Размещено на http://www.allbest.ru/

Роль цитокинов и иммуно-эндокринные взаимодействия при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза

14.00.36 - "Аллергология и иммунология"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Шевчук Наталья Евгеньевна

Уфа - 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении "Уфимский научно-исследовательский институт глазных болезней" Академии наук Республики Башкортостан.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, Бикбов

профессор Мухаррам Мухтарамович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Николаева

Алевтина Максимовна

доктор биологических наук Лютов Андрей Германович

доктор медицинских наук, Хайруллина

профессор Раиса Масгутовна

Ведущая организация: ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия" Росздрава

Защита состоится "19" ноября 2009 г. в ____часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при ГОУ ВПО "Башкирский государственный медицинский университет" Росздрава, по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, д.3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО "Башкирский государственный медицинский университет" Росздрава, по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, д.3.

Автореферат разослан "___" __________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д. м. н. К.А. Лукманова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

В последние годы вопрос иммунорегуляции воспалительных и дистрофических процессов остается важной медико-биологической проблемой. Его изучение при развитии данных патологических процессов в оболочках глаза связано с широким распространением заболеваний органа зрения, нередко с тяжелым течением и неблагоприятными исходами, вплоть до слабовидения и слепоты. В основе патогенеза значительной части воспалительных и дистрофических заболеваний глаз лежат нарушения иммунологического реагирования [Теплинская Л.Е., 2007]. Известно об "иммунной привилегии" органа зрения - ограничении развития иммуногенных реакций в глазу, обусловленном наличием гематоофтальмического барьера, отсутствием во внутренних отделах глаза лимфатической дренажной системы, незначительной экспрессией молекул МНС классов I и II стромальными клетками глаза [McKenna К.С., Kapp J. A., 2004; Ashour H. M., Niederkorn J. Y., 2006; Ferguson T. A., Griffith T. S., 2007]. Развитие иммунопатологии и иммунное повреждение структур глаза сопряжено со срывом защитного механизма, когда на поверхности интраокулярных клеток нарушается экспрессия молекул, влияющих на клетки иммунной системы, а в жидких внутриглазных средах - синтез ряда факторов, подавляющих Т-клеточную пролиферацию и секрецию провоспалительных цитокинов [Niederkorn J. Y., 2006; Lepisto A. J. et al, 2007; Ferguson T. A., Apte R. S., 2008].

Существенные нарушения в системе цитокинов при воспалительных заболеваниях глаз инфекционной и аутоиммунной этиологии обуславливают хроническое и рецидивирующее течение, тяжесть исходов и недостаточную эффективность терапии [Марванова З.Р., 2004; Дроздова Е.А., 2007; Слепова О.С. и др., 1998, 2007; Fang I.M. et al, 2005; McInnis K.A. et al, 2007; Caspi R., 2008; Keadle T.L. et al, 2008; Sonoda K.H., 2008]. Сведения о значении цитокинов при хламидийном конъюнктивите [Abu el-Asrar A. M. et al, 2001] и аденовирусной инфекции конъюнктивы и роговицы [Harvey S. A. et al, 2005; Yang J. J. et al, 2007] в научной литературе единичны.

Дистрофические заболевания глаза, в т. ч. роговицы и сетчатки, обусловленные нарушениями трофики его тканей и характеризующиеся хроническим прогрессирующим течением без воспалительных явлений, также связаны с развитием иммунопатологического процесса [Сергиенко А.С. и др., 2004; Захарова Г.Ю. и др., 2005; Слепова О.С., 2006, 2007; Moromizato Y. et al, 2007; Chong D.Y. et al, 2008].

Однако в настоящее время нет полного представления о принципиальных особенностях местного и системного иммунного реагирования с участием цитокинов при воспалительных процессах в оболочках глаза, обусловленных вирусами и хламидиями, при увеитах, ассоциированных с вирусом герпеса и системными ревматическими заболеваниями а также при дистрофических процессах, следовательно, недостаточно обоснованы направления патогенетически ориентированной иммунокоррекции нарушений цитокинового статуса. Изложенное выше послужило основанием для изучения иммунобиологической роли цитокинов при указанных выше патологических процессах в оболочках глаза.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что отсутствие иммунного конфликта при нормальном функционировании организма является результатом сбалансированного взаимодействия иммунной и эндокринной систем [Абрамов В.В. и др., 1996, 2000; Воеводин Д.Н., Розанова Г.Н., 2006; Сычугов Г.В., 2006; Гейн С.В., 2007; Gerlo S. et al, 2006; Lau J. et al, 2006; O'Connor J. C. et al, 2008], нарушения которого могут играть важную роль в развитии патологических процессов. Известно о гормональных отклонениях при некоторых заболеваниях глаз. Так, в эксперименте и клинике выявлена взаимосвязь тяжести клинического течения увеита с содержанием гормонов [Комаров О.С., 2006; Proenca Н. et al, 2008], герпетического кератита - с уровнем тестостерона [Зайнутдинова Г.Х., 2002]. Однако сведения о взаимодействии иммунной и эндокринной систем при воспалительных процессах в оболочках глаза единичны, носят разрозненный характер [Chan C. C. et al, 2004; Cawood T. J. et al, 2006]. Поэтому приходится констатировать, что механизмы, обеспечивающие иммунологическую регуляцию воспалительных процессов в оболочках глаза, а также взаимодействие иммунной и эндокринной систем, во многом остаются невыясненными.

