Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Миелопептиды, индуцирующие терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий

СУВОРОВ НИКОЛАЙ ИВАНОВИЧ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Москва - 2007



Работа выполнена в Институте биоорганической химии имени академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Михайлова А.А.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ярилин А.А.

доктор биологических наук, профессор Стенина М.А.

Ведущая организация:

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится « 29 » _мая_ 2007 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета

Автореферат разослан «14» апреля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат медицинских наук Кузнецова Т.Е.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Известно, что нарушение процессов пролиферации и дифференцировки клеток в костном мозге приводит к развитию тяжелых, а часто и неизлечимых заболеваний. К таким заболеваниям относятся различные типы лейкозов, в частности острые нелимфобластные (ОЛ или ОНЛЛ) и хронические (ХЛ). Это объясняет важность проблемы поиска новых дифференцировочных факторов, особенно эндогенной природы, которые могли бы быть использованы в комплексной противолейкозной терапии.

ОЛ встречаются в разных странах с частотой от 2 до 4 на 100 000 населения в год. У детей лейкозы являются наиболее частым злокачественным новообразованием (38-40%), они обуславливают высокую летальность, уступая первое место среди причин смертности у детей старше 2 лет лишь травмам. Частота лейкозов у детей составляет 3.2-4.4 на 100 000. У взрослых на долю ОНЛЛ приходится 80% среди всех острых лейкозов. Заболеваемость ОНЛЛ увеличивается с возрастом, достигая частоты 10-15 на 100 000 в год в популяции старше 65 лет. ОЛЛ составляют лишь 20% среди всех острых лейкозов взрослых. Мужчины и женщины заболевают с равной частотой. [Liesner RJ, Goldstone AH., 1997] В настоящий момент основой терапии всех ОНЛЛ, кроме варианта М3 (острый промиелоцитарный лейкоз), является сочетание различных методов химиотерапии.

Наряду с химиотерапией, приводящей к гибели опухолевых бластов, получает развитие терапия, вызывающая дифференцировку незрелых опухолевых клеток. Однако, следует отметить, что таких препаратов в настоящее время сравнительно мало. Так, терапия острого промиелоцитарного лейкоза основана на применении производных витамина А (ATRA) и As2O3, вызывающих созревание лейкозных клеток. Ведутся активные исследования других соединений, потенциально способных к их использованию в клинике - это производные витамина D, Е, сАМР, препараты на основе цитокинов и др. Однако, применение дифференцировочной терапии и противоопухолевых препаратов часто сопровождается развитием побочных реакций. В связи с этим возрастает потребность в препаратах, применение которых в комплексной терапии лейкозов останавливает рост опухолевых клеток, вызывает их дифференцировку и в тоже время оказывает минимальный побочный эффект.

В начале 1970-х годов группой российских иммунологов под руководством Р.В. Петрова впервые были обнаружены иммунорегуляторные пептиды костного мозга - миелопептиды (МП) (Petrov R.V., Mikhailova A.A., 1972,). МП синтезируются клетками костного мозга человека и млекопитающих без какой-либо стимуляции антигенами или митогенами. Они лишены видовой специфичности и, таким образом, могут быть использованы для иммунокоррекции при различных заболеваниях человека. В настоящее время структурно охарактеризованы и синтезированы шесть МП, каждый из которых обладает собственной иммунокорригирующей активностью. Среди выделенных МП имеются два пептида, обладающие способностью индуцировать терминальную дифференцировку клеток линий миелобластного и эритробластного лейкозов HL-60 и К-562. МП-4 и МП-6 увеличивают уровень экспрессии дифференцировочных антигенов CD14, CD38 и CD44, снижают уровень пролиферации бластных клеток, вызывают характерные морфологические изменения. Это указывает на перспективу использования их в комплексной терапии лейкозов, однако, остаются неясными вопросы относительно механизма их действия на опухолевые клетки.

2. Цели и задачи

Целью данной работы является изучение дифференцировочной активности миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и K-562 и анализ возможных механизмов действия этих пептидов.

В рамках данной работы решались следующие задачи

1. Изучить дифференцировочные свойства миелопептидов МП-4 и МП-6 на модели лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562 по различным показателям дифференцировочного процесса;

2. Исследовать характер связывания МП-4 с клетками линии HL-60 и оценить возможность его проникновения внутрь клетки;

3. Определить влияние МП-4 на активацию/ингибирование компонентов системы МАР - киназ в клетках линии HL-60;

4. Изучить роль ионов Са2+ в индукции дифференцировки клеток HL-60 под влиянием МП-4.

Научная новизна

В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование дифференцировочной активности пептидов костномозгового происхождения миелопептидов МП-4 и МП-6 на лейкозных клеточных линиях HL-60 и К-562 и выявление некоторых механизмов их действия.

Установлено, что клетки миело- и эритролейкоза человека под влиянием миелопептидов останавливают свой рост, экспрессируют на своей поверхности ряд дифференцировочных маркеров. Морфологический анализ клеток линии HL-60 выявил достоверное увеличение количества клеток, которые приобрели характерные черты зрелых форм - моноцитов и макрофагов. Показано что под влиянием МП-4 и МП-6 увеличивается функциональная активность клеток линии К-562, что говорит об их созревании.

Впервые показано вовлечение в процесс дифференцировки различных сигнальных путей - компонентов системы МАР киназ - ERK, JNK, p38 как в общей, так и в фосфорилированной форме. Инкубация HL-60 клеток с МП-4 в течение 72 часов сопровождалась увеличением амплитуды Са2+ ответов на формил пептид, что свидетельствует об изменении состояния дифференцировки этих клеток. В то же время, изменение базального уровня Са2+ в клетках HL-60 под влиянием МП-4 было незначительным и недостоверным, что показывает, что этот пептид практически не влияет на данный жизненно важный показатель.

