Оценка активации МАР-киназ и транскрипционных факторов у моллюсков (Helix), обладающих разной способностью к обучению

1. Сравнительный анализ экспрессии MAPK/ERK в ЦНС виноградной улитки и высших позвоночных животных (крыса).

Так как MAP-киназа ERK у виноградной улитки не исследована, в качестве первой стояла задача выявить экспрессию этих киназ у Helix. Исследование экспрессии MAP-киназ ERK проводили на уровне синтеза м-РНК методом ОТ-ПЦР и на уровне синтеза белка методо Вестерн блот анализа. Было показано, что на уровне синтеза м-РНК в ЦНС виноградной улитки происходит значительная экспрессия MAP-киназ ERK (Рис.1).

Рис. 1. Анализ экспрессии MAPK/ERK с помощью метода ОТ-ПЦР.

А. Анализ целостности РНК. Электрофорез РНК в 1% агарозном геле.

Б. Анализ продуктов ОТ-ПЦР. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в 1,5% агарозном геле. Первая дорожка -- маркеры.

Для оценки содержания и/или активацию МАР-киназ использовали антитела к тотальным и фосфорилированным формам MAPK/ERK. Фосфорилирование МАР-киназ ERK вышележащей МЕК-киназой вызывает их активацию. Исследования показали, что антитела к тотальным формам MAPK/ERK выявляют в ЦНС Helix одну полосу с молекулярным весом 42 kDa, которая равна подвижности ERK2 крысы (Рис. 2, А). Протеинкиназа ERK1 с молекулярным весом 44 kDa у улитки не обнаруживается. Антитела к фосфо-p44/p42 MAPK также выявляют только одну полосу MAPK/ERK2 (Рис. 2, Б).

Рис 2. Вестерн блот анализ экстрактов белков из ЦНС Helix и крысы.

Видно высокоспецифичное взаимодействие антител к MAPK/ERK (A) и фосфо-MAPK/ERK с экстрактами из ЦНС Helix (Б). Преинкубация антител phospho-ERK с пептидом, блокирующим phospho-p44/42 MAPK (Thr 202/Tyr 204), блокирует сигнал (В).

Чтобы подтвердить специфичность связывания антител, провели пептид-связывающий контроль (peptide competition control). Как показано на рисунке 2 В, использование блокирующего пептида phospho-p44/42 MAPK (Thr 202/Tyr 204) (Cell Signalling) полностью предотвращает связывание антител. Этот результат подтверждает данные о специфичности сигнала p-ERK. Таким образом, проведенные эксперименты позволяют утверждать, что MAP-киназа ERK2 экспрессируется в ЦНС Helix lucorum и коммерческие антитела могут применяться для дальнейшего анализа ее содержания и активации.

2. Анализ экспрессии и активации МАР-киназ ERK в функционально различных ганглиях ЦНС виноградной улитки при обучении.

Исследования экспрессии и активации MAPK/ERK при обучении проводили в функционально различных ганглиях ЦНС улитки (париетовисцеральном, педальном и церебральном). В париетовисцеральном комплексе ганглиев локализованы нервные клетки, участвующие в организации оборонительного поведения, в том числе сенсорные, моторные и командные. По литературным данным (Балабан, Захаров, 1992) около 90% нейронов в этом ганглии реагируют на ноцицептивную стимуляцию. Удар электрическим током использовали в качестве безусловного стимула. Нейроны педального ганглия непосредственно не участвуют в замыкании дуги изучаемого рефлекса и осуществляют модуляторные функции. В церебральном ганглии осуществляется анализ сенсорной информации - обработка запахов, связанных с пищевыми стимулами, которые использовались нами в качестве условных.

2.1 Сравнительное изучение активации МАРK/ERK в париетовисцеральном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении.

Методом Вестерн блот-анализа с применением антител к тотальным и фосфорилированным формам МАР-киназ ERK1/2 показано, что в париетовисцеральном комплексе ганглиев детектируется значительное количество MAPK/ERK (рис.3, A).

Темные столбики - животные, которым вводили физиологический раствор; светлые - животные, которым вводили нейротоксин 5,7-ДОТ. Здесь и далее: по оси абсцисс - содержание фосфо-форм МАРK/ERK, отнесенное к содержанию тотальных форм в каждом образце и контролю. Контроль принят за единицу. Статистически значимое отличие от контроля, * -- р<0,05; ** -- p<0,01; *** -- p<0,001; # - статистически значимые отличия между группами, р<0,01. N=4.