Выявление нарушений функционирования цитокиновой сети при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза имеет важное клиническое значение для иммунодиагностики, прогноза и применения патогенетически обоснованной иммунокорригирующей терапии. Изучение взаимодействия иммунной и эндокринной систем имеет также и теоретическое значение для понимания иммунологических закономерностей, механизмов сохранения гомеостаза при развитии воспалительных процессов в оболочках глаза. Изложенное определило цель и задачи данной работы.

Цель исследования

Определение роли цитокинов в развитии воспалительных и дистрофических процессов в оболочках глаза, оценка межсистемного иммуно-эндокринного взаимодействия при воспалении сосудистой оболочки глаза, обоснование на основе полученных данных иммунологических критериев прогнозирования течения воспаления в роговице и увеальном тракте.

Задачи исследования

1 Оценить местные и системные уровни цитокинов (IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IL-4, IFN-, IFN-) и направленность Th1/Th2-поляризации иммунного ответа при воспалительных процессах конъюнктивы и роговицы, обусловленных вирусом простого герпеса, аденовирусами и Chlamydia trachomatis.

2 Выявить общие закономерности и особенности изменений локального и системного содержания цитокинов в зависимости от локализации герпес-индуцированого воспалительного процесса в оболочках глаза.

3 Определить роль цитокинов и простагландина Е₂ в развитии воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза.

4 Изучить содержание гормонов гипофиза (тиреотропного гормона, пролактина), щитовидной железы (трийодтиронина, тироксина, тиреоглобулина), стероидных гормонов (кортизола, тестостерона), антител к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе при воспалении увеального тракта и оценить межсистемные иммуно-эндокринные взаимодействия.

5 Дать оценку системному цитокиновому реагированию при дистрофических процессах роговицы.

6 Изучить местные и системные уровни цитокинов при дистрофических процессах в сетчатке, приведших к ее отслойке, в зависимости от их характера, распространенности и срока давности развития отслойки.

7 Обосновать иммунологические критерии прогнозирования течения воспалительных процессов в роговице, индуцированных вирусом простого герпеса, и в сосудистой оболочке глаза при системных ревматических заболеваниях.

Научная новизна

Впервые показано, что для воспаления конъюнктивы, роговицы и сосудистой оболочки глаза характерно сходство в профиле цитокинов (IL-1, TNF-, IL-6, IL-2, IFN-, IFN-) и направленности иммунного ответа, но имеется различие в степени выраженности местного и системного реагирования.

Установлено, что при герпес-индуцированном воспалительном процессе в роговице большая степень выраженности местного и системного иммунного реагирования коррелирует с рецидивом заболевания и глубокой локализацией воспаления.

цитокин воспалительное заболевание глаз

Впервые при патологии глаз установлено, что закономерности нарушения системы цитокинов при персистирующих вирусной (герпетической) и хламидийной (Chlamydia trachomatis) инфекциях имеют сходство в спектре цитокинов и направленности иммунного ответа, характер которых определяется активностью инфекционного процесса.

Показана сопряженность изменений содержания гормонов (кортизола, тестостерона - у мужчин, тиреоглобулина и антител к нему, свободного трийодтиронина и антител к тиреопероксидазе) в сыворотке крови, местного и системного уровней основных цитокинов и васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) с этиологией воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза.

Впервые при воспалении увеального тракта установлена зависимость содержания простагландина Е₂ в сыворотке крови и слезной жидкости от пола пациентов и развития рецидива заболевания.

Впервые предложено рассматривать воспаление сосудистой оболочки глаза как процесс, связанный с десинхронизацией функций иммуно-эндокринной регуляции, на основе выявления взаимосвязей между показателями иммунной и эндокринной систем методом корреляционного анализа.

Установлено, что дистрофические процессы в сетчатке при миопии средней и высокой степени и периферической витреохориоретинальной дистрофии, приведшие к ее отслойке, сопровождаются изменениями содержания цитокинов на местном и системном уровнях, характер которых обусловлен типом офтальмопатологии, приведшей к отслойке сетчатки, ее величиной и сроком давности развития.

Определены иммунологические критерии неблагоприятного течения воспалительного процесса в роговице, обусловленного вирусом простого герпеса (высокая концентрация TNF- в слезной жидкости и дефицит местного и системного содержания IL-4), и сосудистой оболочке глаза при системных ревматических заболеваниях (содержание VEGF в сыворотке крови более 750 пкг/мл). Эти показатели могут служить основой прогнозирования течения воспаления увеального тракта.