В работе установлен факт специфического связывания МП-4 с поверхностью клеток HL-60, построена кривая полного насыщения для МП-4, рассчитана Kd =1,3x10-9М. Методом конфокальной микроскопии с использованием ФИТЦ-меченого МП-4 показано проникновение этого пептида в клетку и его локализация в околоядерной области.

Практическая значимость

Результаты, полученные в данной работе, представляют интерес не только для фундаментальной науки, но и для возможного использования их в медицине. В настоящее время терапия лейкозов с помощью дифференцировочных агентов является одним из наиболее перспективных направлений в лечении данного вида опухолевых заболеваний.

Понимание механизмов дифференцировочного действия МП-4 и МП-6 на клетки лейкозных линий необходимо для разработки наиболее эффективных методов терапии острых миелобластных лейкозов. Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференцировку опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке.

Материалы диссертации доложены: на 5-ом конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), на седьмом чтении, посвященном памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004), на 2-ом всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2004), на международной летней школе для студентов, аспирантов и молодых ученых «Многогранные способы применения специфической иммунотерапии» (Дубровник, 2004, Хорватия), на международном семинаре «Иммунология для онкологов» (Аскона, 2005, Швейцария), на 15-й конференции по протеин-киназам «Пространственная и временная регуляция сигнализации» (Осло, 2006, Норвегия).

Содержание работы

миелопептид лейкозный клеточный

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на _____ страницах машинописного текста, включая ____ таблиц и ____ рисунков. Список цитируемой литературы содержит 141 ссылку.

Материалы и методы.

Пептиды МП-4 и МП-6 были синтезированы методом классической пептидной химии в ФГУ Российском Кардиологическом Научно-Производственном Комплексе Росздрава (Москва). ФИТЦ-меченый МП-4 синтезирован в лаборатории медиаторов иммунной системы ИБХ РАН.

Культивирование клеток.

Культивирование клеток линии HL-60 (миелобластный лейкоз человека) и К-562 (эритробластный лейкоз) проводили в стандартной среде RPMI-1640 (ICN, США), содержащей 7% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO, Англия), 20мМ HEPES-буфер (Flow Laboratories, Англия), 2мМ L-глутамина Flow Laboratories, Англия) и 50 мкг/мл гентамицина (Брынцалов Ферейн, Россия). Клетки культивировали в полистироловых флаконах в СО2-инкубаторе при температуре 37оС во влажной атмосфере и 5% СО2. Клетки поддерживались в логарифмической фазе роста. МП-4 и МП-6 добавляли к клеткам в различной концентрации и инкубировали в течении 72 часов.

Оценка пролиферативного ответа клеток линии HL-60 и К-562.

Клетки лейкозных клеточных линий культивировали в атмосфере 5% СО2 при 37С в 24-х луночном планшете в количестве 50 тысяч клеток на лунку в объеме 1 мл в течении 72 часов. После чего клетки переносили в 96-ти луночный планшет в объеме 200 мкл на лунку и добавляли 3Н-тимидин (Радиевый институт им. В.Г. Хлопнева) - 5мк Ки/мл на 4 часа. После окончания инкубации планшет охлаждали до -28С, чтобы разрушить мембраны клеток. Содержимое каждой лунки при помощи харвестера переносили на целлюлозный фильтр Whatman min на 24 часа. Фильтры помещали в отдельные флаконы со сцинтилятом и ставили на счет. Измерение проводили на жидкостном сцинтиляционном счетчике (LKB, Sweden). Для количественной оценки реакции использовали абсолютную величину включения радиоактивной метки (число импульсов в минуту).

Морфологический анализ.

Морфологию клеток HL-60 определяли на 8 сутки ведения культуры (после 3 сут. воздействия миелопептидов). Готовили мазки клеток на покровных стеклах, фиксировали метанолом в течение 5 мин. и окрашивали азур-эозином по Романовскому-Гимзе. Подсчет промоноцитов, моноцитов и макрофагов проводили под иммерсией на микроскопе Leitz (Германия).

Цитофлуориметрический анализ.

Действие МП-4 на фенотип клеток изучали по изменению уровня экспрессии антигенов зрелых клеточных форм - CD14 [Bufler P, Stiegler G, et al., 1995] и CD38 [Malavasi Fabio, Funaro Ada, et al., 1994] - для клеток линии HL-60 и CD44 [Mallinson G., Soo KS, et al., 1995] - для клеток линии К-562. В качестве контролей использовали известные факторы терминальной дифференцировки клеток ФМА (форболмиристил ацетат) и ДМСО (диметилсульфоксид) соответственно. Клетки, взятые в логарифмической фазе роста (3 сут), культивировали в 24-луночных планшетах в стандартной среде RPMI-1640 в присутствии МП-4 (дозы от 10; 1; и 0,1 мкг/мл) 3-ое суток, затем заменяли среду на свежую и продолжали культивирование без МП-4 еще 3 суток. Суспензии клеток отмывали в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% фетальной сыворотки. Отмытые клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера и во все пробы (кроме контроля) добавляли ФИТЦ-меченые моноклональные антитела (мАТ) в количествах, рекомендованных фирмой-изготовителем. Инкубация с мАТ проходила в течение 40 минут на льду. Далее суспензии клеток дважды отмывали буфером и проводили анализ флуоресценции окрашенных клеток на лазерном проточном цитофлуориметре EPICS "ELITE" (Coulter Electronics Inc., США) [Дамбаева С.В., Мазуров Д.В., и др., 2002].

Определение гемоглобина в клетках линии К-562 (бензидиновый тест).

Функциональную активность клеток К-562 оценивали в бензидиновом тесте. Суспензии клеток К-562 отмывали дважды, затем к осадкам добавляли по 350 мкл деионизованной Н2О (проводили гемолиз), пробы встряхивали на шейкере и сразу же центрифугировали. Для измерения использовали надосадочные жидкости, содержащие гемоглобин. Реакцию проводили, исходя из следующих количеств реагентов: 150 мкл бензидина, 150 мкл Н2О2 и 150 мкл анализируемого раствора. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре Beckman при длине волны =610 нм.