Рис. 3. Анализ активации МАРK/ERK в париетовисцеральном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении. А. Репрезентативный иммуноблот с антителами к фосфорилированным (р-ERK) и тотальным (ERK) формам МАР-киназ ERK 1/2. Б. Относительное содержание фосфо-форм МАРK/ERK.

Анализ активации МАРK/ERK спустя разные сроки после окончания процедуры обучения показал, что через 10 мин после обучения в этом ганглии происходит значительная активация МАРK/ERK каскада, что отражается в увеличении содержания фосфо-форм МАРK/ERK по сравнению с контролем (рис. 3 Б - темные столбики). Спустя 1 ч после обучения уровень фосфорилирования МАРK/ERK снижается, однако остается достоверно выше контрольного уровня. Через 2 ч после обучения уровень фосфорилирования падает ниже базального, снова увеличиваясь к 4 ч (рис. 3). Таким образом, при формировании условного рефлекса пищевой аверзии наблюдаются два пика активации МАРK/ERK (10/60 мин и 4 ч) и дезактивация ниже базального уровня спустя 2 ч после обучения.

Известно, что в формировании ассоциативных и неассоциативных форм обучения у моллюсков значительную роль играет серотонин. Этот медиатор опосредует передачу подкрепляющего ноцицептивного стимула и лежит в основе формирования механизмов сенситизации и условных оборонительных рефлексов (Балабан и Захаров, 1992; Шевелкин и др., 1997; Martin et al., 1997). Дисфункция синаптических терминалей серотонинергических нейронов препятствует развитию потенциации, сенситизации и условных оборонительных рефлексов у Helix (Балабан и Захаров, 1992; Малышев, 1997). В связи с этим группе улиток был введен нейротоксин 5,7-диокситриптамин (5,7-ДОТ), разрушающий серотонинергические терминали. Через 7 дней после последнего введения нейротоксина животных подвергали обучению. Далее методом Вестерн блот-анализа сравнивали активацию МАР-киназ ERK у животных, инъецированных физ. раствором, и у животных, которым вводили нейротоксин 5,7-ДОТ. Обнаружено, что разрушение серотонинергических терминалей не сказывается на базальном уровне синтеза МАРK/ERK (рис. 3). Однако введение 5,7-ДОТ приводит к значительному снижению активации МАРK/ERK спустя 10 мин после обучения по сравнению с обученными и инъецированными физ. раствором животными, что свидетельствует о важной роли серотонина в регуляции активации этого каскада на данных этапах обучения. Через 4 ч после обучения у 5,7-ДОТ-обработанных животных, как и у нативных обученных наблюдается рост содержания фосфо- МАРK/ERK.

Таким образом, введение 5,7-ДОТ, приводящее к снижению способности улиток к выработке условного рефлекса пищевой аверзии, приводит к драматическому снижению активации МАРK/ERK каскада на ранних этапах формирования этого рефлекса. -- Экспериментальные данные по разделам 2.1 и 2.2 получены совместно с к.б.н. П.Д. Лисачевым и студенткой магистратуры К.А. Барановой.

2.2 Исследование содержания и активации МАРK/ERK в педальном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении.

Далее нами был проведен анализ активации МАРK/ERK спустя разные сроки после окончания процедуры обучения в педальном ганглии. Нейроны этого ганглия не входят в сеть оборонительного рефлекса и осуществляют модуляторные функции (Балабан и Захаров, 1992; Иерусалимский и др., 1992).

Рис. 4. Анализ активации МАРK/ERK в педальном комплексе ганглиев виноградной улитки при обучении после введения нейротоксина 5,7-ДОТ

А. Репрезентативный иммуноблот.

Б. Относительное содержание фосфорили-рованных форм МАРK/ERK. Статистически значимое отличие от контроля, * - р<0,05; * * - p<0,01; * * * - p<0,001. N=4.