Научно-практическая значимость работы

Установлены нарушения цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови и тканей глаза у пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в оболочках глаза. Определена важная роль в этом процессе нарушения цитокиновой сети, регулирующей баланс Th1/Th2-пути антигенспецифического иммунного ответа. Выявлен дисбаланс уровней цитокинов, простагландина Е₂ и гормонов в сыворотке крови, сопряженных с этиологией заболевания, при воспалении увеального тракта. Методом корреляционного анализа установлена взаимосвязь функций иммунной и эндокринной систем при воспалительных процессах сосудистой оболочки глаза. Выявлены иммунологические факторы, обуславливающие риск прогрессирования и хронизации воспаления при его развитии в роговице и сосудистой оболочке глаза. Определены сходство и различия в нарушениях системы цитокинов при воспалительных и дистрофических процессах в оболочках глаза, обусловленные их анатомо-функциональными отличиями.

Полученные результаты представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения воспалительных и дистрофических заболеваний глаз, а также к коррекции дисбаланса локального и системного содержания цитокинов, своевременной профилактики развития хронических форм заболеваний, а также осложнений, возникающих при длительном воспалении.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы комплексных исследований, включающие показатели субпопуляционного состава лимфоцитов крови, цитокинового и иммунного статусов, используются в работе консультативной поликлиники, клинических отделений Уфимского НИИ глазных болезней и офтальмологической службы поликлиники № 52 г. Уфы. Основные положения и выводы диссертационной работы включены в программу обучения студентов, интернов, аспирантов и используются в учебном процессе на курсах повышения квалификации по инфекционным и воспалительным заболеваниям глаз для врачей-офтальмологов РФ и РБ на базе Уфимского НИИ глазных болезней.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для воспалительных и дистрофических процессов в оболочках глаза характерны изменения системы цитокинов на местном и системном уровнях, регулирующих тип, длительность и степень выраженности иммунного ответа.

2. Активация местного и системного иммунного ответа при реактивации персистирующих герпетической и хламидийной инфекциях выражается значимым увеличением концентрации IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IFN- в сыворотке крови и слезной жидкости.

3. Цитокиновый профиль при герпес-индуцированных воспалительных процессах характеризуется ростом местного и системного уровней цитокинов (IL-1, TNF-, IL-6, IL-2, IFN- и IFN-) с более значимым повышением локального и системного содержания IFN- и IFN- при воспалении роговицы и TNF-, IL-6, IL-2 - сосудистой оболочки глаза.

4. Развитие воспалительного процесса в сосудистой оболочке глаза характеризуется изменениями местного и системного уровней IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IFN-, связанными с этиологией заболевания. Дисбаланс содержания простагландина Е₂ в сыворотке крови и слезной жидкости сопряжен с полом пациентов и развитием рецидива заболевания.

5. Воспаление увеального тракта сопровождается транзиторным изменением содержания гормонов (кортизола, тестостерона, тиреотропного гормона, общего трийодтиронина, свободного тироксина) и антител к тиреоглобулину и тиреоидной пероксидазе в сыворотке крови, а также наличием достоверных корреляционных связей уровней цитокинов и гормонов, опосредующих межсистемные иммуно-эндокринные взаимодействия.

6. Развитие дистрофических процессов в роговице при ее эндотелиально-эпителиальной дистрофии сопровождается достоверным увеличением содержания IL-4 в сыворотке крови и смещением баланса в сторону Th2-типа иммунного ответа.

7. Дистрофические процессы сетчатки, приведшие к ее отслойке, сопровождаются изменениями содержания цитокинов (IL-1, IL-2, TNF-, IL-6, IL-4) на местном и системном уровнях, характер которых обусловлен типом офтальмопатологии, приведшей к развитию отслойки сетчатки, ее величиной и сроком давности развития.

8. Риск развития неблагоприятного течения воспалительного процесса в роговице, вызванного вирусом простого герпеса, сопряжен с повышением уровня TNF- в слезной жидкости и недостаточной местной и системной мобилизацией IL-4; воспаление сосудистой оболочки глаза, ассоциированное с системными ревматическими заболеваниями, совпадает с дисбалансом содержания TNF- в виде повышения на местном уровне и недостатком на системном, и высоким (более 750 пкг/мл) содержанием VEGF в сыворотке крови.