Определение уровня апоптоза в культуре клеток линии HL-60.

Клетки линии HL-60 культивировали в 24-х луночном планшете в СО2-инкубаторе с пересевом 1 раз за 2 суток. Исходная концентрация клеток составляла 2.105/мл. Для изучения индуцирующего влияния МП-4 на апоптоз, клетки после пересева инкубировали в течение суток, МП-4 добавляли в фазе экспоненциального роста клеток. Оценка количества клеток, вступивших в апоптоз, проводилась цитофлуориметрическим методом на проточном цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter, США) по общепринятой методике. [Telford W.G., King L.E. et al.,1994] После окончания инкубации с МП-4, клетки переводили в РМ-16/HEPES, на холоду фиксировали в EtOH (70%, 40С), дважды отмывали в РМ-16/HEPES (300 g, 10 мин, 40С). Затем клетки ресуспендировали в растворе для окрашивания ДНК (РМ-16, содержащий 20 мкг/мл PI и 1 мг/мл РНКазы). Регистрировали флуоресценцию не менее 1.104 клеток. На гистограммах апоптотические клетки дифференцировали от живых по более низкой интенсивности флуоресценции.

Определение уровня внутриклеточного [Ca2+]I в клетках линии HL-60.

Для измерения внутриклеточной концентрации ионов Са2+ ([Ca2+]i), клетки HL-60 прокрашивали флуоресцентным красителем. Для этого 1 мкл Fura-2AM (1 мМ) добавляли к 2 мл суспензии клеток в среде Хенкса (10-12х106 клеток) в кварцевой термостатируемой кювете с тефлоновой магнитной мешалкой. Суспензию инкубировали в течение 30 мин при температуре 37оС. Затем краситель отмывали 2 раза центрифугированием (5 мин при 700 g). Отмытые клетки доводили до концентрации 1х106 клеток на мл. Каждая проба содержала 2 мл суспензии клеток. Измерение флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-1501 (ex 340 нм и 380 нм, em 505 нм). Уровень [Ca2+]i определяли как описано в работе [Grynkiewicz G., Poenie P, et al., 1985]. Fmax и Fmin измеряли при использовании дигитонина (100 мкМ) и EGTA (10 мМ).

Определение активности MAP-киназ в клетках линии HL-60.

Методом иммуноферментного анализа ELISA проводили измерение активности компонентов общей и фосфорилированной формы MAP-киназ - ERK, JNK и p38. В эксперименте использовали клетки линии HL-60, проинкубированные с МП-4 или МП-6 в различных концентрациях в течение 72 часов и контрольные клетки. Измерение проводили в соответствии с инструкцией, прилагавшейся к каждому набору ELISA.

Определение связывания МП-4 с клетками HL-60.

Цитофлуориметрический анализ

Клетки отмывали центрифугированием (2 раза при 1000 об/мин 3-5 мин. и готовили суспензию клеток 1х106/мл в PBS - буфере (ICN, USA), содержащим 1% ЭТС. Образцы (200.000 клеток на образец) инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в концентрациях 10-7 - 10-11 М в течение 40 мин на холоду (+40С). После этого надосадочную жидкость отделяли центрифугированием (1000 об/мин 5-7 мин), далее клетки дважды промывали буфером, ресуспендировали и анализировали свечение на проточном цитофлуориметре EPICS-5 (Coulter Electronics Inc., USA). При изучении конкурентного вытеснения метки, предварительно отмытые от среды клетки линии HL-60 в PBS, содержащие 1% ЭТС, инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в концентрации 10 нМ (40 мин, +40С). Далее образцы инкубировали с немечеными МП-4 или МП-3 в концентрациях от 10 до 100 нМ в течение 40 мин (+40С). После второй инкубации клетки дважды отмывали центрифугированием (1000 об/мин, 5-7 мин) и анализировали в проточном цитофлуориметре.

Определение способности МП-4 проникать внутрь клетки.

1. Методом цитофлуориметрического анализа.

Клетки линии HL-60, собранные в количестве 0,5-106 инкубировали с ФИТЦ-МП-4 в течение 40 минут в присутствии различных ингибиторов метаболизма и эндоцитоза, таких как низкая температура, азид натрия, хлорид аммония, нокодазол. Непосредственно перед измерением флуоресценции к суспензии клеток добавлялся 5 мкл 1М раствора дитионита натрия, для того, чтобы погасить флуоресценцию с поверхности клетки. [Drin G, Cottin S, et al., 2003]. Флуоресценцию измеряли на проточном цитофлуориметре EPICS-5 (Coulter Electronics Inc., USA).

2. Методом конфокальной микроскопии.

Для определения способности МП-4 проникать внутрь клетки использовали метод конфокальной микроскопии. Клетки линии HL-60 рассаживали в 96-луночные планшеты по 100000 клеток в 100 мкл на лунку в стандартной среде для культивирования, содержащей 10% ЭТС. Далее к клеткам добавляли ФИТЦ-МП-4 в концентрации 1 нМ и инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре 37оС в атмосфере 5% СО2 в течение 10, 30 и 40 мин. Из клеток, инкубированных 10 мин, сразу готовили образцы на стеклах для просмотра в микроскопе Carl Zeiss (Germany) под объективом Plan-Neofluar 100x/1.3 oil Ph 3. Клетки, инкубированные в течение 30 и 40 мин, перед приготовлением образцов для микроскопии сначала отмывали центрифугированием (10 мин, 1000 об/мин). Кроме этого, готовили образцы клеток HL-60, которые наблюдали под микроскопом сразу после добавления ФИТЦ-МП-4 (1 мин).

Результаты исследований

1. Влияние МП-4 и МП -6 на дифференцировку клеток линии HL-60

Способность МП-4 и МП-6 индуцировать дифференцировку клеток линии HL-60 изучали по нескольким параметрам, характеризующим дифференцировочный процесс: по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток, по изменению морфологии клеток, по изменению уровня экспрессии дифференцировочных антигенов, по изменению функциональной активности клеток.