Из рис. 4 видно, что, в отличие от париетовисцерального комплекса ганглиев, в педальных ганглиях через 10 мин после обучения активации MAPK/ERK не наблюдается, а через 1 ч происходит даже падение. Спустя 2 ч, так же как и в париетовисцеральном комплексе, происходит достоверное снижение фосфорилирования MAPK/ERK ниже базального уровня, а спустя 4 ч также наблюдается увеличение. Введение животным нейротоксина 5,7-ДОТ достоверных отличий в уровне фосфорилирования MAPK/ERK не вызывает.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при успешной выработке условного рефлекса пищевой аверзии в ЦНС виноградной улитки происходит значительная активация МАРK/ERK каскада, что подтверждает данные об участии МАР-киназ ERK в обучении, полученные на других видах животных (Silva et al, 1998; Herdegen and Leah, 1998; Kaminska et al, 1999; Davis et al., 2000; Thiels et al, 2002; Sananbenesi et al, 2003). Динамика активации МАРK/ERK носит волнообразный характер с пиками в 10/60 мин и 4 часа, что коррелирует с наличием 2 пиков экспрессии генов при обучении (Анохин, 1997).

Известно, что основными индукторами МАРK/ERK-каскада являются факторы роста, взаимодействующие с тирозинкиназными рецепторами (Kaplan and Miller, 2000). Однако этот каскад может также активироваться ПКА и кальцием (Kormhauser and Greenberg, 1997). Как отмечалось выше, в формировании оборонительных форм обучения у моллюсков, в том числе у Helix, значительную роль играет серотонин. При этом свое действие на механизмы пластичности серотонин оказывает через цАМФ-зависимый регуляторный путь (Martin et al, 1997; Гринкевич и др., 2001). Таким образом, первый пик активности МАР-киназ может индуцироваться серотонином. В пользу этого положения свидетельствуют наши данные по значительному снижению активации МАРK/ERK на ранних стадиях обучения в париетовисцеральном комплексе ганглиев при введении нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к данной форме обучения. Сходная картина активации МАРK/ERK наблюдается также в церебральном комплексе ганглиев, осуществляющих анализ сенсорной информации, о к пищевых стимулах, которые использовались нами в качестве условных. Так, спустя 10 мин после обучения уровень фосфорилирования ERK составлял 2,22±0,32 по отношению к контролю (который принят за 1) и уменьшался до 1,23±0,12 при введении 5,7-ДОТ (достоверно, р<0,01).

С другой стороны, известно, что CRE-зависимым путем МАРК каскады могут индуцировать экспрессию генов факторов роста (Xing et al, 1996; Finkbeiner et al, 1997; Xu Tao et al, 1998). При этом факторы роста, выделяясь во внеклеточное пространство, через тирозинкиназные рецепторы, способны осуществлять положительную обратную связь на активацию МАР-киназных сигнальных каскадов. Таким образом, факторы роста могут обеспечить активацию МАР-киназных каскадов спустя длительное время после обучения. Кроме того, при выработке данного рефлекса в качестве подкрепления мы использовали сильный сенситизирующий стимул - удар электрическим током. Поэтому не исключено влияние на формирование этого рефлекса и стресса. Действием стресса можно также объяснить и увеличение фосфорилирования МАРK/ERK спустя 4 ч после обучения у 5,7-ДОТ-обработанных животных. Один из механизмов положительного влияния стресса на обучение через синтез рецептора кортикотропин-рилизинг-фактора детально описан в работе (Sananbenesi et al, 2003). Авторы показали, что стресс-индуцируемое улучшение обучения связано с активацией МАРK/ERK.

Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что активация МАРK/ERK в ранние сроки после обучения носит специфический характер и снимается при введении нейротоксина 5,7-ДОТ. В то время как увеличение активности этих киназ спустя 4 ч после обучения носит неспецифический характер и наблюдается как у обучившихся животных, так и у неспособных к выработке оборонительного рефлекса животных, подвергнутых обучению. Кроме того, активация МАР-киназ спустя 4 ч наблюдается как в париетовисцеральном, так и в педальных, и церебральных ганглиях. [В церебральном ганглии уровень фосфорилирования ERK составлял 3,0±0,25 по отношению к контролю, который принят за 1 (достоверно при р < 0,001)]. Активация МАРK/ERK спустя 4 ч, вероятно, отражает адаптивные механизмы, индуцируемые в ответ на подкрепляющий стимул. Таким образом, первый пик активации МАРK каскада может вызываться серотонин/цАМФ-зависимой индукцией, опосредующей подкрепляющий стимул, а второй - через положительную обратную связь вновь синтезируемыми факторами роста, взаимодействующими с тирозинкиназными рецепторами, а также пептидами или другими биологически активными соединениями.

