результаты оказались еще выше. «Отличный» результат был у 12-и пациентов (75%) этой подгруппы, «хороший» результат - у 4-х пациентов (25%), (рис.2).



Рис. 2. Сравнительные результаты эффективности различных вариантов лечения.

У пациентов со «старыми» рубцами (14 человек) положительная динамика развивалась медленно. Первые изменения были заметны лишь через 3 месяца после окончания лечения, достигая клинического эффекта к концу 6 месяца. Это выражалось в уплощении рубцов, в основном за счет эффекта «лифтинга» здоровой кожи. Эффективность проведенного лечения оценивалась через 6 месяцев после окончания лечения, при этом отмечались следующие результаты:

- отличный результат - 0 пациентов (0%).

- хороший результат - 4 пациента (28,6 %),

- удовлетворительный результат - 10 пациентов (71,4%),

- неудовлетворительный результат - 0 пациентов (0%).

Прослеживалась взаимосвязь между степенью улучшения внешнего вида рубца и сроком его существования. Чем меньше, срок существования рубца («молодой рубец», до 1 года), тем лучше достигались результаты.

По результатам ультразвукового дермосканирования после проведения курса трансплантации аутофибробластов толщина дермы и эпидермиса увеличилась по сравнению с исходным состоянием. У пациентов с «молодыми» рубцами отмечено увеличение толщины эпидермиса, усиление плотности дермы и исчезновение гипоэхогенных участков в области рубцов. У пациентов со «старыми» рубцами отмечено усиление плотности дермы в области здоровой кожи, с чем и связан «лифтинговый» эффект и опосредованное разглаживание рубцов.

Таким образом, фибробласты восполняя клеточную популяцию дермы способствовали синтезу коллагена, эластина, гликозаминогликанов, новообразованию сосудов и улучшали трофику рубцовой ткани и прилегающих участков кожи.

У пациентов группы сравнения (31 человек), результаты лечения после проведения курса пилинга в течение всего срока наблюдения не изменились. Срок наблюдения за пациентами составлял от 1 года до 1,5 лет.

В рамках данного исследования мы проводили оценку безопасности использования клеточной культуры и риск возникновения осложнений. Оценку безопасности применения проводили в день первого введения, через 14 суток, 1, 3, 6 и 12 месяцев.

Мы не отметили в процессе исследования фармацевтической (за счет неклеточных компонентов препарата), фармакодинамической (прямое действие клеток), токсической воспалительной реакции кожи, острой и отсроченной аллергических реакций.

У всех 30 пациентов (100%) на всех сроках наблюдения, не было отмечено появления побочного действия от введения клеточной культуры как местного, так и системного характера (0 баллов). Субъективно пациенты ничего не ощущали, жалоб не предъявляли. Зуд и высыпания отсутствовали. Повышение температуры не отмечалось. Следы от инъекций проходили самостоятельно в течение 1,5-2 часов после трансплантации. Данные наблюдения подтверждают безопасность применения клеточного препарата, содержащего дермальные аутофибробласты человека.

Эти сравнительные данные свидетельствуют о том, что предложенный способ лечения атрофических рубцов, позволил значительно (на 66,7%) улучшить результаты терапии по сравнению с традиционным лечением. Максимальный эффект от данного способа лечения мы наблюдали у пациентов с «молодыми» рубцами, при трансплантации культуры аутофибробластов в область «старых» рубцов мы выявили её значительно меньшую эффективность.

Выводы

1. Разработанный способ моделирования рубца кожи приводил к формированию атрофического рубца к 28-м суткам с момента операции у всех экспериментальных животных, что подтверждалось клинически и при морфологической оценке рубцово-изменённой ткани.

2. Введение культур ауто- и аллофибробластов в область рубца у экспериментальных животных вызывало активную регенерацию эпидермиса и дермы (на 63-и сутки по сравнению со 102-ми сутками). Регенераторные процессы при введении аутофибробластов более выражены, чем при введении аллофибробластов, что подтверждалось более ранним восстановлением толщины эпидермиса и дермы (на 63-и сутки по сравнению со 102-ми сутками), большей плотностью волосяных фолликулов (на 29%), более полноценным восстановлением дермы с формированием сосочкового и сетчатого слоев.

3. Интрадермальная трансплантация культуры аутологичных фибробластов у пациентов атрофическими рубцами постакне позволяет значительно (на 66,7%) улучшить результаты лечения по сравнению с традиционной терапией, что было установлено на основании клинических и инструментальных исследований.

Наиболее эффективно (на 71,4%) проведение интрадермальной трансплантации культуры аутологичных фибробластов у больных с «молодыми» атрофическими рубцами со сроком существования до 1-го года.