Апробация работы

Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на научно-практической конференции "Ерошевские чтения" (Самара, 2002), конференции, посвященной 100-летию глазной клиники "Офтальмология в начале XXI века" (Саратов, 2002), Всероссийской научной конференции "Перфторуглеродные соединения в экспериментальной и клинической меди-цине" (Санкт-Петербург, 2004), научно-практических конференциях "Воспалительные заболевания органа зрения" (Челябинск, 2004), "Достижения в офтальмологии" (Москва, 2008), научно-практической конференции с международным участием "Современные технологии лечения заболеваний переднего и заднего сегментов глаза" (Уфа, 2008), научно-практической конференции "Актуальные проблемы офтальмологии" (Уфа, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 работы, в т. ч.2 монографии: "Хламидийный конъюнктивит: клиника, диагностика, лечение" (Уфа, 2003), "Цитокины в офтальмологии" (Уфа, 2008), 9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, 5 патентов РФ, 37 статей в материалах конференций и съездов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 241 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель включает 287 источников (101 - отечественных и 186 - иностранных авторов).

Диссертационная работа выполнена по основному плану НИР ГУ "Уфимский НИИ глазных болезней" АН Республики Башкортостан.

Содержание работы

Материал и методы исследования

Основу работы составляют результаты комплексного иммунологического обследования 312 пациентов с воспалительными и дистрофическими заболеваниями органа зрения, находившихся на стационарном лечении в Уфимском НИИ глазных болезней Академии наук Республики Башкортостан в период с 2000 по 2008 годы.

В зависимости от наличия воспалительного или дистрофического процесса в тканях глаза все обследуемые больные были разделены на 2 группы. Первую составил 261 пациент с воспалительными реакциями в конъюнктиве и роговице глаза при офтальмоинфекциях (165 человек) и в увеальном тракте (96 человек) в возрасте от 21 года до 69 лет. Во вторую группу вошел 51 пациент с дистрофическими процессами: 18 человек - с дистрофическими изменениями роговицы и у 33 - в сетчатке (возраст - от 30 до 70 лет).

Клинико-биомикроскопическое исследование стадий воспалительного процесса проводили д. м. н., проф.В.Б. Мальханов, к. м. н.Г.Х. Зайнутдинова, к. м. н. З.Р. Марванова, к. м. н.э.А. Латыпова. Клиническую диагностику верифицировали на основании данных определения антигенов вируса простого герпеса (ВПГ), аденовирусов и Chlamydia trachomatis в соскобе с конъюнктивы методом флуоресцирующих антител, уровня специфических антител к ВПГ (классов IgM и IgG) и хламидиям (классов IgA и IgG), специфических аутоантител к IgG и к антигенам ДНК в крови методом ИФА, заключения ревматолога. Диагноз эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы устанавливался к. м. н. З.Р. Марвановой и к. м. н. Н.А. Никитиным, регматогенной отслойки сетчатки - к. м. н. О.В. Вавиловой на основании данных анамнеза, клинической картины заболевания, использования офтальмологических методов исследования.

Группу пациентов с офтальмоинфекциями составили: 72 человека - с поражением роговицы ВПГ (герпетическим кератитом), 34 - при поражении конъюнктивы и роговицы аденовирусами (эпидемический кератоконъюн-ктивит) и 59 - с развитием воспаления конъюнктивы при ее инфицировании хламидиями (хламидийный конъюнктивит).

Пациенты с офтальмогерпесом были распределены на группы в зависимости от частоты и глубины поражения роговицы ВПГ: развитие воспаления в роговице впервые отмечали в 45,8% случаев, его рецидив - в 54,2%; локализацию воспаления в поверхностных слоях роговицы наблюдали в 38,9% случаев, в глубоких - в 61,1%.

У 22 (37,3%) пациентов с хламидийной инфекцией конъюнктивы отмечали острое течение инфекции глаз, у 37 (62,7%) - хроническое.

Было обследовано 96 пациентов с воспалительными процессами увеального тракта различной этиологии, в т. ч. ассоциированными с системными ревматическими заболеваниями (РЗ) - 27 (28,1%) человек, инфекционной - 23 (24,0%) и неясной этиологии - 46 (47,9%). При воспалении увеального тракта, ассоциированного с РЗ, иммунологические исследования проводили в острую стадию воспаления глаза. При этом общее системное РЗ находилось в стадии ремиссии. Спектр РЗ был представлен ревматоидным артритом, реактивными артритами и различными видами спондилоартритов.

В группе с развитием дистрофических процессов в оболочках глаза был 51 пациент: 18 человек с вторичной эндотелиально-эпителиальной дистрофией (ЭЭД) роговицы III-IV стадий и 33 - с дистрофическими процессами в сетчатке, которые привели к ее отслойке. У 8 (44,4%) пациентов отмечали ЭЭД роговицы, у 10 (55,6%) - ЭЭД, осложненную воспалением в увеальном тракте.

