При использовании модели венозного стаза у крыс (с активацией внутреннего пути свертывания) наблюдали антитромботическую активность СХ с ММ 75 кДа и содержанием серы 13,7% (Дрозд Н.Н., 1991). При в/в введении СХ в единицах антитромбиновой активности, геморрагический эффект ниже, в сравнении с эффектом НФГ, что можно объяснить незначительным влиянием на тромбоциты и низким агрегационным воздействием СХ при активации аденозиндифосфорной кислотой. ПСТ нейтрализует аIIa активность СХ в гравиметрическом соотношении 1:1.

Хиторин - механическая смесь СХ (ММ 75 кДа, СС 1,25) и НФГ в весовом соотношении 1:1. Антитромбиновая активность хиторина составляет 80 ЕД/мг, аХа - 83 ЕД/мг. Хиторин можно использовать в/в в дозе 4 мг/кг, что в единицах активности составляет 320 aIIa ЕД/мг и 332 aXa ЕД/мг. Период полувыведения равен 120 мин, полностью исчезает из кровяного русла через 4 час. Для быстрой нейтрализации АК эффекта в организме можно использовать ПСТ, с которым составляющие компоненты хиторина создают эквимолярные комплексы. При в/в введении хиторина число тромбоцитов снижается в меньшей степени, чем при введении НФГ в такой же дозе. Достоверного снижения числа тромбоцитов в течение 6 час после введения, в сравнении с контролем, не наблюдали. По сравнению с НФГ, хиторин проявляет меньшую геморрагическую активность, почти в два раза. Антитромботическое (АТБ) действие на модели венозного стаза у крыс сопоставимо с действием НФГ. Таким образом, в/в введение экспериментальным животным хиторина вместо НФГ приводит к снижению геморрагического эффекта с сохранением АК и АТБ активностей. Курс лечения хиторином может стоить дешевле, чем курс лечения НФГ, так как стоимость 1 мг СХ в 10-70 раз меньше, чем стоимость 1 мг НФГ.

3. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных сульфатов хитозана

Исследовали АК активность низкомолекулярных сульфатов хитозана (НМСХ) с ММ 1,6 - 25,0 кДа, полученных несколькими независимыми методами. Антитромбиновая активность НМСХ с ММ 4,5-25 кДа [получены гидролизом высокомолекулярных СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа ФК Streptomyces kurssanovii (шифр ХФ)] некоторых фракций образцов с ММ 82 и 125 кДа (рис.8) незначительно возрастает. Однако, для СХ с ММ 75 кДа такого эффекта не наблюдали. Какой-либо связи aIIa активности с ММ не отмечено. Активность НМСХ против фактора Ха составила 0-3 ЕД/мг, СХ - 0 ЕД/мг. Для получения образцов НМСХ с большей АК активностью использовали СХ с ММ 25 кДа (исходные СХ с ММ 75 кДа - СХ К2, 82 кДа - СХ К1 и 125 кДа - СХ К3) и буфер с рН 6,0 (рис. 9). У НМСХ полученных из СХ с ММ 75 и 125 кДа аХа активность увеличивается с уменьшением ММ. Анти-фактор Ха активность полученных НМСХ выше в 1,5-2,0 раза, чем у НМСХ, полученных непосредственно их СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа.

Рис. 8. Антитромбиновая активность образцов СХ с ММ 4,5 - 125 кДа. Сульфатировали хитозан краба (Биопрогресс, Россия). После гидролиза (pH 4,5) СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа ФК Streptomyces kurs. получали фракции НМСХ с ММ 4,5; 6; 8,5; 15 и 25 кДа; * - (p<0,05) достоверность различий с aIIa активностью СХ с ММ 75, 82 и 125 кДа.

Рис. 9. Антикоагулянтная активность образцов СХ с ММ 1,6 - 15 кДа.

Для получения НМСХ с ММ 1,6; 2,5; 3,7; 5,3 и 15 кДа (c большей аХа активностью) из СХ с ММ 25 кДа ферментативный гидролиз осуществляли при pH 6,0; * - (p<0,05) достоверность различий с АК активностью СХ с ММ 25 кДа.

Анти-фактор Ха активность до 50 -120 ЕД/мг появилась у СХ полученных сульфатированием низкомолекулярных образцов (рис. 10). Максимальная аХа активность НМСХ с ММ 25 - 70 кДа (шифр ХЭ), полученных с помощью экструзионного дезацетилирования высокомолекулярных СХ составила 52 - 61 ЕД/мг, отношение активностей аХа/ aIIa = 1,4 - 22,0 (рис. 10 Б). При сульфатировании низкомолекулярных СХ, полученных кислотным гидролизом хитозана получили образцы НМСХ с ММ 8-25 кДа (шифр ХК), аХа активности составили 51 - 131 ЕД/мг, отношение активностей аХа/ aIIa = 7 - 21 (рис. 10 В). При сульфатировании низкомолекулярных образцов, полученных ферментативным гидролизом Streptomyces kurssanovii, получили образец (ММ 29 кДа, получен из СХ-гидрохлорида) с высокими аХа активностью (68 ± 5 ЕД/мг) и отношением активностей аХа/ aIIa (5,2) (рис. 10 В). Образцы ММ 1,6-25 кДа (получены из СХ с ММ 50 или 300 кДа, рис. 10 А) показали невысокую антикоагулянтную активность.

Сульфатирование низкомолекулярных образцов осуществляли на кафедре технологии химических волокон Московского государственного текстильного университета; ось Х - молекулярная масса, кДа; ось Y - антикоагулянтная активность, ЕД/мг

СХ с ММ 30 кДа, полученный из исходного хитозана, как СХ с ММ 25 кДа и 35 кДа, полученные из ХЭ-45 кДа, демонструют незначительное отношение активностей с аХа/aIIa, что коррелирует с относительно высокой средней ММ образцов и с низким содержанием низкомолекулярных фракций, а также подтверждается высокими аIIa активностями (37-85 ЕД/мг) и фактом, что и нефракционированный сульфат хитозана из ХЭ-45 с ММ 25 кДа и его фракция с ММ 15 кДа характеризуются более низкой aIIa активностью, соответственно более высоким отношением активностей аХа/aIIa.

Рис. 10. Антикоагулянтная активность сульфатированных НМСХ, полученных кислотным (ХК) / ферментным (ХФ) гидролизами или экструзионным дезацетилированием (ХЭ).