1.1. Влияние МП-4 и МП-6 на синтез ДНК в клеточной линии HL-60.

Влияние МП-4 и МП-6 на метаболизм клеток линии HL-60 определяли по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток. В качестве положительного контроля был взят РМА в стандартной концентрации 10 нг/мл. В табл. 1 результаты представлены в имп/мин, 10-3 и в процентах от контроля.

Таблица 1. Влияние МП-4 и МП-6 на включение 3Н-тимидина в ДНК клеток линии HL-60

Концентрации агентов, добавляемых к клеткам HL-60, мкг/мл	Включение [3Н] тимидина
	имп/мин 10-3	% от контроля
контроль	6,0 0,9	100
РМА (10 нг/мл)	2,6 0,2**	43
МП-4 10	4,3+0,9	71
МП-4 5	4,2+0,9	70
МП-4 1	2,7+0,4	44
МП-6 50	4,2 1,0*	69
МП-6 10	4,6 0,2**	76
МП-6 1	6,2 0,7	103
МП-6 0,1	4,5 0,3**	75
*-р<0,05; **-р<0,01

Из таблицы 1 видно, что действие форболового эфира (положительный контроль) приводило к подавлению синтеза ДНК в клетках до 43% от контрольного уровня. Оптимальный эффект МП-4 проявился при концентрации пептида 1 мкг/мл. При данной концентрации происходило снижение синтеза ДНК до 44% по сравнению с контролем. Влияние МП-6 на клетки HL-60 в концентрациях от 50 до 0,1 мкг/мл также вызывало снижение уровня синтеза ДНК: при дозах пептида 100, 50, 10 и 0,1 мкг/мл наблюдалось подавление до 68, 69, 76 и 75% от контроля соответственно. При меньших концентрациях МП-6 от (0,01 до 0,0001 мкг/мл) эффект был недостоверным.

1.2. Влияние МП-4 и МП-6 на морфологию клеток линии HL-60.

Для количественного определения зрелых клеток после воздействия МП-4 был использован метод визуальной оценки - подсчета клеток в мазках. Морфологический анализ показал (табл. 2), что при всех использованных концентрациях МП-4 - 10; 1; и 0,1 мкг/мл наблюдалось увеличение количества моноцитов в 2,6; 2,8 и 2,1 раза соответственно. Эти показатели даже превышали эффект действия РМА, использованного в качестве положительного контроля - он увеличивал количество моноцитов всего в 1,5 раза. Количество макрофагов при всех использованных концентрациях МП-4 увеличивалось в среднем в 2 - 2,5 раза. Следовательно, под влиянием МП-4 в клеточной линии НL-60 появляются зрелые моноциты/макрофаги, т.е. индуцируется дифференцировочный процесс.

Табл.2 Увеличение количества зрелых клеток в клеточной линии HL-60 под влиянием МП-4

	Промоноциты	Моноциты	Макрофаги
Контроль	81,0+1,0	16,3+1,5	2,7+0,6
РМА, 10 нг/мл	68,5+8,1*	24,5+3,5**	7,0+1,0*
МП-4, 10 мкг/мл	50,3+8,1**	42,3+6,7**	7,4+1,5**
МП-4, 1 мкг/мл	49,7+1,5***	45,0+3,6***	5,3+1,3*
МП-4, 0,1 мкг/мл	57,5+3,8***	34,8+3,8**	7,7+0,6*
* - р<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001.

Результаты количественного анализа различных типов клеток в культуре HL-60 под влиянием МП-6 представлены в таблице 3. Были исследованы три дозы МП-6 (10; 1 и 0,1 мкг/мл). Наблюдалось увеличение количества моноцитов в 1,5, 1,4 и 1,3 раза по сравнению с контролем, а макрофагов ? в 3,1, 2,4 и 2,6 раза соответственно.

Таблица 3. Увеличение количества зрелых клеток в клеточной линии HL-60 под влиянием МП-6

	Промоноциты	Моноциты	Макрофаги
Контроль	81,01,0	16,31,5	2,70,6
РМА, 10 нг/мл	68,58,1*	24,53,5**	7,01,0*
МП-6, 10 мкг/мл	67,50,7***	24,01,4*	8,50,7**
МП-6, 1 мкг/мл	71,01,4**	22,50,7*	6,50,7**
МП-6, 0,1 мкг/мл	71,53,5*	21,52,1*	7,01,4*
* - р<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001

1.3.Экспрессия дифференцировочных антигенов на поверхности клеток линии HL-60 под влиянием МП-4 и МП-6

В данном исследовании определяли уровни экспрессии клеточных маркеров, свойственных зрелым клеточным формам. CD14 и CD38 экспрессируются на моноцитах и макрофагах и являются признаком дифференцировки этих клеток. [Yalcintepe L, Albeniz I, et al., 2005].

На рис 1. представлены результаты цитометрического анализа клеток линии HL-60 под действием МП-4. Уровень спонтанной дифференцировки в клетках линии НL-60 очень невысок: процент CD14 и CD38 позитивных клеток в контроле составляет 2,8% и 2,5% соответственно.

РМА увеличивает экспрессию маркеров CD14 и CD38 в 10 и в 14,5 раз по сравнению с контролем. МП-4 в дозе 1 мкг/мл также увеличивает экспрессию антигенов CD14 и CD38 в 8 и 7 раз соответственно.

Изменение экспрессии CD14 и CD38 на клетках линии HL-60 под влиянием МП-6 показано на рис.2.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.1 Увеличение экспрессии CD14 и CD38 на клетках линии HL-60 под действием МП-4

Рис. 2. Увеличение экспрессия CD38 и CD14 на поверхности клеток HL-60 под действием МП-6.