Пациенты с дистрофическими процессами сетчатки были распределены в зависимости от вида дистрофических процессов, приведших к ее отслойке: 12 (36,4%) пациентов, у которых отслойка сетчатки развилась на фоне миопии средней и высокой степени, 15 (45,5%) - на фоне пролиферативной витреоретинальной дистрофии (ПВХРД), группу сравнения составили 6 (18,2%) пациентов с посттравматической отслойкой. У 18 (54,5%) пациентов была диагностирована локальная отслойка сетчатки, площадью 1-2 квадранта, и у 15 (45,5%) - тотальная, площадью 3-4 квадранта. У 13 (39,4%) пациентов срок развития отслойки не превышал 1 месяца, у 12 (36,4%) - от 1 до 3 месяцев и у 8 (24,2%) - со времени развития отслойки сетчатки прошло более 3 месяцев.

В таблице 1 представлены данные о количестве пациентов с воспалительными и дистрофическими процессами в тканях глаза, в биологических жидкостях которых было проведено исследование иммунофенотипического статуса лимфоцитов, определение местных и системных уровней иммунорегуляторных цитокинов, у больных с воспалением увеального тракта осуществляли также определение гормонального статуса.

Контрольную группу составили 37 практически здоровых лиц в возрасте от 20 до 69 лет, сопоставимых по полу с исследуемыми группами пациентов. В контрольную группу для ЭЭД роговицы вошли 7 практически здоровых лиц в возрасте 58-69 лет.

Взятие крови осуществляли натощак из локтевой вены обследуемых больных в стерильных условиях в 2 пробирки (по 5 мл), в одну из которых добавляли каплю гепарина. Слезную жидкость собирали из конъюнктивальной полости пациентов с помощью меланжера. Субретинальную жидкость получали во время оперативного вмешательства по поводу отслойки сетчатки.

Определение уровней цитокинов - IL-1, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-, IFN-, IFN-, VEGF - в сыворотке крови (СК) и слезной жидкости (СЖ) пациентов проводили методом ИФА согласно инструкциям, предлагаемым производителями тест-систем ("Procon", С-Петербург, Россия; "Вектор-Бест", Россия; "CYTELISA", США). Учет результатов осуществляли с применением фотометра для микропланшетов "Multiscan" при длине волны 450 нм. Результаты выражали в пкг/мл.

Таблица 1 - Распределение пациентов в соответствии с использованными методами исследования

№	Методы исследования	Группы обследованных
		Здоро-вые доноры	Пациенты с воспалительными процессами в конъюнктиве, роговице и увеальном тракте	Пациенты с дистрофическими процессами
			Герпетиче-ская инфекция	Аде-новирусная инфекция	Хла-мидийная инфекция	Воспаление увеального тракта	в роговице	в сетчатке
1	Определение количества лимфоцитов крови, экспрессирующих CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD71+, CD95+ и HLA-DR маркеры, методом непрямой иммунофлуоресценции	37	64	28	47	71	18
2	Определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови по Манчини и иммуноферментным методом	19	52	20	43	71
3	Исследование уровня цитокинов (IL-1, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-, IFN-, IFN-) с использованием иммуноферментного анализа в сыворотке крови в слезной жидкости в субретинальной жидкости	37 37	72 54	34 19	59 51	96 62	18	18 33
4	Определение содержания гормонов (кортизола, тестостерона, пролактина, тиреотропного гормона, тироксина, трийодтиронина, антител к тиреопероксидазе) в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа	15				96

Иммунофенотипирование лимфоцитов крови по CD-маркерам (СD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD71+, CD95+, HLA-DR+) проводили методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител фирмы "Сорбент" (Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства) [Имельбаева Э.А. и др., 2004]. Результаты выражали в абсолютных и относительных значениях.

При серологических исследованиях уровней иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови применяли метод радиальной иммунодиффузии по Манчини, а также иммуноферментный анализ с использованием диагностических тест-систем ("Вектор-Бест", Россия).

Изучение содержания показателей функционального состояния эндокринной системы - кортизола, тестостерона, пролактина, тиреотропного гормона (ТТГ), тироксина (Т₄), трийодтиронина (Т₃), антител к тиреоглобулину (анти-ТГ) и тиреопероксидазе (анти-ТПО) - в СК пациентов с воспалением увеального тракта осуществляли с помощью тест-систем ("Вектор-Бест", Россия), простагландина Е₂ - "R@D" (CША) методом иммуноферментного анализа согласно инструкциям, предлагаемым производителями. Результаты выражали в стандартных единицах, принятых для каждого показателя.

Математико-статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием стандартных методов параметрической и непараметрической статистики с использованием пакета современных прикладных программ [Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2006]. Она включала определение дескриптивных статистических данных: среднее выборочное значение (М); средне квадратичное отклонение (Sd), показывающее изменчивость вариационного ряда. Для выявления значимой корреляции использовались методы однофакторного и многофакторного параметрического дисперсионного анализа, основанного на разложении общей дисперсии на составляющие: факторальную дисперсию и случайную. На основании расчетов определяется коэффициент влияния контролирующего фактора - доля вариационных данных (по отношению к общим значениям), вызванная действием фактора, которым можно манипулировать или контролировать. В многофакторной схеме влияние факторов распределяется различным их сочетанием.