Очевидно, что ММ 15 кДа не достаточно низка, для того чтобы аХа активность возрастала. Даже понижение ММ СХ до 11 кДа (получен ферментативным гидролизом хитозана) не обеспечивает достижение высокой аХа активности. И только два образца СХ со средней ММ 8-10 кДа (получены из хитозана ХК), и, очевидно, более обогащенные низкомолекулярными фракциями, демонстрируют довольно высокую аХа активность, в 4-5 раз превышающую аIIa активность. С уменьшением ММ образцов СХ аХа активность возрастает. Коэффициент корреляции между аХа активностью и ММ составляет r =-0,64. Изменение содержания серы, в пределах 15,7-16,2 %, фактически не влияет на активность (r = 0,03). Для аIIа активности обнаружена положительная корреляция с ММ (r = 0,69) и содержанием серы (r = 0,38). При сульфатировании хитозанов происходит существенное снижение степени полимеризации полимеров - в 2-4 раза, что обеспечивает получение СХ, ММ которых находится на уровне таковых коммерческих образцов НФГ (10-20 кД), но превышает ММ НМГ. Анализ связи между структурными элементами исследуемых аминогликанов и АК активностью позволил заключить, что: 1. Данные относительно зависимости аIIа активности образцов СХ от ММ противоречивы (от умеренной степени зависимости до отсутствия таковой), по всей вероятности, в силу различия способов приготовления образцов СХ. Однако это не помешало всем исследованным образцам СХ, независимо от способа приготовления, продемонстрировать умеренно-сильную связь аХа активности с ММ. 2. С увеличением количества серы аIIа активность образцов СХ возрастает, при этом связь не сильная. Анти - Ха активность исследованных СХ либо возрастает с увеличение количества серы, либо не зависит от содержания серы. Химически модифицированные полисахариды привлекают большой интерес, так как, изменяя структуру можно добиться увеличения АК активности. При карбоксиметилировании СХ с ММ 56 кДа антитромбиновая активность увеличивается в 10 раз, аХа - в 6 раз. С помощью биоспецифичного электрофореза в геле агарозы продемонстрировано наличие комплексов между СХ с ММ 9-40 кДа (количество серы 12,0-16,8%, aIIa активность 13-58 ЕД/мг, аХа активность 2-112 ЕД/мг) и сульфатом протамина (ПСТ). С увеличением аХа активности высота пиков преципитации возрастает (r = 0,75 - 0,92, рис. 11), тесная отрицательная корреляция существует между высотой (h) и площадью (S) пиков преципитации, с одной стороны, и количеством серы (rS/h,250=-0,99; р<0,05) и aIIa активностью (raIIa/S,500=-0,86; р<0,05), с другой. Умеренная отрицательная связь от r -0,41 до -0,74 (р<0,05) отмечена между ММ и размерами пиков преципитации.

Рис 11. Высота пиков преципитации между СХ с аХа активностью 2-112 ЕД/мг (ММ 9-40 кДа, количество серы 12,0-16,8%, aIIa активность 13-58 ЕД/мг) и сульфатом протамина

Замечено, что контуры пиков преципитации у СХ с ММ 10 кДа наиболее четкие и выраженные, а сами пики более светлые, в отличие от более темно окрашенных с менее выраженными границами пиков преципитации СХ с большими ММ. Подобное может свидетельствовать о меньшей подвижности комплексов СП с СХ с ММ больше 20 кД. Комплексообразование СХ с ММ 9-40 кДа с хитозанами [ММ 6-21 кДа, степень дезацетилирования (СД) 61-93%] также показано при биоспецифичном электрофорезе в геле агарозы. Все образцы хитозанов демонстрируют наличие пиков преципитации с сульфатами хитозана. Сравнимый с ПСТ эффект показали образцы хитозана c ММ не ниже 6 кДа и СД 60-85%.

Рис. 12 Коэффициенты корреляции (p<0,05) между молекулярной массой хитозанов и высотой пиков преципитации с сульфатами хитозана (СХ)

Рис. 13. Коэффициенты корреляции (p<0,05) между степенью дезацетилирования хитозанов и высотой пиков преципитации с СХ

В диапазоне количества серы в СХ 14,6 - 16,8 % коэффициенты корреляции между высотой пиков преципитации и ММ поликатионов-хитозанов возрастают до 0,47-0,58 (рис.12). С увеличением степени дезацетилирования поликатионов-хитозанов высота пиков преципитации для СХ с ММ 9-30 кДа снижается [r = (-0,59) - (-0,77] (рис. 13).

А. Влияние поликатионов (конечная концентрация 0,03 мкг/мл) на ингибирование антикоагулянтами (К; 0,03 мкг/мл) амидолитической активности тромбина

Б. Влияние поликатионов (конечная концентрация 0,03 мкг/мл) на ингибирования антикоагулянтами (К; 0,03 мкг/мл) амидолитической активности фактора Ха

Рис. 14. Нейтрализация хитозанами (Х) с ММ 16 кДа и 21 кДа и сульфатом протамина (ПСТ) ингибирования антикоагулянтами амидолитической активности тромбина и фактора Ха (без антикоагулянтов А 405/мин=150±0,03 для рис. 14 А и 0,200±0,028 для рис. 14 Б); * - (p<0.05) достоверность различий с показаниями К.

Ингибирование амидолитической активности Т посредством СХ с ММ 9 кДа нейтрализовали с помощью ПСТ и хитозана с ММ 16 и СД 91%. В меньшей степени нейтрализует аIIa активность хитозан с ММ 21 кДа и СД 61% (рис. 14 А). ПСТ полностью снимает ингибирование амидолитической активности фактора Ха у СХ и только на 17% у НФГ и НМГ (рис. 14 Б).

Влияние сульфатированных полисахаридов из бурых морских водорослей, травянистых и древовидных высших растений на свертывание крови человека и экспериментальных животных in vitro и in vivo.

Учитывая случаи появления заболеваний обусловленных прионами, которые могут сопровождать лекарственный материал из тканей млекопитающих [Dнaz-Nido J. и др., 2002], внимание исследователей привлекают полисахариды из водорослей, травянистых и древовидных растений [Farias W.R.L. и др., 2002; Matsubara K, 2004; Ciancia M.и др., 2007].

1. Антикоагулянтная активность фукоиданов и сульфатированной альгиновой кислоты из бурых морских водорослей in vitro и in vivo.

В последнее время возрос интерес к нанообъектам различной природы. Это связано с тем, что многие физические, химические и биологические свойства наночастиц значительно отличаются от аналогичных свойств у макроскопических объектов. Антитромбиновая активность сульфатированной альгиновой кислоты из бурой водоросли Macrocystis pyrifera (ММ 48-186 кДа) составляет 76 ЕД/мг (у альгиновой кислоты АК активнотси нет). Антитромбиновая активность сульфатированной альгиновой кислоты в наноструктурах (70-100 нм) достоверно увеличивается в 1,3 раза (рис. 15), аХа - в 2 раза при использованииив качестве осадителя CaCl2 (рис. 16).

В отличие от альгиновой кислоты из бурых водорослей нативные фукоиданы сульфатированы. Фукоиданы, выделенные из водорослей Fucus evanescens, Undaria pinnatifida, Laminaria gurjanovae, Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Costaria Costata, Laminaria saccharina с ММ 20 - 80 кДа влияют на внешний и общий пути свертывания крови удлинняя время появления фибринового сгустка в тестах тромбинового и протромбинового времени; ингибируют активность тромбина (aIIa активность достигает 1,9 - 53,2 ЕД/мг) и фактора Ха (аХа активность - 6,1 - 31,4 ЕД/мг) свертывающей системы крови. Различия в ингибировании сериновых протеаз связаны с тем, что моносахаридный состав исследованных фукоиданов, количество серы и ММ различаются, а также присутствием разных типов гликозидных связей в молекулах полисахаридов.