Чтобы убедиться в специфичности эффекта активации MAPK/ERK мы вводили животным ингибитор MAP-киназного каскада PD 98059 (Cell Signaling) (40 мкМ), который предотвращает активацию MAPK/ERK через ингибирование вышележащей MEK-киназы.

Рис. 5. Ингибирование MAPK/ERK каскада в ЦНС взрослых животных при введении ингибитора МЕК-киназы PD 98059. Раств-ль -- животные, которым вводили растворитель для PD 98059, DMSO. PD -- животные, которым вводили ингибитор PD 98059, растворенный в DMSO. Показано отношение фосфорилированных форм к тотальным формам МАР-киназ. Число независимых экспериментов: для каждой группы N=7, *- p<0,01,**-p<0,03 (ANOVA). Над графиком показан репрезентативный Вестерн-блот.

Было показано, что введение PD 98059 ингибирует увеличение активации MAPK/ERK, вызванное обучением (F(1, 12)=6,2; p<0,03 между тренированными PD-обработанными животными и тренированными животными, которым вводили физиологический раствор с растворителем для PD 98059) (Рис. 5). Более того, инъекция животным MEK-ингибитора PD 98059 за 30 минут до обучения предотвращала выработку рефлекса пищевой аверзии (животных тестировали через 24 часа после обучения). У всех 7 животных, которым вводили PD 98059, рефлекс не вырабатывался.

2.3. Исследование функционирования МАРK/ERK-каскада в функционально различных нейронах ЦНС виноградной улитки при обучении.

Дальнейшее изучение экспрессии и активации МАР-киназ ERK проводили на функционально различных нейронах, связанных с формированием условного оборонительного рефлекса (нейроны процеребрума и командные нейроны оборонительного поведения).

Рис. 6. Схема ЦНС Helix. Изображены процеребрумы левого (ЛЦ) и правого (ПЦ) церебральных ганглиев, командные нейроны левого париетального (левый париетальный второй -- ЛПа2 и левый париетальный третий -- ЛПа3) и правого париетального ганглиев (ППа2 и ППа3, соответственно), группа Н нейронов левого париетального ганглия и пул Д. (Адаптированная схема, Дьяконова, 1985, 1997)

Нейроны процеребрума (высшей обонятельной структуры наземных легочных моллюсков) участвуют в организации поведения, связанного с восприятием и обработкой запахов (Glperin and Tank, 1990; Zakharov et al, 1998; Nikitin and Balaban, 2000; Inoue et.al, 2001). Как мы уже отмечали выше, в качестве условного стимула мы использовали морковь, запах которой привлекает животное. Командные нейроны оборонительного поведения вызывают генерализированную оборонительную реакцию и являются основным пластическим звеном данного рефлекса (Литвинов, Логунов, 1979; Balaban, 2002). Контролем служили нейроны пула Д, которые не входят непосредственно в дугу изучаемого оборонительного рефлекса, и группа Н (Рис.6). В экспериментах анализировали объединенные экстракты из командных нейронов левого париетального ганглия ЛПа2 и ЛПа3 (ЛПа(2/3)) и, независимо, сумму командных нейронов из правого париетального ганглия, ППа2 и ППа3 (ППа(2/3)). Кроме того, объединяли идентичные командные нейроны из 3-х улиток. Основываясь на данных предыдущих экспериментов, для исследования экспрессии и активации MAPK/ERK в функционально различных нейронах была выбрана временная точка 10 минут после обучения. Для анализа экспрессии и активации MAРK/ERK в отдельных нейронах был отработан метод микроварианта Вестерн блот анализа, который позволяет идентифицировать белки 3-4 нервных клеток.

Получено, что спустя 10 минут после обучения значительно возрастает активация MAPK/ERK в нейронах процеребрума, связанных с анализом запахов и в командных нейронах оборонительного поведения правого париетального ганглия ППа(2/3). Следует отметить, что в командных нейронах левого париетального ганглия, ЛПа(2/3), уровень активации MAPK/ERK почти не отличим от уровня контроля (1,01±0,18; p=0,95) (Рис. 7). В нейронах пула Д, которые не входят напрямую в дугу изучаемого рефлекса, достоверного увеличения активации MAPK/ERK не наблюдали. В группе Н уровень активации MAP-киназ ERK достоверно повышается. Функция этих нейронов пока остается невыясненной.