Результаты исследования и обсуждение

1. Роль цитокинов в развитии воспалительных процессов при вирусном и хламидийном поражении конъюнктивы и роговицы глаза

Профиль цитокинов при герпес-индуцированном воспалении роговицы

В настоящее время герпес рассматривается как приобретенная болезнь иммунной системы, при которой длительная персистенция вируса сопровождается инфицированием всех видов ее клеток, приводя к их функциональной недостаточности и развитию иммунодефицита. Проведенные исследования показали, что реактивация латентной герпетической инфекции в организме, вызывающая развитие воспалительной реакции в роговице, сопровождается тенденцией к повышению относительного количества CD8+ лимфоцитов крови при достоверном (p<0,001 и менее) снижении содержания CD4+ клеток и значения иммунорегуляторного индекса (CD4+/CD8+). О значимой активации иммунной системы свидетельствует достоверное (р<0,001 и менее) увеличение относительного количества клеток с высокой пролиферативной активностью - CD71+, лимфоцитов, экспрессирующих CD95+ (FAS/APO-1) рецептор, и HLA-DR-клеток, а также выявленная корреляционная связь (r=0,49, р=0,016) между содержанием CD95+ и HLA-DR лимфоцитов. Достоверно (р<0,01) повышается концентрация IgМ и наблюдается тенденция к увеличению содержания IgA и IgG в СК.

Стадия развития герпетического воспаления роговицы сопровождается поляризацией иммунного ответа в сторону Th1-типа, увеличением локального и системного уровней IL-1, IL-6, TNF-, IL-2, IFN- и IFN- (табл.2), характер и направленность изменений которых в целом согласуются с концепцией типовых механизмов развития воспалительного процесса.

Таблица 2 - Содержание цитокинов на местном и системном уровнях при герпес-индуцированном воспалении роговицы (MSd)

Цитокин	Содержание цитокинов, пкг/мл
	сыворотка крови	слезная жикость
	контроль, n=37	стадии воспаления	контроль n=28	стадии воспаления
		развитие n=72	завершение,n=61		развитие n=54	завершение, n=43
IL-1	34,35,6	68,6±9,8*	65,910,9*	93,415,7	392,0± 26,9*	295,039,1*
TNF-	40,59,3	90,2±18,3*	70,416,2	98,920,4	205,0± 36,1*	137,422,6
IL-6	44,67,0	277,5 ± 25,4 ***	192,3 32,0**	126,4 30,2	443,0± 68,0	277,935,6
IL-2	426,0 85,2	664,5± 154,2	658,8 106,1	257,9 ± 42,4	759,0± 57,2*	456,442,0
IL-4	37,85,8	79,2±8,8*	253,2 36,5 ***	26,35,8	38,09,6	108,926,8 **
IFN-	15,84,2	209,5 ± 118,3***	187,0 51,2 ***	26,2±6,3	345,7 12,3***	178,428,2**
IFN-	415,2 106,3	1514,8 ± 216,1**	1310,5 169,4**	506,2 98,5	1697,1 46,2**	1487,4 215,5*

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05);

** - различие с контролем статистически значимо (р0,01);

*** - различие с контролем статистически значимо (р0,001 и менее)

Отмечена большая степень выраженности иммунного реагирования на местном уровне, по сравнению с системным, для IL-1 (соответственно в 4,2 и 2 раза), IL-2 (в 2,9 и 1,8 раза), и аналогичные изменения для TNF- (в 2 раза), IFN- (в 13 раз) и IFN- (более чем в 3 раза). Герпес-индуцированное воспаление роговицы сопровождается значительно выраженным дисбалансом содержания альтернативных цитокинов: величина соотношения уровней IFN-г/IL-4 в разгар инфекции составляет в СК 19,2 единицы против 10,9 ед. - в контроле, в СЖ - соответственно 44,7 и 19,2 ед. Стихание воспаления сопровождается снижением величин соотношения в СК до 5,2 ед. и СЖ - до 13,7, свидетельствуя о постепенном уменьшении востребованности в провоспалительных цитокинах и восстановлении их баланса.

Содержание цитокинов на местном и системном уровнях при воспалении роговицы, вызванном ВПГ, обусловлено частотой развития рецидивов герпетической инфекции и имеет однонаправленный характер: рецидив воспаления характеризуется более высокими уровнями всех изучаемых цитокинов в СК и СЖ, за исключением IL_4, имеющего различную динамику локальной и системной принадлежности (рис.1). Вероятно, это обусловлено длительной стимуляцией макрофагов образующимся комплексом ВПГ-IgG, что приводит к увеличению продукции провоспалительных цитокинов и VEGF, усиливая ангиогенез и воспаление [Hayashi K. et al, 2009]. Дисбаланс содержания IFN- и IL-4 в СК более значим при рецидиве офтальмогерпеса, чем при первой атаке вируса (соответственно 28,2 и 13,1 ед.), а в СЖ - при первом развитии заболевания (соответственно 117,9 и 18,9 ед.).