Рис. 15. Антитромбиновая активность сульфата альгиновой кислоты в растворе (1) и в виде наночастиц [2- осадитель CaCl2, 3- осадитель Ba(NO3)2], измеренная в тесте АЧТВ

Рис. 16. Анти-фактор Ха активность сульфата альгиновой кислоты в растворе (1) и в виде наночастиц [2- осадитель CaCl2, 3- осадитель Ba(NO3)2], измеренная в тесте РеаКлот

Так, АК активность возрастает с увеличением количества серы, снижением количества ксилозы и увеличением количесвта фукозы. Почти у всех фукоиданов, за некоторым исключением, в амидолитических определениях (в “чистой системе” с антитромбином и тромбином) снижается на один - два порядка активность в сравнении с коагулологическими определениями, это свидетельствует о том, что свою активность фукоиданы осуществляют, в основном, посредством не антитромбина, а других серпинов.

Дезацетилирование фукоидана из водоросли Fucus evanescens приводит к изменению способности фукоидана ингибировать активность тромбина и фактора Ха (по всей вероятности, ацетаные группы необходимы для проявления АК активности), тогда как после очистки его от белка и полифенолов АК активность снижается. Гидролиз фукоиданов из бурых водорослей F. evanescens и L. cichorioides иммобилизованным целлюлолитическим ФК целловиридин привел к получению фракций с большим отношением активностей аХа/aIIa (до 2,3) и меньшей АК активностью, которая коррелирует с величиной пиков преципитации с ПСТ при биоспецифичном электрофорезе. С целью деполимеризации фукоидана из бурых водорослей F. evanescens использовали гепариназу и получили фракции с ММ 8-18 кДа, у которых способность ингибировать амидолитическую активность Т посредством АТ исчезает. При сохранении ингибирования фибриногенсвертывающей активности тромбина это может свидетельствовать о вероятности участия в коагуляции кофактора гепарина II или о разрушении сайта молекулы полисахарида, ответственного за связь с антитромбином.

Фукоидан из водоросли F. evanescens в конечных концентрациях 0,01-5,00 мг/мл не способстует агрегации тромбоцитов человека; в конечных концентрациях 0,1-0,5 мг/мл достоверно снижает в 1,5-1,8 раз АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

Ферментативная деполимеризация фукоидана из водорослей Laminaria saccharina (аХа = 9,6±0,9 ЕД/мг) при обработке экстрактом из гепатопанкреаса камчатского краба приводит к получению образа с достоверно большей в 1,7 раз ингибиторной активностью по отношению к фактору Ха, антитромбиновая активность не увеличивается. Анализ двойных эффективных концентраций в коагулологических и амидолитических тестах показал, что для осуществления аIIa активности необходим АТ. Для осуществления аХа активность требуются другие серпины. Значительную роль в проявлении АК активности фукоидана из водорослей L. saccharina играют остатки фукозы и сульфат, что определено в результате анионообменной хроматографии. В зависимости от состава исследованных фракций фукоиданов для проявления aIIa активности необходимы либо только АТ (для фукоидана с наибольшим количеством серы и фукозных остатков), либо еще и другие серпины. Снижение аХа активности в 5-10 раз при определениях в тестах с АТ (“чистая система”) свидетельствует о необходимости других серпинов.

Рис. 17. Нейтрализация антитромбиновой активности фукоиданов сульфатом протамина в тесте АЧТВ; * - (p<0.05) достоверность различий с данными ПСТ 0 мкг/мл при снижении антитромбиновой активности

Показана электрофоретическая подвижность комплексов исследованных фукоиданов (нативных; дезацетилированных; фракций с меньшей ММ, полученных ферментативным гидролизм нативных) в агарозном геле с сульфатом протамина. Фукоиданы со специфическими АК активностями менее 5 ЕД/мг не образуют комплексы с ПСТ. Величина пиков преципитации сильно положительно коррелирует с антитромбиновой и аХа активностями и слабо - с количеством фукозы. С увеличением ксилозы размеры пиков преципитации уменьшаются. Чем больше концентрация фукоидана, тем больше размеры пиков преципитации. Зоны преципитации гидролизованного образца фукоидана имеют характерные для низкомолекулярных сульфатированных полисахаридов размытые контуры.

Сульфат протамина нейтрализует аIIа активность фукоиданов из Fucus evanescens (рис. 17 А) и L. cichorioides (рис. 17 Б) в тесте АЧТВ. Гравиметрическое отношение антидот/антикоагулянт для фукоидана из F. evanescens составляет 1, для фукоидана из L. cichorioides находится в диапазоне 0,67-1,35 (сравнение с НФГ: 0,75-1,49). Известно, что 1 мг ПСТ нейтрализует 100 ЕД (0,53-0,83 мг) НФГ [Fourtounas C, 2008]. Учитывая большую в 5-6 раз аIIa активность НФГ, можно утверждать, что механизм нейтрализации АК активности исследованных фукоиданов сульфатом протамина отличается от такого же механизма у НФГ.

Рис. 18. Антитромботический эффект фукоидана из F. evanescens; * - (p<0,05) достоверность различий с показаниями в контроле (0 мг/кг)

Рис. 19. Геморрагический эффект фукоидана из F. evanescens; * - (p<0,05) достоверность различий с показаниями для НФГ

Внутривенное введение фукоиданов из водорослей F. evanescens (крысам в дозах 1,3 и 5 мг/кг; кроликам в дозах 5 и 10 мг/кг) и L. cichorioides (крысам в дозах 1,3 и 5 мг/кг) приводит к возрастанию АК активности и длительности действия с увеличением дозы. Наблюдали достаточную для терапевтического эффекта aIIa активность плазмы крыс до 2,5 и 3,0 ЕД/мл. Анти-фактор Ха активность плазмы крыс при введении фукоидана из L. cichorioides достигает 1 ЕД/мл. Несмотря на большее соотношение активностей аХа/aIIa плазмы крыс для фукоидана из F. evanescens, сила и длительность АК эффекта фукоидана из L. cichorioides больше. Это можно объяснить различием в специфических аIIa активностях образцов (у фукоидана из L. cichorioides aIIa активность в два раза выше, чем у фукоидана из F. evanescens), при практически одинаковых ингибиторных активностях по отношению к фактору Ха.

По весу влажного тромба, полное ингибирование роста тромба на модели венозного стаза у крыс наблюдали при дозах фукоидана из F. evanescens 7 и 10 мг/кг (рис. 18). Геморрагический эффект фукоидана из F. evanescens выражен в меньшей степени, чем у НФГ (рис. 19).

Наиболее перспективными для углубленного фармакологического исследования являются образцы F. evanescens, U. pinnatifida, L. gurjanovae.

2. Антикоагулянтная активность сульфатированных галактоманнанов и арабиногалактана in vitro и in vivo.

Одним из доступных видов растительных полисахаридов считается арабиногалактан, который содержится в древесине лиственницы сибирской в количестве до 20 % массы. Антитромбиновая активность равная 2 ЕД/мг появляется при сульфатировании арабиногалактана из древесины лиственницы до степени сульфатирования 4 %. Известно, что АК активность сульфатированных полисахаридов увеличивается с возрастанием количества серы [Li B. и др., 2009; Costa L.S. и др., 2009].