Таким образом, через 10 минут после обучения самые значительные изменения наблюдаются в нейронах, которые вовлечены в формирование оборонительного рефлекса пищевой аверзии: нейронах процеребрума и командных нейронах оборонительного поведения правого париетального ганглия ППа(2/3).

Рис. 7. Анализ активации МАРK/ERK в идентифицируемых нейронах Helix после обучения.

А. Репрезентативный иммуноблот.

Б. Относительное содержание фосфо-форм МАРK/ERK в нейронах процеребрума, командных нейронах оборонительного поведения правого ППа(2/3) и левого ЛПа(2/3) париетальных ганглиев, нейронах пула Д и группы нейронов Н левого париетального ганглия ЦНС виноградной улитки спусти 10 минут после обучения. К -- контроль, О -- обучение. *- p < 0,01; **- p < 0,02; ***- p<0,04. (t-критерий Стьюдента).

3. Влияние серотонина на активацию МАРK/ERK в идентифицируемых нейронах виноградной улитки.

С целью изучения вклада серотонинэргической системы в активацию MAPK/ERK в отдельных нейронах, участвующих в организации оборонительного поведения и обучении, провели исследования in vitro. Для этого ЦНС инкубировали в физиологическом растворе с добавлением серотонина (1X10-4M) в течение 3,5 часов. Известно, что длительная инкубация ЦНС моллюсков в данных концентрациях серотонина моделирует процесс долговременной сенситизации, лежащий в основе формирования оборонительных рефлексов. Чтобы убедиться в специфичности эффекта активации MAPK/ERK часть экспериментов проводили с добавлением ингибитора MAP-киназного каскада PD 98059 (Cell Signaling) (20 мкМ). (Рис. 8)

Рис. 8. Анализ активации МАРK/ERK в идентифицируемых нейронах ЦНС Helix после инкубации ЦНС с серотонином.

А. Репрезентативный иммуноблот.

Б. Относительное содержание фосфорилированных форм МАРK/ERK в нейронах процеребрума, командных нейронах оборонительного поведения правого ППа (2/3) и левого ЛПа (2/3) париетальных ганглиев, нейронах пула Д и группы Н ЦНС виноградной улитки. К -- контроль (инкубация с DMSO), 5-HT -- инкубация в растворе серотонина с DMSO, 5-HT+PD -- инкубация в растворе серотонина с ингибитором PD98059 и DMSO.

* - p<0,01; ** - p<0,04, ANOVA.

Из рисунка 8 видно, что наблюдается серотонин-индуцируемая активация MAPK/ERK в процеребруме (F(2,18)=14,05, p<0,01, ANOVA) и в командных нейронах оборонительного поведения правого париетального ганглия (ППа(2/3)), (F(2,13)=10,86, p<0,01, ANOVA). Активация снимается блокатором МAP-киназного каскада PD98059. В командных нейронах левого париетального ганглия (ЛПа(2/3)) активация MAPK/ERK практически не отличается от контроля (1,14±0,31; p<0,80), как и в нейронах пула Д (1,37±1,82; p=0,10). В группе Н увеличение выражено меньше, чем в процеребруме или командных нейронах ППа(2/3), но достоверно (F(2,15)=6,16, p<0,01, ANOVA). Таким образом, серотонин-индуцируемая активация MAPK/ERK наблюдается в различных функциональных группах нейронов и сходна с активацией MAP-киназ в этих нейронах при формировании условного рефлекса пищевой аверзии.

4. Сравнение активации MAPK/ERK при обучении ювенильных и взрослых Helix.

В следующей серии экспериментов был проведен сравнительный анализ экспрессии и активации MAPK/ERK после обучения у взрослых и ювенильных (2-3 месячных) животных. Известно, что улитки в этом возрасте не способны к выработке условных оборонительных рефлексов (Zakharov and Balaban, 1987). Сравнение экспрессии и активации ERK в париетовисцеральном комплексе ганглиев взрослых и ювенильных животных проводили спустя 10 минут, 1 час, 2 час или 3,5 часа после обучения (Рис. 9). В качестве контроля использовали наивных животных. Так как ганглии ювенильных животных малы, их объединяли по два в каждом образце.