АБ

первая атака рецидив

Рис.1. Уровни цитокинов в сыворотке крови (А) и слезной жидкости (Б) при герпес-индуцированном воспалении роговицы в зависимости от частоты рецидивов герпетической инфекции.

Профиль цитокинов в СК и СЖ определяется также и глубиной локализации воспалительного процесса, вызванного ВПГ, в роговице (рис.2), имея одинаковую направленность, но большую степень выраженности при глубоких формах офтальмогерпеса. Коэффициент соотношения содержания IFN-г относительно уровня IL-4 в СК при глубоком и поверхностном поражении роговицы ВПГ составляет 17,1 ед., в СЖ - соответственно 122,0 и 57,4 ед. Возможно, распространение герпетического поражения в глубокие слои роговицы обусловлено более значимым местным накоплением провоспалительных цитокинов и недостаточной для адекватного иммунного ответа продукцией противовоспалительного IL-4.

АБ

поверхностная локализация глубокая локализация

Рис.2. Уровни цитокинов в сыворотке крови (А) и слезной жидкости (Б) при герпес-индуцированном воспалении роговицы в зависимости от глубины его локализации.

Динамика изменения содержания цитокинов в СК и СЖ по мере распространения герпетического воспалительного процесса вглубь роговицы также имеет одинаковую направленность, отличаясь более выраженной активацией местного и системного иммунного реагирования при глубокой локализации воспаления. При этом максимальное накопление IL-1, IL-6 и TNF- в СК и СЖ отмечается в более поздние сроки, чем при поверхностном воспалении.

Итак, при взаимодействии иммунной системы с ВПГ в реакциях адаптивного иммунитета установлено участие цитокинов на местном и системном уровне, которое заключается в регуляции типа, длительности и степени выраженности локального и системного иммунного ответа в зависимости от глубины развития воспаления в слоях роговицы, частоты реактивации латентной герпетической инфекции. Выявленные изменения, представленные в виде схемы (рис.3), могут являться следствием нарушения иммунологического равновесия, необходимого для адекватного реагирования организма на вирусную инфекцию, а также могут быть причиной нарушения коммуникации иммунокомпетентных клеток путем модуляции функциональной активности лимфоцитов на молекулярном уровне. Определение уровней цитокинов и их баланса при развитии герпетического воспаления роговицы является информативным показателем при прогнозе развития глубоких форм герпетического кератита, открывая дополнительные возможности для контроля течения воспалительного процесса.

Цитокины при аденовирусной инфекции глаз

Развитие воспаления при поражении конъюнктивы и роговицы аденовирусами типов 8,19 и др. (эпидемический кератоконъюнктивит - ЭКК) характеризуется достоверным (р<0,01) повышением содержания относительного числа лимфоцитов крови и тенденцией к снижению значения иммунорегуляторного индекса. Выявлена корреляционная взаимосвязь (r=0,65, р=0,048) между содержанием СD95+ и CD8+ лимфоцитов крови, что является доказательством адекватной реакции организма в ответ на вирусную инфекцию. Достоверно (р<0,05) повышаются сывороточные концентрации IgA и IgМ, по сравнению с контролем.

Воспалительный процесс при аденовирусной инфекции глаз характеризуется достоверным (р<0,001 и менее) увеличением содержания в СК и СЖ (более чем в 3 раза) только IL-6, при незначительном повышении уровней IL-1 и TNF- в СЖ (рис.4).

По мере элиминации аденовируса из организма и стихания воспалительного процесса наблюдается достоверное (р<0,05) снижение уровня IL-6 в СК и СЖ, при практически неизменном содержании IL-1 и TNF-.

Рис.4. Содержание цитокинов в сыворотке крови (А) и слезной жидкости (Б) при аденовирусной инфекции глаз.

Нами установлена однонаправленность цитокинового реагирования при герпетической и аденовирусной инфекциях глаз: Th1-тип иммунного ответа с дисбалансом локального и системного содержания цитокинов. Отличием является значительно менее слабая степень их выраженности при поражении оболочек глаза аденовирусами. Проведенные исследования показали, что изменение системы цитокинов является отражением реактивности организма на инфицирование аденовирусами оболочек глаза и дополняет наши представления о механизме их взаимодействия с макроорганизмом.

Роль цитокинов в развитии хламидийной инфекции конъюнктивы

Еще одним патогеном, нередко вызывающим развитие воспаления в конъюнктиве глаза, является Chlamydia trachomatis. Так же как и аденовирусы, хламидии обладают тропизмом к эпителию слизистой оболочки, но, в отличие от аденовирусов, они длительное время персистируют в организме хозяина, что в некотором роде сближает их с ВПГ. Проведенные при хламидийной инфекции конъюнктивы исследования показали значимое (р<0,05) повышение относительного числа лимфоцитов, тенденцию к снижению содержания CD4+, CD16+ клеток и значения иммунорегуляторного индекса. Отмечена существенная активация иммунной системы, что проявлялось в повышении относительного содержания CD71+ и CD95+ лимфоцитов. Наблюдается тенденция к росту сывороточной концентрации IgМ.