Специфические АК активности сульфатированных галактоманнанов (СГМ) из семян бобового травянистого растения Cyamуpsis tetragonуlobus с ММ от 54,2 до 245,6 кДа достигают 76 - 87 aIIa ЕД/мг и 6,8 - 12,6 аХа ЕД/м и не зависят от ММ (рис. 20).

Рис. 20. Антикоагулянтная активность сульфатированных фракций галактоманнана гуар из Cyamopsis tetragonoloba (L.) Taub.

При в/в введении СГМ с ММ 127 кДа (aIIa активность - 35,8 ± 1,8 ЕД/мг; аХа - 6,6 ± 0,5 ЕД/мг) время свертывания плазмы крыс в тесте АЧТВ удлиняется с увеличением дозы от 1 до 3 мг/кг. Активность плазмы против тромбина в результате введения СГМ возрастает с увеличением дозы. Продолжительность эффекта достигает 180 - 300 мин. То есть, СГМ с ММ 127 кДа и степенью сульфатирования 1,46 при невысокой специфической аIIa и совсем незначительной аХа активностях вызывает высокую АК активность плазмы при внутривенном введении крысам. Противотромботическую активность в 100% наблюдали при дозе 3 мг/кг. Для достижения одинакового АТБ эффекта СГМ потребуется в 1,8 раза больше, чем НФГ (рис. 21).

Рис. 21. Антитромботическая активность СГМ (ГМ-HSO3Na) с ММ 127 кДа на модели венозного тромбоза у крыс; достоверность различий с показаниями в контроле (доза 0 мг/кг) при введении 1мл физиологического раствора: * - p< 0,05- p< 0,001; n=10.

При проведении биоспецифичного электрофореза наблюдали перемещение комплексов между исследуемыми образцами СГМ и ПСТ. Характер комплексов преципитации ПСТ/СГМ и ПСТ/НФГ несколько отличается в силу структурных различий полианионов. Высота и площадь пиков преципитации возрастает с увеличением концентрации как НФГ, так и СГМ.

Агрегация тромбоцитов человека, вызванная добавлением АДФ достоверно снижается в 1,9 - 6,8 раз при инкубации с СГМ (ММ 127 кДа) в концентрациях 0,1 - 0,5 мкг/мл (в сравнении с контролем 67,1±4,1 %).

Антикоагулянтная активность образцов СГМ из травянистых и древовидных растений семейства бобовых [Гуар из Cyamуpsis tetragonуlobus (L.) Taub. - однолетнее травянистое растение из семейства бобовых; Галега Galega orientalis Lam - Козлятник восточный - многолетнее травянистое растение из семейства бобовых; софора из семян софоры японской (Styphnolobium japonicum - листопадное дерево семейства бобовых и ГМ Локуст бин (Locust Bean) из - смолы рожкового дерева (Ceratoniae fructus)] возрастает с увеличением отношения Man:Gal. АК активность значительно снижается (в 1,34 раза по aIIa активности и в 90 раз по аХа активности) после ферментативного гидролиза СГМ Гуар из однолетнего травянистого растения семейства бобовых Cyamуpsis tetragonуlobus (L.) Taub. целлюлолитическим ферментным комплексом.

Сульфатирование ГМ и карбоксиметилированных ГМ приводит к увеличению аIIa активности в 50 раз и появлению незначительной аХа активности (22 ЕД/мг) в коагулологических исследованиях. При анализе ингибирования амидолитических активностей Т и фактора Ха в присутствии АТ сульфатированный карбоксиметилированный ГМ показывает увеличение aIIa активности в 370 раз, а СГМ - в 76 раз. Различия показаний aIIa активностей, измеренных по ингибированию способности гидролизовать фибриноген или хромогенный субстрат, для одних и тех же образцов можно объяснить несколько отличающимся механизмом действия НФГ и сульфатированных ГМ. Так как, для активных образцов наблюдали достоверность различий по эффективным концентрациям в тесте АЧТВ. Кроме того, различие в aIIа активности (в амидолитическом тесте) почти в 5 раз, может свидетельствовать о том, что для сульфатированного КМГМ достаточно АТ, а для СГМ может быть необходимы другой серпин.

Для использования per os ряд авторов получили коньюгат НФГ с натрий N-[8(2-гидроксибензоил)амино] каприлатом, микрокапсулы на основе НМГ тинзапарина и комплекс на основе НМГ эноксапарина и дендримеров полиамидоамина [Jiao Y. и др., 2002; Lamprecht A. и др., 2007; Bai S. и др., 2007]. Полисахаридные ионные комплексы (ПИК), содержащие галактозилированный хитозан, СГМ и сукцинил-хитозан в разных весовых пропорциях демонстрируют in vitro АК активность. В ПИК, содержащих СГМ со степенью сульфатирования 1,46 с увеличением доли ГМ от 50 до 67% аIIa активность возрастает в 1,6 раз, в сравнении с СГМ. Добавление к СГМ галактозилированного хитозана и сукцинил-хитозана не изменяет активности против фактора Ха. Отсутствие в ПИК сукцинил - хитозана приводит к возрастанию двойных эффективных концентраций и снижению aIIa и аХа активностей. Использование в ионных комплексах СГМ с меньшей степенью сульфатирования - 0,60 приводит к увеличению двойных эффективных концентраций в коагулологических тестах и к снижению специфической АК активности.

На основе СГМ получены наночастицы с АК активностью. Антитромбиновая активность наночастиц на основе СГМ возрастает с увеличением ММ. Анти-фактор IIа активность наночастиц достоверно возрастает в 1,4 - 2,1 раза (в сравнении с исходным), анти-фактор Ха активность наночастиц c ММ 177 кДа достоверно увеличивается, в сравнении с исходным образцом в 2,9 раза. Отношение активностей аХа/aIIa наночастиц возрастает до 0,34; отношение активностей аХа/aIIa сульфатированного ГМ составило 0,23.

3. Антикоагулянтная активность in vitro химически модифицированной целлюлозы, крахмала, пектина и цианидинов.