Действие МП-6 исследовали в диапазоне концентраций: от 10 до 0,01 мкг/мл. Было показано, что наиболее выраженным эффектом обладали дозы МП-6 10; 0,1 и 0,01 мкг/мл: они увеличивали синтез CD38 до 182, 135 и 123% от контроля соответственно, а экспрессию CD14 ? до 112, 149 и 161%.

1.4. Влияние МП-4 на апоптоз клеток линии HL-60

МП-4, добавленный к клеткам HL-60 в концентрации 1мкг/мл, оптимальной для индукции дифференцировки, значительно увеличивает количество клеток, находящихся в апоптозе. (Рис.3)



Рис.3 Влияние МП-4 на апоптоз клеток линии HL-60

Поскольку конечным этапом дифференцировки клеток является апоптоз, то увеличение количества апоптотических клеток в культуре свидетельствует о появлении большего количества зрелых клеток под влиянием МП-4.

Таким образом, по различным параметрам показано, что МП-4 и МП-6 являются дифференцировочными факторами для клеток линии HL-60. Данные пептиды снижают пролиферацию, увеличивая количество зрелых клеток, несущих маркеры дифференцировки CD14 и CD38, повышают процент морфологически зрелых форм и увеличивают количество апоптотических клеток.

2. Влияние МП-4 и МП -6 на дифференцировку клеток линии K-562

Одной из задач исследования было определение дифференцировочной активности МП-4 и МП-6 не только на клетках линии HL-60, но и влияние этих пептидов на клетки другой лейкозной линии К-562. При этом использовалась часть методов, применяемых для оценки влияния пептидов на клетки HL-60.

2.1. Влияние МП-4 и МП-6 на пролиферацию клеточной линии К-562

Пролиферацию клеток линии К-562 под действием МП-4 также определяли по влиянию на синтез ДНК в клетке. Так концентрации пептида; 50; 0,1; 0,01 и 0,001 приводили к подавлению синтеза ДНК до, 81, 42, 76 и 72% от исходного уровня соответственно. Это действие сопоставимо с эффектом положительного контроля ДМСО (подавление до 67% от исходного уровня), а МП-4 в дозе 0,1 мкг/мл обладал даже более сильным эффектом подавления синтеза ДНК по сравнению с ДМСО (табл. 4)

Таблица 4

Снижение пролиферации клеток К-562 под влиянием МП-4

Концентрации агентов, добавляемых к клеткам К-562, мкг/мл	Включение [3Н] тимидина
	имп/мин 10-3	% от контроля
(контроль)	4,4 0,2	100
ДМСО (0,5 %)	2,9 0,2***	67
ДМСО (0,1 %)	3,8 0,3*	88
МП-4 50	3,5 0,3**	81
МП-4 10	4,2 0,3	96
МП-4 1	4,4 0,6	101
МП-4 0,1	1,8 0,04***	42
МП-4 0,01	3,3 0,3***	76
*-р<0,05; **-р<0,01; ***-р<0,001

Изменение метаболизма в клетках линии К-562 под влиянием МП-6, также оценивали по включению радиоактивной метки 3Н-тимидина в ДНК клеток. Как видно из таблицы 5, МП-6 обладал достоверным подавляющим эффектом на синтез ДНК в широком диапазоне концентраций (от 100 до 0,01 мкг/мл). Эффект всех использованных доз был соизмеримым с действием положительного контроля ? ДМСО, который подавлял синтез ДНК до 77% от контрольного уровня: так для концентраций 100; 50; 10; 1; 0,1 и 0,01 мкг/мл наблюдалось снижение уровня синтеза ДНК до 82, 69, 71, 79, 73 и 83% от исходного уровня соответственно.

Таблица 5. Снижение пролиферации клеток К-562 под влиянием МП-6

Концентрации агентов, добавляемых к клеткам К-562, мкг/мл	Включение [3Н] тимидина
	имп/мин 10-3	% от контроля
(контроль)	7,5 0,09	100
ДМСО (0,5 %)	5,7 0,3*	77
МП-6 100	6,1 0,4*	82
МП-6 50	5,2 0,2**	69
МП-6 10	5,3 0,5*	71
МП-6 1	5,9 0,5*	79
МП-6 0,1	5,5 0,3**	73
МП-6 0,01	6,2 0,2*	83
*-р<0,05; **-р<0,01

Таким образом, МП-4 и МП-6 вызывают снижение синтеза ДНК в клетках линии К-562 до уровня, сопоставимого с таковым известного индуктора дифференцировки ДМСО, что свидетельствует о дифференцировочном действии этих двух пептидов и на клетки эритробластного лейкоза.

2.2. Экспрессия дифференцировочных антигенов на поверхности клеток линии К-562 под влиянием МП-4 и МП-6

В данном исследовании определяли изменение уровня экспрессии CD44, являющегося маркером зрелых эритроцитов, под влиянием МП-4 и МП-6. [Telen MJ, 1995]

Проведенный нами цитометрический анализ с использованием моноклональных антител CD-44 (маркер зрелых эритроцитов) показал (рис. 4), что под влиянием МП-4 количество клеток, несущих данный антиген, увеличивается в 2,75 раза по сравнению с контролем. Этот показатель выше, чем под влиянием ДМСО, который увеличивает процент зрелых клеток в данном тесте в 2 раза.



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4. Изменение экспрессии CD44 на клетках К-562 под действием МП-4

Влияние МП-6 на экспрессию CD44 на поверхности клеток линии К-562 показано на рис.5. Можно видеть, что МП-6 почти в два раза увеличивает процент клеток, несущих на своей поверхности антиген CD44

Рис 5. Экспрессия CD44 на поверхности клеток К-562 под действием МП-6

2.3. Изменение количества синтезированного клетками К-562 гемоглобина под влиянием МП-4 и МП-6 (бензидиновый тест)

Поскольку клетки линии К-562 являются бластами и не способны синтезировать гемоглобин, изучалась способность МП-4 и МП-6 влиять на созревание клеток этой линии до зрелых форм по проявлению этими клетками их функциональной активности. Способность синтезировать гемоглобин является признаком не только зрелых, но и функционально активных клеток, поскольку только такие клетки способны доставлять кислород к органам и тканям.