Обнаружили, что базальная экспрессия ERK у ювенильных и взрослых животных сходна. Однако уровень активации ERK у этих групп животных существенно отличался (рис. 9). По результатам двухфакторного анализа ANOVA (возраст (2)*время (5)) обнаружены достоверные отличия по возрасту (F(1, 68)=158, p<<0,001), по времени (F(4, 68)=7,1, p<<0,001) и эффекту взаимодействия (F(4, 68)=7,2, p<<0,001). У наивных ювенильных животных уровень активации ERK по сравнению с наивными взрослыми существенно ниже (F(1, 21)=19; p<0,001). Более того, активация ERK в ЦНС взрослых животных значительно возрастает через 10 минут и через час после обучения, по сравнению с наивными взрослыми F(1, 12)=15, p<0,003 и F(1, 12)=10; p<0,008, соответственно. В то время как у ювенильных улиток повышение уровня активации ERK при обучении спустя 10 минут и 1 час не происходит (рис. 9).

Рис. 9. Анализ активации MAPK/ERK в ЦНС взрослых и ювенильных животных после обучения.

Относительное содержание фосфо-ERK к ERK (Вестерн блот анализ). Значения нормализованы относительно наивных взрослых животных.

* - p<0,04 по результатам однофакторного анализа ANOVA отличия достоверны между наивными взрослыми животными и каждой другой группой.

К -- наивные животные.

Таким образом, недостаток активации MAPК/ERK в ЦНС, через нарушение экспрессии генов, необходимых для формирования долговременных механизмов пластичности, может определять неспособность ювенильных животных к выработке оборонительных рефлексов.

5. Анализ активации транскрипционного фактора Elk-1 при формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии в париетовисцеральном ганглии Helix, у животных с нормальной и нарушенной способностью к обучению.

Как отмечалось выше, МАР-киназы осуществляют регуляцию экспрессии генов через фосфорилирование (активацию) ряда транскрипционных факторов, в том числе, связывающихся с регуляторным элементом SRE (Dash et al, 2005). Кроме того, при обучении взрослых Helix, происходит активация транскрипционных факторов, связывающихся с данным регуляторным элементом. У ювенильных животных с незрелыми механизмами формирования условных оборонительных рефлексов спектр ТФ, связывающихся с элементом SRE, отличен от взрослых, и активация не происходит (Гринкевич и др., 2002). Одним из ТФ, активирующим экспрессию генов через элемент SRE, является ТФ Elk-1. Поэтому представлялось актуальным провести сравнительные исследования активации транскрипционных факторов Elk-1 у животных с разной способностью к обучению (наивных животных; животных, которым вводили нейротоксин 5,7-диокситриптамина (5,7-ДОТ), а также у ювенильных животных). Для изучения экспрессии и активации факторов Elk-1 применяли метод Вестерн блот анализа с использованием антител к тотальным и фосфорилированным формам белка Elk-1. Исследование показало, что при обучении взрослых животных не наблюдается увеличение фосфорилирования Elk-1 по сравнению с контролем. Однако, у 5,7-ДОТ- обработанных и ювенильных животных, подвергнутых процедуре обучения, происходит значительное угнетение активации Elk-1 по сравнению с взрослыми обученными и наивными животными (Взрослые обученные: 0,76±0,19; наивные 1±0,12. Обученные 5,7-ДОТ-обработанные: 0,41±0,22; ювенильные: 0,06±0,26. Контроль принят за 1, p<0,05). При этом, у ювенильных животных, как и у 5,7-ДОТ-обработанных, базальный уровень синтеза и фосфорилирования белков Elk-1 достоверно не отличается. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что способность животных к формированию долговременных форм условных оборонительных рефлексов коррелирует с уровнем фосфорилирования ТФ Elk-1. Низкий уровень активации Elk-1 у 5,7-ДОТ-обработанных и ювенильных животных частично может быть связан с недостаточной активацией или дезактивацией MAPK/ERK каскада. Дезактивация MAPK/ERK-каскада у этих животных описана нами в предыдущих разделах. Кроме того, в дезактивации p-Elk возможно участие фосфатаз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современной нейробиологии большое внимание уделяется изучению механизмов пластичности, лежащих в основе формирования долговременных механизмов обучения и памяти. В последние годы широко исследуется роль внутриклеточных регуляторных каскадов и нижележащих транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, продукты которых непосредственно вовлекаются в пластические перестройки. Таким образом, комплексные исследования регуляции активации MAPK/ERK каскада, проведенные на простой нервной системе моллюска Helix являются актуальными.