С уменьшением ММ до 10-30 кДа антитромбиновая активность сульфатов целлюлозы хлопка (СЦ: ММ 100 кДа СС 1,7 и ММ 10 - 50 кДа СС 1,00 - 2,50) возрастает достигая величины 144 ЕД/мг (аХа - 30 ЕД/мг). Сульфаты карбоксиметил целлюлозы (СКМЦ: ММ 30 - 50 кДа и СС 3.0), амидоэтил целлюлозы (СКЭЦ: ММ, кДа/ CC/CЗ по амидным группам: 120/1,37/0,3 и 150/0,8/0,3) и альдегидцеллюлозы (СДАЦ: ММ, кДа/ CC/CЗ по альдегидным группам: 100/0,3/0,075 и 150/0,6/0,5) демонстрируют антитромбиновую активность 4-30 ЕД/мг (аХа = 0,14 - 27,00 ЕД/мг). Столь незначительные показатели АК активности могут быть связаны со слабым зарядом карбоксиметильных / амидоэтильных групп и пространственным фактором. Альдегидные группы сильно искажают конформацию целлюлозной цепи. Антитромбиновая активность сульфатов монофосфатов целлюлозы (СФЦ: ММ, кДа/ CC/CЗ по монофосфатным группам: 40/1,21/0,75;40/1,06/1,73; 75/1,2/1,02; 75/1,34/1,22) достигает 38 - 80 ЕД/мг (аХа 10-30 ЕД/мг). С увеличением СС и снижением ММ aIIa и аХа активности сульфатов целлюлозы и карбоксиметил целлюлозы возрастают. При анализе амидолитической активности Т и фактор Ха соединениями группы СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ отмечаем, что у подавляющей части соединений aIIa активность по гепарину в сравнении с коагулологическим методом снижается в 3-20 раз (вероятно, кроме АТ необходим другой серпин); в двух случаях не меняется (достаточно только антитромбина). Таким образом, у соединений внутри групп СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ можно наблюдать разный механизм ингибирования активности Т. Способность ингибировать амидолитическую активность фактора Ха соединениями модифицированной целлюлозы (групп СЦ, СКМЦ, СКЭЦ и СДАЦ) значительно возрастает только для трех образцов; вероятно, плазменные факторы влияют на механизм активации этими полисахаридами активности антитромбина. При анализе амидолитической активности Т и фактор Ха группой СФЦ отмечаем для всех случаев падение aIIa активности в 5-50 раз, аХа - в 3-40 раз. Кроме четкой закономерности в ряду этих веществ, можно заметить, что для осуществления АК активности в плазме этой группе необходим/мы кроме АТ другой/гие серпин/ы.

Образцы целлюлозы из древесины осины и соломы пшеницы не влияют на внешний путь свертывания крови человека, о чем свидетельствует отсутствие удлинения времен свертывания плазмы в тесте ПВ. Сульфатированная метилцеллюлоза из древесины осины демонстрирует крайне незначительную аIIa активность (0,064±0,021 ЕД/мг). Антитромбиновая активность микрокристаллической целлюлозы из древесины осины составляет 51,0±5,2 ЕД/мг, аХа активность в 3,6 раза меньше. Антитромбиновая активность наиболее активных образцов микрокристаллической сульфатированной целлюлозы из соломы пшеницы (количеством серы 6%) и древесины осины (количество серы 3,6%) достигает 119 и 134 ЕД/мг (аХа активность = 30 - 40 ЕД/мг). С увеличением количества серы АК активность образцов возрастает. Вещества с такой aIIa активностью могут претендовать на статус АК средства для лечения и профилактики тромбозов после токсикологических и клинических испытаний.

Сульфаты пектина из бадана толстолистного (Bergeniacrassifolia (L.) Fritsch.), сабельника болотного (Comarum palustre L.), ряски малой (Lemna minor L.), рдеста плавающего (Potamogeton natans), пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) удлиняют время свертывания плазмы в тесте ТВ с увеличение концентрации, влияя на конечный этап свертывания крови; наибольшей aIIa активностью 32,7±4,6 ЕД/мг обладает сульфат пектина из ряски малой. Влияние на внешний путь свертывания показали только сульфаты пектина из ряски малой и сабельника болотного. В тестах АЧТВ и РеаКлот сульфат пектина из ряски малой продемонстрировал aIIa активность 53,1±9,89 ЕД/мг и аХа - 3,4±0,55 ЕД/мг, АК активность остальных образцов в 30-75 раз меньшие. Снижение аХа активности, определенной амидолитическим методом в 10 раз, в сравнении с определенной в коагулологическом методе, свидетельствует о том, что для проявления анти-Ха активности образцу сульфата пектина из ряски малой, кроме АТ, необходим другой серпин. С увеличением степени сульфатирования некоторых пектинов появляется аХа активность, а аIIa активность возрастает в 100 - 250 раз.

С увеличением степени замещения по сульфатным группам (СЗ) образцов крахмала картофеля (СК) от 0,37 до 2,50 аIIa активность возрастает. Наибольшую aIIa активность (70±7 ЕД/мг) демонстрирует образец с СЗ 1,67 (рис. 22). При степени замещения 1,90 время свертывания плазмы человека в тесте ПВ (при концентрации образцов СК 0,059 мг/мл) - наибольшее. Активность против фактора Ха возрастает с увеличением степени сульфатирования. Судя по коэффициентам корреляции между количеством серы в образцах СК и показателями АК активности, aIIa и аХа активности необходимо определять по двойным эффективным концентрациям, так как чувствительность используемых методов определений для стандарта НФГ и СК различна. Исследованные СК ингибируют скорость гидролиза тромбином хромогенного субстрата. Ни один из исследованных образцов в диапазоне концентраций 0,048 - 480,000 мкг/мл не снижает амидолитическую активность Т в отсутствии АТ. Образец с С3=1 в концентрации 5 мкг/мл наоборот увеличивает амидолитическую активность Т в 10 раз. В диапазоне концентраций 0,2 - 4,0 мкг/мл исследованные образцы снижают скорость гидролиза Т хромогенного субстрата в присутствии АТ. Образец с СЗ=1 в меньшей степени, в сравнении с другими образцами, снижает амидолитическую активность Т в присутствии АТ.

Рис. 22. Влияние степени замещения по сульфатным группам образцов картофельного крахмала на антикоагулянтную активность.

Препарат пикногенол (Pycnogenol) с антиоксидантными и антиагрегантными свойствами получают экстрагированием горячей водой коры сосны приморской (Pinus maritima). Пикногенол состоит из процианидинов разной длины - от димеров до гептамеров [Packer D. и др., 1999]. Цианидины, выделенные из коры сосны, ели, лиственницы и берёзы имеют незначительную АК активность; антитромбиновая активность достигает 0,02 - 4,40 ЕД/мг, аХа активность есть только у цианидинов из коры ели, кедра, березы и составляет всего 0,11 - 0,52 ЕД/мг. Для такого рода препаратов большей АК активности и не требуется.

Антикоагулянтная активность синтетических олигосахаридов и пептидов.

Определена связь между молекулярной массой, степенью сульфатирования и АК активностью синтетических тетра-, гекса- и октасахаридов, полученных в результате направленного синтеза крупных фрагментов фукоиданов заданного строения. Анализировали аIIa и аХа активности олигосахаридов, полученных двумя разными способами.

В одном случае октасахариды с ММ 2044 Да и 2148 Да имели соотношение Fuc:SO3Na = 1:1, аIIa активность составила 0,08 - 0,19 Ед/мг, активности против фактора Ха не наблюдали. Антитромбиновая активность полученных другим способом, полностью сульфатированных олигосахаридов с ММ: тетрасахарид - 1563 Да (Fuc:SO3Na = 1,0:2,1); гексасахарид - 2264 Да (Fuc:SO3Na = 1.00:2,17); октасахарид - 2964 Да (Fuc:SO3Na = 1,00:2,13) составила 9,8 - 29,4 Ед/мг, анти-фактор Ха активность - в диапазоне 0,34 - 5,3 ЕД/мг.