Как видно из рис.6, под влиянием МП-4 происходит повышение содержания гемоглобина по сравнению с контролем в 1.6 - 1.8 раза. Эти изменения синтеза гемоглобина наблюдались при всех использованных концентрациях МП-4.

Рис.6 Влияние МП-4 на функциональную активность клеток К-562. Бензидиновый тест

Рис 7. Влияние МП-6 на функциональную активность клеток К-562. Бензидиновый тест

На круговой диаграмме представлены результаты одного из пяти экспериментов по влиянию МП-6 на синтез гемоглобина клетками К-562. (Рис. 7)

Для высоких доз МП-6 (100; 50; 10 и 1 мкг/мл) не было обнаружено увеличения синтеза гемоглобина по сравнению с контролем. При этом низкие дозы МП-6 (0,1; 0,01; и 0,001 мкг/мл) вызывали достоверно значимое увеличение синтеза гемоглобина, сравнимое с действием DMSO (118% в сравнении с контролем).

Таким образом, МП-6, как и МП-4 является дифференцировочным фактором клеток линии К-562.Под действием этих пептидов происходит снижение пролиферации и дифференцировка клеток линии К-562, повышается процент клеток, несущих маркер дифференцировки CDD44, увеличивается количество зрелых, функционально активных клеток, способных синтезировать гемоглобин.

3. Изучение некоторых механизмов дифференцировочного действия МП-4 на клетках линии HL-60.

3.1. Определение параметров связывания МП-4 с клетками HL-60

С помощью проточной цитометрии установлено, что ФИТЦ-МП-4 связывается с клетками линии HL-60 в широком диапазоне концентраций 10-7-10-11 М. Связывание описывается кривой насыщения, имеющей дозозависимый характер с выходом на плато при 12 нМ..

Анализ взаимодействия ФИТЦ-МП-4 с клетками НL-60 в координатах Лаинуивера-Берка позволил рассчитать константу диссоциации, равную 1.3 нМ (рис.8) , что характерно для рецепторов высокой аффиности.

Для оценки специфичности связывания МП-4 с клетками линии HL-60 были проведены эксперименты по вытеснению ФИТЦ-МП-4 избыточным количеством немеченого МП-4 и миелопептидами с другими аминокислотными последовательностями - МП-3 (Leu-Val-Cys-Tyr-Pro-Gln) или МП-6 (Val-Asp-Pro-Pro) (рис. 9).



Рис. 8 Связывание ФИТЦ-МП-4 с клетками НL-60

Рис.9 Анализ специфичности связывания ФИТЦ-МП-4 с клетками НL-60

Как видно из рисунка 9, введение избытка немеченого МП-4 в инкубационную смесь приводит к дозозависимому снижению интенсивности флуоресценции, т.е. к вытеснению ФИТЦ-МП-4 с сайтов связывания на клетках-мишенях (рис.9 кривая 1). В то же время, введение избытка немеченых пептидов с другой аминокислотной последовательностью, МП-3 или МП-6, не приводит к такому результату (рис.9, кривые 2 и 3). Насыщение и обратимый характер связывания при избытке немеченого пептида той же аминокислотной последовательности и отсутствие вытеснения другими немечеными пептидами позволяют утверждать, что ФИТЦ -МП-4 специфически связывается с поверхностными рецепторами клеток миелобластного лейкоза HL-60. Факт того, что МП-6 не вытеснят ФИТЦ-МП-4, говорит о том, что МП-4 и МП-6 имеют различные сайты связывания на клеточной поверхности и, вероятно, различные пути дифференцировочного действия.

3.2 Проникновение МП-4 внутрь клеток линии HL-60

С помощью конфокальной микроскопии было показано, что ФИТЦ-МП-4 не только специфически связывается с поверхностью клеток HL-60, но и проникает в цитоплазму этих клеток. Установлено проникновение пептида внутрь клетки и его локализация вокруг клеточного ядра. (Рис.10)

Клетки НL-60 просматривали в микроскопе через различные промежутки времени после добавления к ним ФИТЦ-МП-4 и фотографировали. Было показано, что через 1 мин. после инкубации клеток HL-60 с ФИТЦ-МП-4 меченый пептид проникает в межклеточное пространство (рис 10, а), а уже через 10 мин. (рис.10, б) практически полностью находится на поверхности клеток. Через 30 мин. после начала инкубации ФИТЦ-МП-4 обнаруживается в цитоплазме (рис. 10, в), а через 40 мин. (рис.10, г) меченый пептид локализуется вокруг клеточного ядра.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.10 Проникновение ФИТЦ-МП-4 внутрь клетки. Стрелками показано положение пептида через 1, 10, 30, 40 мин.

3.3. Исследование характера проникновения МП-4 внутрь клеток HL-60

Проникновение ФИТЦ-меченого МП-4 исследовали также с помощью проточной цитофлуориметрии. [Drin G, Cottin S, et al., 2003]. В наших экспериментах уровень флуоресценции клеток, инкубировавшихся с ФИТЦ-МП-4 при 370С в присутствии азида натрия, вызывающего истощение АТФ, хлорида аммония, нейтрализующего кислый рН лизосом, нокодазола, ингибирующего полимеризацию микротрубочек, не отличался от флуоресценции клеток, инкубировавшихся при 370С при погашенной флуоресценции с поверхности. (Рис 11) Инкубация клеток с меченым пептидом при 40С блокировала проникновение пептида внутрь клетки и, следовательно, приводила к уменьшению флуоресценции по сравнению с клетками, инкубировавшимися при 370С

Рис.11. Исследование характера проникновения ФИТЦ-МП-4 в клетки линии HL-60. Цифрами показано действие 1 - 40С, 2 - 370С, 3 - NH4Cl*, 4- 370С*, 5 - нокодазол*, 6- NaN3*,*-при тушении флуоресценции с поверхности

Эти данные свидетельствуют о том, что проникновение меченого пептида внутрь клетки носит энергонезависимый характер, не зависящий от температуры и не связанный с эндоцитозом.