4. Методика внутрикожной трансплантации культуры аутофибробластов является простой при выполнении и безопасной для пациентов.

Практические рекомендации

1. Разработанный способ местного лечения атрофических рубцов с использованияем культуры аутофибробластов может быть использован в дерматокосметологической практике.

2. Показанием для трансплантации клеточной культуры аутологичных фибробластов является наличие атрофических рубцов постакне.

3. Противопоказаниями для трансплантации клеточной культуры аутологичных фибробластов являются: тяжелые хронические заболевания, аутоиммунные заболевания, острые и хронические заболевания кожи, наличие злокачественного новообразования, беременность и лактация, курение и нежелание отказа от него на время лечения.

4. Аутофибробласты вводятся с помощью множественных интрадермальных инъекций, методом мезотерапии, шприцом в сосочковый слой дермы.

5. Культура фибробластов вводится 3-х кратно с интервалом в 1 месяц, в дозе от 1 до 10 млн. клеток (в физиологическом растворе) в зависимости от состояния рубца и окружающей его кожи, от площади рубцовой поверхности.

6. Оптимальные результаты достигаются при лечении «молодых» рубцов, со сроком существования до 1-го года.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Золотовицкая Н.Н. Изучение заживления ран кожного покрова при использовании культуры фибробластов / Дорожкина Е.Б., Колсанов А.В. // Труды 1-го международного форума «Актуальные проблемы современной науки», Самара, 12-15 сентября 2005г. - Самара, 2005. - С. 205-207.

2. Золотовицкая Н.Н. Экспериментально-клиническая оценка эффективности применения культуры фибробластов / Колсанов А.В., Иванова В.Д., Волова Л.Т., Дорожкина Е.Б. // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия: Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов в составе ВНОАГЭ. Приложение к журналу «Морфологические ведомости». - Вып. 6-й. - 2006. - С. 68-73.

3. Золотовицкая Н.Н. Применение клеточной культуры фибробластов в терапии рубцовых дефектов кожи / Сахипов Д.Р. // Материалы 7-го конгресса молодых ученых и специалистов, Томск, 18-19 мая 2006 г. - Томск, 2006. - С.105-107.

4. Золотовицкая Н.Н. Экспериментальное обоснование применения культуры фибробластов при рубцовых деформациях кожи / Колсанов А.В., Волова Л.Т., Белозерцева Е.А. // Труды Поволжского форума по восстановительной медицине, курортологии и физиотерапии, Самара, 12-13 сентября 2006 г. - Самара, 2006. - С.54-56.

5. Золотовицкая Н.Н. Лечение атрофических рубцов кожи с применением культуры фибробластов // Труды 2-го международного форума «Актуальные проблемы современной науки», Самара, 20-23 ноября 2006 г. - Самара, 2006. - С. 23-25.

6. Золотовицкая Н.Н. Результаты применения культуры фибробластов у пациентов с атрофическими рубцами кожи // «Аспирантские чтения 2006». Труды межвузовской конференции молодых ученых. Приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья» - Самара, 2006. - С.85-87.

7. Золотовицкая Н.Н. Лечение рубцовых дефектов кожи с применением клеточных культур фибробластов / Колсанов А.В., Волова Л.Т., Орлов Е.В., Толстов А.В. // Материалы 39-й итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института «Актуальные вопросы военной медицины» - Самара, 2006. - С. 54-55.

8. Золотовицкая Н.Н. Клеточные культуры фибробластов в лечении раневых дефектов и рубцовых деформаций кожи в эксперименте / Колсанов А.В., Волова Л.Т., Иванова В.Д., Орлов Е.В., Дорожкина Е.Б. // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия: Ежегодник Российской ассоциации клинических анатомов в составе ВНОАГЭ. Приложение к журналу «Морфологические ведомости». - Вып. 7-й. - 2007. - С. 17-23.

9. Золотовицкая Н.Н. Экспериментальные и клинические аспекты использования дермальных фибробластов при патологических процессах кожи / Колсанов А.В., Волова Л.Т., Белозерцева Е.А. // Материалы 3-го Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Москва, ЦИТО, 25-26 апреля 2007 г. - Москва, 2007. - С.169.

10. Золотовицкая Н.Н. Сравнение эффективности применения различных культур фибробластов при рубцовых дефектах / Колсанов А.В., Волова Л.Т., Белозерцева Е.А. // Материалы 40-й итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института «Актуальные вопросы военной медицины» - Самара, 2007. - С. 56-58

Размещено на Allbest.ru

...