Полученные нами данные о значительной и избирательной индукции MAPK/ERK в отдельных областях ЦНС и отдельных идентифицированных нейронах Helix, свидетельствуют о важной роли MAPK/ERK каскада в механизмах пластичности. Подтверждением специфичности связи активации MAP-киназы ERK с обучением являются наши данные об отсутствии активации MAPK/ERK каскада у животных с дисфункцией серотонинэргических терминалей (введение нейротоксина 5,7-ДОТ), неспособных к формированию оборонительных рефлексов, у животных, которым вводили ингибитор MAP-киназ ERK PD 98095, а также ювенильных животных. Кроме того, результаты введения 5,7-ДОТ позволяют сделать вывод о важной роли серотонина в индукции активации MAPK/ERK каскада. Этот вывод также подтверждают наши данные по отсутствию активации MAP-киназы ERK у ювенильных животных, подвергнутых обучению, так как в настоящее время неспособность ювенильных животных к формированию ассоциативных и неассоциативных форм оборонительных рефлексов связывают с незрелостью серотонинэргической системы. Однако остается неизвестным, с пресинаптическим, или постсинаптическим звеном трансдукции серотонинового сигнала связаны эти явления. Дальнейшие сравнительные исследования состава и содержания серотониновых рецепторов в ЦНС взрослых и ювенильных животных, начатые нами, представляются перспективными.

Известно, что мишенями MAPK/ERK являются транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов через регуляторные элементы SRE, CRE и нижележащие транскрипционные факторы семейства AP-1, и активация этих факторов происходит при обучении Helix (Гринкевич, 2001). Таким образом, низкий уровень активации MAPK/ERK у 5,7-ДОТ-обработанных и ювенильных животных, через нарушение экспрессии нижележащих генов может лежать в основе неспособности животных к формированию долговременных форм оборонительных рефлексов.

ВЫВОДЫ

1. В ЦНС виноградной улитки экспрессируется МАР-киназа ERK2 с ММ 42 кДА. При выработке условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии наблюдается активация МАРK/ERK каскада. Разные сроки формирования данного рефлекса характеризуются разным уровнем активации МАР-киназ ERK. Причем, в ганглиях (париетовисцеральном, церебральном и педальном), играющих разную роль в формировании этого рефлекса, степень активации МАРK/ERK каскада различна.

2. Значительные различия в активации МАРK/ERK каскада при обучении наблюдаются также в функционально-отличных идентифицированных нейронах Helix. Максимальная активация MAPK/ERK наблюдается в нейронах процеребрума, анализирующих информацию о запахах (условный стимул), и командных нейронах оборонительного поведения ППа(2/3) (основное пластическое звено данного рефлекса). При этом инкубация ЦНС с модуляторным медиатором серотонином вызывает однонаправленную с обучением активацию МАРK/ERK в исследуемых нейронах Helix.

3. Введение нейротоксина 5,7-ДОТ, вызывающего дисфункцию серотониновых терминалей и редуцирующего способность к данной форме обучения, приводит к значительному снижению активации МАР-киназ ERK на ранних стадиях обучения, что свидетельствует о важной роли серотонина в индукции этого каскада.

4. Активация МАРK/ERK каскада спустя 4 часа после обучения наблюдается во всех ганглиях, как у нативных, так и у 5,7-ДОТ-обработанных животных, что, вероятно, связано с включением неспецифических адаптивных процессов в ответ на сенситизирующий безусловный стимул.

5. У ювенильных животных с незрелыми механизмами условных оборонительных рефлексов отмечается драматично низкий уровень фосфорилирования и соответственно активации МАРK/ERK по сравнению с взрослыми, в то время как уровень экспрессии этих киназ сравним. В отличие от взрослых животных обучение не индуцирует МАРK/ERK каскад в ЦНС ювенильных улиток спустя 10 мин и 1 час после процедуры обучения.

6. Серотонин-индуцируемый MAPK/ERK каскад играет существенную роль в формировании условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии у моллюска Helix lucorum.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Гудзик К.А., Гринкевич В.В., Харченко О.А. Сравнительный анализ активации транскрипционного фактора семейств ELK-1 в ЦНС животных, обладающих разной способностью к обучению. // Доклады Академии Наук. 2004.-Т. 397, №2.- С. 275-278.

2. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Харченко О.А. Сравнительный анализ активации МАР/ERK в ЦНС животных, обладающих разной способностью к обучению. // Российский физиологический журнал им. Сеченова, 2006.- T.92 , №5.- С. 536-545. [Переведено. Comparative analysis of the activation of MAP/ERK kinases in the CNS of animals with different learning abilities. Neurosci Behav Physiol. 2007.- 37(7).-P.715-20]

3. Grinkevich L.N., Lisachev P.D., Kharchenko O.A., Vasil'ev G.V., Expression of MAP/ERK kinase cascade corresponds to the ability to develop food aversion in terrestrial snail at different stages of ontogenesis, Brain Res. 2008.- №1187.-P.12-19.

Тезисы:

1. Гринкевич Л.Н, Лисачев П.Д., Васильев Г.В., Гудзик К.А., Харченко О.А. Регуляция экспрессии генов в нейронах центральной нервной системы HELIX при обучении. // Тез. докл. III съезда ВОГиС. Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития. Москва, 2004.- С. 381.

2. Харченко О.А., Баранова К.А. Дисфункция серотониновых терминалей нейронов ЦНС взрослых улиток нарушает способность к формированию условных оборонительных рефлексов через ингибирование МАР/ERK киназного регуляторного каскада. // Тез. докл. всероссийской конференции молодых исследователей, «Физиология и медицина». Вестник молодых ученых. 2005.- С. 130.

3. Харченко О.А., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Гринкевич Л.Н. Роль серотонина в формировании условного оборонительного рефлекса у Helix (молекулярно-генетические аспекты). // Тез. докл. I Съезда физиологов СНГ. Сочи, Дагомыс. 2005.- С. 46-47.

4. Харченко О.А., Баранова К.А., Лисачев П.Д, Гринкевич Л.Н. Серотонин-индуцированная активация МАР/ERK киназного регуляторного каскада лежит в основе формированию условных оборонительных рефлексов пищевой аверзии у HЕLIX. // Тез. докл. международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения». СПб, 2005.- С. 97-98.

5. Гринкевич Л.Н., Лисачев П.Д., Баранова К.А., Харченко О.А. Роль МАР/ERK киназного каскада в регуляции экспрессии генов при обучении (онтогенетические аспекты). // Тезисы международного симпозиума «Механизмы адаптивного поведения». СПб, 2005.- С. 26-27.

6. Харченко О.А., Баранова К.А. Ключевая роль серотонина в индукции MAP/ERK киназного каскада и способности к обучению у Helix. // Тез. докл. X Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2006.- С. 171.

7. Харченко О.А., Воробьева О.В. Серотонин индуцирует митоген-активируемый (MAP/ERK) киназный каскад в командных нейронах оборонительного поведения у Helix. // Тез. докл. 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». СПб, 2007.- С. 485-486.

8. Гринкевич Л.Н., Харченко О.А., Лисачев П.Д. Роль митоген-активируемых каскадов в формировании механизмов пластичности. // Тез. докл. ХХ Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва, 2007. С. 31.

9. Харченко О.А., Гринкевич Л.Н. Формирование условного оборонительного рефлекса пищевой аверзии у Helix (роль серотонина). // Тез. докл. конференции молодых ученых, «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды».СПб, 2007.-С.79.

10. Гринкевич Л.Н., Харченко О.А., Лисачев П.Д. Внутриклеточная сигнализация в механизмах формирования долговременной памяти. // Тез. докл. II Съезда Общества клеточной биологии. СПб, 2007. С. 735.

11. Харченко О.А., Воробьева О.В., Гринкевич Л.Н. Формирование условного рефлекса пищевой аверзии сопровождается разной степенью активации MAP/ERK-киназного каскада в идентифицированных нейронах HELIX. // Тез. докл. конференции «Системный контроль генетических и цитогенетических процессов», посвященной 100-летию со дня рождения М. Е. Лобашева. СПб, 2007.- С. 94-95.

12. Kharchenko O.A., Grinkevich L.N. Activation of serotonin-indused MAP/ERK regulatory cascade in different ganglia and identified neurons of Helix CNS during learning. // PENS/Hertie winter school, «The design of neuronal Networks: Contributions from Invertebrates». Obergurgl, Austria, 2008.

Работа проводилась при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ № 02-04-49731 и № 08-04-01325.

Размещено на Allbest.ru