3.4. Участие ионов Са2+ в реализации дифференцировочной активности МП-4

Важную роль в регуляции процесса дифференцировки играет изменение внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция [Са2+]i. [Santella L, Ercolano E, et al., 2005]Особенно важно контролировать изменение базального уровня [Са2+]i при длительном действии некоторых агентов, индуцирующих дифференцировку клеток. В связи с этим, необходимо было изучить Са2+ ответы недифференцированных промиелоцитов линии HL-60 на стандартные агенты и сравнить их с ответами клеток HL-60, подвергнутых воздействию миелопептида МП-4.

3.4.1 Ca2+ ответы в недифференцированных клетках HL-60

На рис. 12 показано влияние последовательных добавок стандартного активатора фагоцитов - fMLP к клеточной суспензии. В концентрациях 1-3 мкМ этот агент не влиял на недифференцированные HL-60 клетки. В то же время, увеличение концентрации fMLP до 10 мкМ вызывало достоверный Са2+ ответ. Последующая обработка этих клеток высокими концентрациями fMLP приводила к монотонному увеличению [Ca2+]i . Добавление к клеткам необратимого ингибитора Са2+-АТРазы эндоплазматического ретикулума (SERCA) - тапсигаргина (500 нМ) сопровождалось характерным высоко амплитудным ростом [Ca2+]i , который обусловлен двумя взаимосвязанными процессами: выходом ионов Са2+ из внутриклеточного депо и транспортом Са2+ по кальциевым SOC каналам, регулируемым содержанием Са2+ в депо (SOC - store operated channels). Эти данные позволяют предположить, что в плазматических мембранах недифференцированных HL-60 клеток либо содержится незначительное количество рецепторов для fMLP, либо сродство этих рецепторов для данного агента невелико.



Рис.12 Изменение Са2+ ответа в недифференцированных клетках HL-60 под влиянием стандартных агентов.

Цифрами показано последовательное добавление 1-5 - 10 мкМ fMLP, 6 - 500 нМ тапсигаргина, 7 - 0,5 мкМ миконазола, 8 - 0,1 мкМ иономицина.

3.4.2. Ca2+ ответы в клетках HL-60, инкубированных с МП-4

На рис.13 представлены результаты экспериментов, поставленных по аналогичной схеме на HL-60 клетках, подвергшихся воздействию МП-4 в течение 72 часов. Необходимо особо отметить, что Ca2+ ответ на fMLP наблюдался уже при концентрации 0,5 мкМ и был выраженным при конечных концентрациях от 1-7 мкМ.

Цифрами показано последовательное добавление 1 - 1мкМ fMLP; 2 - 2 мкМ fMLP; 3 - 4 мкМ fMLP; 4- 500 нМ тапсигаргина; 5,6 - 0,5 мкМ миконазола; 7,8 - 0,1 мкМ иономицина.

На основании этих результатов можно заключить, что МП-4 выступает в качестве эффективного дифференцировочного фактора, который приводит к резкому усилению Са2+ ответа на существенно более низкие концентрации fMLP.



Рис.13 Изменение Са2+ ответа в клетках HL-60, инкубированных с МП-4 (10 мкг/мл) в течение 72 часов под влиянием стандартных агентов

3.4.3. Изменение базального уровня [Ca2+]i под влиянием МП-4

Многие дифференцировочные агенты увеличивают такой жизненно важный показатель клеток, как базальный уровень [Ca2+]I, что вызывает серьезные побочные эффекты при использовании их в клинике. В связи с этим особое внимание было уделено изменению базального уровня [Ca2+]i под действием МП-4. Обработка недифференцированных HL-60 клеток МП-4 (10-80 мкг/мл) не изменяла базальный уровень [Ca2+]i . Аналогичные результаты были получены на HL-60 клетках, прединкубированных с МП-4 (10 мкг/мл). (Рис.14)

Таким образом, было показано, что в клетках HL-60, инкубированных в течение длительного времени с МП-4, базальный уровень [Ca2+]i оставался практически неизменным, что выгодно отличает МП-4 от других дифференцировочных агентов, таких как витамин D3.



Рис.14 Влияние прединкубации с МП-4 на базальный уровень [Са2+]i и Са2+ ответы в клетках HL-60.

1 - базальный уровень[Са2+]i в контрольных клетках; 2 - базальный уровень [Са2+]i в клетках, прединкубированных с МП-4 (10 мкг/мл) в течение 72 часов;3-базальный уровень [Са2+]i в контрольных клетках при добавлении МП-4 (10-80 мкг/мл), 4-Са2+ ответ в контрольных клетках под действием 50 мкМ fMLP; 5-Са2+ ответ в клетках, прединкубированных с МП-4 под действием 7мкМ fMLP.

3.5. Измерение активности компонентов системы MAP-киназ в клетках линии HL-60 под влиянием МП-4 и МП-6

Для раскрытия некоторых механизмов дифференцировочного действия МП-4 и МП-6 исследовали влияние этих пептидов на активацию/ингибирование компонентов одной из важных систем внутриклеточной сигнализации - МАР-киназ. С помощью иммуноферментного анализа ELISA установлено, что МП-4 и МП-6 вызывают изменение функционального состояния различных компонентов системы МАР-киназ в клетках линии HL-60.

3.5.1. Изменение активности компонентов системы МАР-киназ под влиянием МП-4. На рис.15 показано, что МП-4 вызывает ингибирование ERK-киназы как в общей, так и в фосфорилированной форме на 49% и 33,6% соответственно. При этом наблюдается активация общей и ингибирование фосфорилированной формы JNK-киназы на 20,2% и 11,9% соответственно, и ингибирование общей формы р38-киназы на 28,8%.