То есть, увеличение степени сульфатирования синтетических тетра-, гекса- и октасахаридов приводит к возрастанию аIIa активности, появлению аХа активности и увеличению способности удлинять время свертывания плазмы по внешнему пути. Антикоагулянтная активность увеличивается с увеличением молекулярной массы (Рис. 23).

Рис. 23. Антикоагулянтная активность полностью сульфатированных синтетических олигосахаридов фукоиданового типа

С увеличением концентрации синтетических производных пептидов [1. ZАla-Ala-Arg-Рip* TFA (ММ 632 Да); 2. Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr (ММ 601 Да); 3. Ac-Trp-Arg-Mf*HCl (ММ 508 Да); 4. Fta-Gly-Arg-Pip* TFA (ММ 560 Да); 5. (Ac-Trp-Arg-Pip* TFA (ММ 584 Да)] в тестах АЧТВ и ТВ время свертывания плазмы крови человека возрастает, амидолитическая активность Т снижается, что свидетельствует о наличии у исследованных пептидов АК активности, связанной с ингибирование активности Т. Наибольшей ингибиторной активностью по отношетнию к Т обладает образец 4 (IC 50 = 28115µМ). При в/в введении самого активного синтетического производного пептида самцам крыс линии Wistar время свертывания плазмы крови животных в тестах АЧТВ и ТВ удлиняется с увеличением дозы. Минимальная эффективная доза, при которой время свертывания плазмы крыс удлиняется в два раза в сравнении с контролем в тестах АЧТВ и ТВ составляет 3 мг/кг.

Антитромботическая активность экспериментального концентрата антитромбина человека и пара-аминобензойной кислоты (ПАБК).

Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата АТ человека и НФГ [НФГ (Bauer) 40 ЕД/кг и АТ в растворе 56 ЕД/кг, НФГ (Bauer) 30 ЕД/кг и АТ высушенный лиофильно 100 ЕД/кг, НФГ (ООО “Белмедпрепарат”) 50 или 60 ЕД/кг и АТ высушенный лиофильно 100 или 55 ЕД/кг (рис. 24)], которые позволяют достигнуть 100% предотвращения роста тромба при в/в введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

Рис. 24. Влияние совместного внутривенного введения лиофильно высушенного концентрата АТ человека и НФГ ОАО “Белмедпрепарат” на развитие моделированного венозного тромбоза у крыс самцов Wistar, через 15 мин экспозиции антикоагулянтов

Анализ АК активности показал, что пара-аминобензойная кислота (ПАБК, ММ 137 Да) обладает aIIa и аХа активностями (7,00 ± 0,32 ЕД/мг и 16,70 ±0,12 ЕД/мг, соответственно). Такой важный параметр, определяющий антитромботический (АТБ) потенциал препаратов, как отношение активности аХа к aIIa, у ПАБК равен 2,4. ПАБК, обладая свойствами АК прямого действия в системе in vitro и, демонстрируя не только аIIa активность, но и ингибируя активированный фактор X, при в/в введении крысам в дозе 1,5 мг/кг, проявляет АТБ эффект через 1,5 часа после введения, с пиком активности на третьем часу и окончанием действия на пятом часу (рис. 25).

Рис. 25. Антитромботическая активность ПАБК при внутривенном введении крысам

Необходимо отметить одинаковую АТБ активность плазмы крыс после введения широко используемого НМГ фраксипарина в дозе 40 аХа ЕД/кг и ПАБК в дозе 25 аХа ЕД/кг (1,5 мг/кг). То есть, ПАБК несмотря на низкую удельную аХа активность, оказывает равный, но отдаленный во времени, в сравнении с фраксипарином, АТБ эффект. Какого-либо воздействия ПАБК в концентрации 1,5 мг/кг на число тромбоцитов и их агрегационную активность индуцированну АДФ или адреналином не обнаружено. При введении ПАБК per os крысам наблюдается увеличение aIIa активности плазмы при увеличении дозы (6 - 18 мг/кг). Продолжительность эффекта составляет 5-7 час. Способность ПАБК при введении per os крысам увеличивать aIIa активности плазмы может явиться дополнительным аргументом для применения этого вещества в качестве профилактического АТБ средства при гомоцистеинемии, так как синтез последнего зависит от фолиевой кислоты, а фолаты синтезируются de novo из птеринов и ПАБК.

Таким образом, экспериментально обоснована возможность конструирования новых лекарственных препаратов на основе низкомолекулярных гепаринов, фукоиданов из бурых водорослей Охотского моря, сульфатированных производных хитозана, целлюлозы, пектина, крахмала, галактоманнанов для профилактики и лечения тромбозов. Исследованные СП животного и растительного происхождения, натуральные или химически модифицированные имеют АК активность, которая осуществляется в основном посредством АТ. Анализ связи между структурой (степень сульфатирования, наличие разных функциональных групп, молекулярная масса) и аIIa / аХа активностями, установление механизма АК действия СП имеет фундаментальное значение для проектирования новых лекарственных средств на основе СП разного происхождения. При анализе АК активности in vitro и in vivo СП разного происхождения выделили образцы со специфическими аIIa и аХа активностями более 70 ЕД/мг (за исключением фукоидана), что необходимо для противотромботического лекарственного средства. Для парентерального введения: низкомолекулярный гепарин с ММ 7,0 кДа; низкомолекулярный гепарин с ММ 5,4 кДа ; механическая смесь сульфата хитозана (ММ 75 кДа; СС 1,26) и нефракционированного гепарина (в весовом соотношении 1:1); фукоидан (ММ 20-40 кДа) из водоросли Fucus evanescens; сульфатированный галактоманнан (ММ 127 кДа;СС 1.46). Для введения per os : пара-аминобензойная кислота.

Для окончательной оценки возможности выбора оптимального для клинического применения антикоагулянта необходимо изучить острую и хроническую токсичность указанных соединений, их побочные эффекты, связанные с влиянием на различные органы и системы и экономическую целесообразность производства. Эти данные совместно с результатами наших исследований могут лечь в основу создания новых отечественных антикоагулянтов прямого действия.

ВЫВОДЫ

1. Для получения низкомолекулярных гепаринов с высоким противотромботическим потенциалом требуется использовать ферментные комплексы из культуры Streptomycess kurssanovii и препарата протеаза С, либо протеолитический фермент - лизоцим при гидролизе нефракционированных гепаринов. С уменьшением молекулярной массы гепаринов до 1,6 - 9,3 кДа антитромбиновая активность снижается в 2-10 раз. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных низкомолекулярных гепаринов и фраксипарина при подкожном введении экспериментальным животным совпадают.

2. Ингибирование активности тромбина сульфатами хитозана (ММ 20-123 кДа) осуществляется с участием плазменного ингибитора сериновых протеаз - антитромбина, в больших концентрациях - с участием кофактора гепарина II. Антитромбиновая активность сульфатов хитозана возрастает с увеличением степени сульфатирования в диапазоне молекулярных масс от 56 до 82 кДа. Для создания эффективного антитромботического средства с меньшей, чем у нефракционированного гепарина, геморрагической активностью необходимо комбинировать сульфат хитозана (ММ 75 кДа, степень сульфатирования 1,25) с нефракционированным гепарином в весовом соотношении 1:1. Для получения сульфатов хитозана с высокой ингибиторной активностью по отношению к активированному фактору десять (аХа активность) следует использовать кислотный гидролиз высокомолекулярных сульфатов хитозана.