Рис.15. Изменение активности компоненты системы МАР-киназ под влиянием MП-4 1 мкг/мл.

Показано 1)ингибирование общей и фосфорилированной форм ERK-киназы; 2) ингибирование фосфорилированной формы JNK -киназы; 3) ингибирование общей формы р38-киназы.

3.5.2. Изменение активности компонентов системы МАР-киназ под действием МП-6

МП-6 вызывает активацию фосфорилированной формы белка ERK на 26,1% и активацию как общей, так и фосфорилированной формы JNK на 55,7 % и 42,8%. Как и МП-4, МП-6 вызывает ингибирование уровня общей формы р38-киназы на 12,7%. (Рис.16)



Рис. 16. Изменение активности компоненты системы МАР-киназ под влиянием MП-6 1 мкг/мл. Показано 1)ингибирование общей и активация фосфорилированной форм ERK-киназы; 2) активация общей и фосфорилированной формы JNK -киназы; 3) ингибирование общей формы р38-киназы.

Таким образом, процесс дифференцировки клеток под действием МП-4 приводит к ингибированию фосфорилированных форм ERK-, JNK - киназ, вызывает снижение уровня общего белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на данные внутриклеточные пути. С другой стороны, МП-6 вызывая активацию ERK- и JNK-киназы, приводит к ингибированию уровня общего белка р38. Этот факт подтверждает различные пути дифференцировочного действия этих пептидов, поскольку они имеют различные сайты связывания на клетках линии HL-60.

Выводы

1. МП-4 и МП-6 являются факторами клеточной дифференцировки. Они индуцируют терминальную дифференцировку лейкозных клеточных линий HL-60 и К-562, что показано по различным показателям: снижению пролиферации, появлению морфологически зрелых клеток, экспрессии дифференцировочных антигенов на клеточной поверхности, проявлению функциональной активности клеток.

2. МП-4 специфически связывается с клетками линии HL-60 (Kd = 1,3 нМ). Затем пептид проникает внутрь клетки и локализуется вокруг клеточного ядра.

3. Проникновение пептида внутрь клетки является энергонезависимым, тепмературозависимым процессом, не связанным с эндоцитозом.

4. Дифференцировка клеток линии HL-60 под влиянием МП-4 сопровождается увеличением амплитуды Са2+ ответов, при этом МП-4 практически не влияет на базальный уровень свободных ионов Са2+ в клетке, что выгодно отличает его от ряда других дифференцировочных агентов и указывает на возможность его применения в клинике.

5. МП-4 вызывает ингибирование JNK-киназы и ERK-киназы, а также подавляет активность общей формы белка р38, что свидетельствует о влиянии пептида на данные внутриклеточные пути.

6. МП-6 не вытесняет ФИТЦ-МП-4 из мест специфического связывания на поверхности клеток HL-60. Ингибируя активность общей формы р38, МП-6, в отличие от МП-4, вызывает активацию как ERK, так и JNK-киназы. Эти данные указывают на различие в механизмах дифференцировочного действия МП-4 и МП-6.

Практические рекомендации

Результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых лекарственных средств, вызывающих дифференцировку опухолевых клеток и направленно действующих на определенные компоненты сигнального каскада в опухолевой клетке.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кирилина Е.А., Хайдуков С.В., Калюжная М.В., Попова С.С., Суворов Н.И., Михайлова А.А. //Миелопептиды, влияющие на дифференцировку лейкозных клеток.// РААКИ, 5-й Конгресс, Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии, тезисы докладов, 12-14 ноября 2002, т. 2, с. 227.

2. Кирилина Е.А., Гурьянов С.А., Суворов Н.И., Попова С.С., Хайдуков С.В., Михайлова А.А. //Дифференцировка клеток миелобластного (HL-60) и эритробластного (К-562) лейкозов под влиянием миелопептида-4 и миелопептида-6.// Российский симпозиум по химии и биологии пептидов, 2003, Москва, тезисы стендовых сообщений, с. 73.

3. Suvorov N.I., Popova S.S., Holodenko I.V., Gur'yanov S.A., Efremov M.A. Specific binding of myelopeptide-4 with the cells of the HL-60 human leukemia cell line. International Journal on Immunorehabilitation, may 2004, V.6, № 2, 236

4. Суворов Н.И., Попова С.С., Холоденко И.В., Гурьянов С.А., Ефремов М.А. Специфическое связывание миелопептида МП-4 с клетками лейкозной линии HL-60. Тезисы VII чтений, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова, Москва, 2004, с. 38.

5. Суворов Н.И., Попова С.С., Холоденко И.В., Гурьянов С.А., Ефремов М.А. Специфическое связывание миелопептида МП-4 с клетками лейкозной линии HL-60. Аллергология и иммунология, 2004, том 5, № 1, с. 104.

6. Кирилина Е.А., Суворов Н.И, Попова С.С., и др. Индукция дифференцировки в лейкозных клеточных линиях под влиянием миелопептида-4, Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005, том 140 №11, с 565-570.

7. Асташкин Е.И., Суворов Н.И., Михайлова А.А., Грачев С.В., Изменение Сa2+ ответа на формилпептид в клетках миелолейкоза HL-60 при индукции их дифференцировки миелопептидом МП-4, ДАН, 2006, т.408, №3, с. 418-421.

8. Suvorov N, Astashkin E, Mikhailova A, Ca2+ and MAPK signaling in HL-60 cells during differentiation by myelopeptide MP-4, 15th protein kinase meeting «Spatial and Temporal Regulation of Signalling», 2006, Oslo, p.61.

9. Гурьянов С.А., Кирилина Е.А., Хайдуков С.В., Суворов Н.И., Молотковская И.М., Михайлова А.А. Специфическое связывание и проникновение внутрь клетки-мишени флуоресцентно меченного миелопептида-4, обладающего дифференцировочной активностью. Биоорганическая химия 2006, т.32, № 6, с. 1-5.

Размещено на Allbest.ru

...