3. Исследованные фукоиданы из бурых водорослей в большей степени ингибируют активность тромбина преимущественно антитромбином. Фармакодинамические параметры наиболее перспективных фукоиданов и нефракционированного гепарина при внутривенном введении экспериментальным животным сравнимы. 100% антитромботический эффект появляется при внутривенном введении крысам фукоидана из F. evanescens в дозе 7 мг/кг, геморрагический эффект этого фукоидана выражен в меньшей степени, чем у нефракциоинрованного гепарина. Для получения фракций фукоиданов из водорослей F. еvanescens и L. saccharina с меньшей молекулярной массой и большей антикоагулянтной активностью необходимо использовать фукоиданазу или экстракт из гепатопанкреаса камчатского краба.

4. Антикоагулянтная активность исследованных полисахаридных ионных комплексов и сульфатов галактоманнана уменьшается со снижением степени сульфатирования последнего. Фармакодинамические параметры при внутривенном введении крысам сульфата галактоманнана с молекулярной массой 127 кДа и нефракционированного гепарина - сопоставимы. Определена доза сульфата галактоманнана для достижения 100% антитромботической активности.

5. Для нейтрализации антикоагулянтной активности исследованных сульфатов полисахаридов растительного и животного происхождения in vitro можно использовать сульфат протамина и хитозны с молекулярной массой 16 и 21 кДа.

6. Механизм антикоагулянтного действия сульфатов целлюлозы из древесных и травянистых растений и сульфатов монофосфатов-, карбоксиметил-, диальдегид-, амидоэтилцеллюлозы связан с ингибированием активности тромбина и фактора Ха преимущественно антитромбином. С уменьшением молекулярной массы до 10-30 кДа и увеличением степени сульфатирования целлюлозы до 2,5 антикоагулянтная активность возрастает.

7. Исследованные сульфаты пектина и крахмала ингибируют активность тромбина и фактора Ха посредством антитромбина и других плазменных ингибиторов сериновых протеаз свертывающей системы крови, но сульфаты крахмала ингибируют амидолитическую активность тромбина только в присутствии антитромбина. Антикоагулянтная активность сульфатов пектинов увеличивается с возрастанием степени сульфатирования и зависит от вида растения и моносахаридного состава. Зависимость антикоагулянтной активности сульфатов крахмала от степени сульфатирования - колоколообразна, с пиком при степени сульфатирования 1,67.

8. Антикоагулянтная активность исследованных синтетических фрагментов олигосахаридов фукоиданового типа увеличивается с увеличением молекулярной массы и степени сульфатирования. Синтетические производные пептидов ZАla-Ala-Arg-Рip* TFA; Z-Ala-Ala-Arg-Mf*HBr; Ac-Trp-Arg-Mf*HCl; Fta-Gly-Arg-Pip* TFA; Ac-Trp-Arg-Pip* TFA ингибируют амидолитическую активность тромбина и задерживают появление фибринового сгустка плазмы человека в тестах при оценке состояния внутреннего и конечного этапов свертывания плазмы. При внутривенном введении экспериментальным животным наиболее активного производного пептида Fta-Gly-Arg-Pip-ТFА антикоагулянтная активность плазмы увеличивается с возрастанием дозы.

9. Определены оптимальные сочетания экспериментальных препаратов концентрата антитромбина человека (55-100 ЕД/кг) с нефракционированным гепарином (40-60 ЕД/кг) и доза пара-аминобензойной кислоты при которых достигается 100% предотвращения роста тромба при внутривенном введении крысам с моделированным венозным тромбозом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шер, А.И. О стандартизации протамина [Текст] / А.И. Шер, М.Ю. Мазов, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд // Хим. Фарм. Ж.- 1988.-№ 4.- С. 486-490.

2. Дрозд, Н.Н. Механизм антикоагулянтного действия эфира сульфата хитозана [Текст] / Н.Н. Дрозд, Г.В. Башков, В.А. Макаров, А.Б. Хейломский, И.Н. Горбачева // Вопр. Мед. Хим.- 1992.- Т.38, № 5.- С. 12-14.

3. Дрозд, Н.Н. Взаимодействие между антикоагулянтными эффектами и образцами полисульфатов хитозана [Текст] / Н.Н. Дрозд, А.И. Шер, В.А. Макаров, Л.С. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева //Эксп. Клин. Фарм.- 1994.- Т. 57, № 4.- С. 42-45.

4. Дрозд, Н.Н. Влияние совместного введения гепарина и сернокислого эфира хитозана на функцию гемостаза [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Г.В. Башков, Л.С. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева // Эксп. Клин. Фарм.- 1996.- Т. 59, № 1.- С. 30-33.

5. Пат. 2076712 С1 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/725, 31/73. Средство, обладающее антикоагулянтной и антитромботческой активностью [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, А.И. Шер, Г.В. Башков, Л.С. Гальбрайх, Г.А. Вихорева, И.Н. Горбачева; Москва, Гематологический научный центр -- № 93053060; заявл. 23.11.1993; опубл. 10.14.1997.- Бюлл. 10.- с. 11. (С.1-15.)

6. Дрозд Н.Н. Лабораторный контроль за противотромботической терапией // Исследование системы крови в клинической практике [Текст] / под ред. Г.И. Козинец, В.А. Макарова.- М. ; [Триада-Х], 1997.- глава 4.- C. 41-43.

7. Дрозд, Н.Н. Парааминобензойная кислота как противотромботический агент [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова // Онтогенез.- 2000.- Т. 31, № 4.- С. 265-266.

8. Строева, О.Г. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты при экспериментальном тромбозе [Текст] / О.Г. Строева, С.И. Акберова, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин // Извест. Акад. Наук Сер. Биол.- 1999.- Т. 26, №3.- С. 265-271.

9. Пат. 2146138 С1 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 31/245. Антикоагулянтное средство [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова; Москва, Гематологический научный центр -- № 96113786; заявл. 08.07.1996; опубл. 10.03.2000, С. 1-12.

10. Пат. 2195673 С2 Российская Федерация, МПК7 G01N 33/68. Способ определения активности антитромбина III [Текст] / Т.Л. Воюшина, О.Е. Неведрова, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, А.П. Момот; Барнаул, ООО Фирма “Технология-Стандарт”-- № 2000130498/ 15; заявл. 06.12.2000; опубл. 27.12.2002, С. 1-15.

11. Макаров, В.А. Методические указания по изучению фармакологических веществ, влияющих на гемостаз [Текст] / В.А. Макаров, Г.Н. Петрухина, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская, О.Е. Неведрова // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. В.П.Фисенко. -- М. : [Ремедиум], 2000. -- С. 250-256.

12. Дрозд, Н.Н. Антитромботическая активность пара-аминобензойной кислоты [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, С.А. Калугин, О.Г. Строева, С.И. Акберова // Эксп. Клин. Фарм.- 2000.- Т. 63, №3.- С.40-44.

13. Потетинова, Ж.В. Фармакологическое ингибирование активности тромбина и плазмина [Текст] / Ж.В. Потетинова, Т.Л. Воюшина, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров // Эксп. Клин. Фарм.- 2001.- Т. 64, №5.- С.72-78.

14. Drozd, N.N. Comparison of antithrombin activity of the polysulphate chitosn derivatives in in vitro and in vivo system [Text] / N.N. Drozd, A.I. Sher, V.A. Makarov, G.A. Vichoreva, L.S, Galbraikh, I.N. Gorbachiova //Thromb Res.- 2001.- V. 102, N 5.- P. 445-455.

15. Дрозд, Н.Н. Влияние сульфата хитозана на взаимодействие между тромбином и антитромбином [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А. Макаров, Л.С.Гальбрайх, Г.А.Вихорева, И.Н.Горбачева // Молекулярная биология, химия и физика гетерогенных систем: материалы 6-ой Международной конф. -- Плес: Юнона, 2002. -- С. 52-56.

16. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность сульфатированных производных хитозана [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров // Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой, В.П.Варламова.- М.: [Наука], 2002.- С. 302-314.

17. Дрозд, Н.Н. Исследование антикоагулянтной активности низкомолекулярных образцов сульфата хитозана [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, В.П.Варламов, Г.Е.Банникова, Л.С.Гальбрайх, Г.А.Вихорева, П.П.Столбушкина // Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: материалы Седьмой Международной конф. -- Санкт-Петербург: ВНИРО, 2003. -- С. 169-171.

18. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность низкомолекулярных образцов сульфата хитозана и гепарина [Текст] / Н.Н.Дрозд, В.А.Макаров, Г.Е.Банникова, В.П. Варламов, П.П.Столбушкина, Г.А.Вихорева // Молекулярная биология, химия и физика гетерогенных систем: материалы 7-ой Международной конф. -- Плес: Юнона, 2003. -- С. 33-36.

19. Макаров, В.А. Современные препараты крови для коррекции патологии гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская // Проблемы гематологии и переливания крови.- 2004.- N3.- С. 32-35.

20. Макаров, В.А. Препараты крови, регулирующие функцию гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская // Новое в трансфузиологии.- 2004.- выпуск 37.- С. 5-12.

21. Drozd, N.N. The inhibition of the sulphate chitosan thrombin activity [Text] / N.N. Drozd, V.A. Makarov , G. Vikhoreva // Eur J. Bioch. - 2004.- V. 270, suppl. 1.- PS4-29.

22. Малыхина, Л.С. Некоторые показатели тератогенного и эмбриотоксического действия нового антикоагулянта хиторина [Текст] / Л.С. Малыхина, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров // Токсикологический вестник.- 2001.- N1.- С. 23-28.

23. Пат. 2221578 С1 Российская Федерация, МПК7 А61К 35/36, С07К 14/745. Способ получения очищенного активированного фактора Х свертывания крови [Текст] / А.Л. Берковский, Е.В. Сергеева, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, А.А. Козлов, Ю.А. Градова, А.В. Суворов; Москва, Межрегиональная благотворительная общественная организация инвалидов “Общество больных гемофилией”-- № 2002128481/ 15; заявл. 24.10.2002; опубл. 20.01.2004, Бюл. 2. -- 5 с. (С.1-19).

24. Столбушкина, П.П. Получение и антикоагулянтная активность образцов низкомолекулярных гепаринов [Текст] / П.П. Столбушкина, Г.Е. Банникова, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, В.П. Варламов, Г.Е. Вихорева // Хим. Фарм. Ж. - 2004.- Т.38,№ 2.- С. 82-85.

25. Банникова, Г.Е. Гидролиз гепарина иммобилизованным ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii [Текст] / Г.Е.Банникова, П.П.Столбушкина, Н.Н.Дрозд, Г.А.Вихорева, В.П. Варламов, В.А.Макаров // Прикл. Биох. Микробиол.- 2004.- Т.40, № 4.- С.365-369.

26. Пат. 2248801 С2 Российская Федерация, МПК7 А61К 31/727. Способ получения низкомолекулярных гепаринов [Текст] / В.П. Варламов, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Н.Т. Мифтахова, Г.А. Вихорева, Л.С. Гальбрайх, П.П. Столбушкина; Москва, Гематологический научный центр РАМН-- № 2003111205/ 15; заявл. 21.04.2003; опубл. 27.03.2005, Бюл. 9. -- 7 с. (С.1-10).

27. Vikhoreva, G. Anticoagulant activity of low-molecular-weight sulfated chitosan [Text] / G. Vikhoreva, P. Stolbushkina, G. Bannikova, A. Panov, N. Drozd, V. Makarov, V.Varlamov // Carbohydr Polym.- 2005.- V. 62, N4.- P. 327-332.

28. Дрозд, Н.Н. Антитромботческая активность российского низкомолекулярного гепарина [Текст] / Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров, Н.Т. Мифтахова, Г.Е. Банникова, В.П. Варламов, П.П. Столбушкина, Г.А. Вихорева // Омский научный вестник.- 2005.- №1(30).- С. 125-128.

29. Drozd, N.N. Mobility of the sulphate protamin/ low molecular weight heparin complexes in an electrical field [Text] / N.N. Drozd, I. Migal, M. Kiutina, V.A. Makarov, G.E. Bannikova, V.P. Varlamov // FEBS J.- 2005.-V.272, suppl. 1.- B3-016P.

30. Кузнецова, Т.А. Сравнительное исследование биологической активности фукоиданов, выделенных из бурых водорослей [Текст] / Т.А. Кузнецова, Н.Н. Беседнова, А.М. Урванцева, И.У. Бакунина, Т.Н. Звягинцева, Н.Н. Дрозд, В.А. Макаров // Вестник ДВО РАН.- 2006.- № 6.- С. 105-110.

31. Дрозд, Н.Н. Фармакодинамические параметры антикоагулянтов на основе сульфатированных полисахаридов из морских водорослей [Текст] / Н.Н Дрозд, А.С. Толстенков, В.А Макаров, Т.А. Кузнецова, Н.Н Беседнова, Н.М.Шевченко, Т.Н.Звягинцева // Бюлл. Эксп. Биол. Мед.- 2006.- Т.- 142, № 11.- С. 537-540.

32. Дрозд, Н.Н. Антикоагулянтная активность сульфатированных полисахаридов [Текст] / Н.Н. Дрозд, Г.Е. Банникова, В.А. Макаров, В.П. Варламов // Эксп. Клин. Фарм.- 2006.- Т. 69, №6.- С. 51-60.

33. Макаров, В.А. Характеристика лекарственных средств для коррекции системы гемостаза [Текст] / В.А. Макаров, Н.Н. Дрозд, Г.Г. Белозерская, Г.Н. Петрухина // Очерки по производственной и клинической трансфузиологии / под. ред. А.И.Воробьева -- М. : [Ньюдиамед], 2006. -- С. 374-382.