Развитие воспалительного процесса в конъюнктиве при ее инфицировании Chl. trachomatis сопровождается сдвигом иммунологического реагирования в сторону Th-1 типа, что проявлялось достоверным (р<0,05) увеличением содержания IL-1 в СК, по сравнению с контролем (табл.3).

Таблица 3 - Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при хламидийной инфекции конъюнктивы (MSd)

Цитокин	Содержание цитокинов, пкг/мл
	сыворотка крови	слезная жикость
	контроль, n=37	стадии воспаления	контроль, n=28	стадии воспаления
		pазвитие n=59	завершение, n=40		pазвитие n=51	завершение, n=38
IL-1	34,35,6	69,66,3*	56,417,4	93,415,7	160,5 23,6	96,827,4
TNF-	40,59,3	54,214,6	51,013,2	98,920,4	178,2 16,9*	127,0 36,2
IL-6	44,67,0	157,5 41,7***	129,3 23,2**	226,4 30,2	336,8 28,1	421,8 32,5
IFN-	15,84,2	112,2 21,8***	40,3 12,1*	26,2±6,3	59,5±11,1*	34,3±7,9
IFN-	415,2 106,3	1087,4 146,4**	971,4 69,9	506,2 98,5	1576,9 ± 167,4*	1478,9 ± 142,1*
IL-4	37,85,8	96,612,5**	112,3 23,6**	26,35,8	45,69,9	56,313,6

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05);

** - различие с контролем статистически значимо (р0,01);

*** - различие с контролем статистически значимо (р0,001 и менее)

Свидетельством значительной активации иммунной системы в ответ на хламидии является взаимосвязь уровня IL-1 и содержания лимфоцитов с высокой пролиферативной активностью (СD71+) (r=0,48, p=0,05). Отмечено также статистически значимое (р<0,01-0,001) повышение уровней IL-6 (в 3,6 раз), IFN- (в 7,1 раз) и IFN_ (в 2,6 раз) в СК. Выявлена взаимосвязь между уровнем продукции TNF- и содержанием общих CD3+ лимфоцитов (r=0,71, р<0,03), свидетельствующая о стимуляции данным цитокином гемопоэза, что приводит к временному увеличению пула лейкоцитов крови для борьбы с инфекцией. На стадии завершения воспаления отмечена нормализация концентрации в СК IL-1, TNF-, IFN- и снижение уровня IL-6.

Поражение конъюнктивы Chlamydia trachomatis сопровождается существенным (в 2,6 раз) увеличением концентрации IL-4 в СК. При этом при хронических формах офтальмохламидиоза (персистенция хламидий) наблюдаются более высокие уровня IL-4 в СК, по сравнению с благоприятно протекающими (138,716,4 пкг/мл и 81,212,5 пкг/мл соответственно). Выявлена взаимосвязь содержания IL-4 в СК с числом CD95+ лимфоцитов (r=0,43, p=0,05), подтверждающая участие данного цитокина в реализации апоптических процессов.

Хламидийная инфекция конъюнктивы характеризуется значимым проявлением локального иммунного реагирования, при этом содержание IL-1, IL-6 и TNF- в СЖ в острый период развития заболевания возрастает в 1,5-1,8 раз, по сравнению с контролем. Стихание воспалительного процесса сопровождается нормализацией содержания в СЖ IL-1 и TNF- при продолжающемся росте уровня IL-6. Содержание противовоспалительного IL-4 в СЖ, в отличие от такового в СК, существенно не меняется. Коэффициент соотношения уровней противоположных пулов цитокинов IFN-/IL-4 в острый период хламидийной инфекции конъюнктивы в СК и СЖ составляет соответственно 11,2 и 34,9 ед., при выздоровлении - соответственно 8,7 и 26,7 ед.

- - СЖ _____ СК

Рис.5. Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при офтальмоинфекциях, пкг/мл (1 - содержание цитокинов при поверхностных формах офтальмогерпеса, 2 - при глубоких, 3 - при аденовирусной инфекции и 4 - хламидийной инфекции глаз)

Сравнительный анализ локального и системного содержания IL-1, TNF-, IL-6 при вирусных (герпетической, аденовирусной) и хламидийной (Chlamydia trachomatis) офтальмоинфекциях имеет сходство в профиле цитокинов и направленности иммунного ответа, но различается по степени выраженности иммунологического реагирования с преобладанием его на локальном уровне (рис.5)

Однотипные реакции при вирусной (герпетической) и хламидийной инфекциях глаз могут быть обусловлены длительной персистенцией их возбудителей в организме человека, часто хроническим течением заболевания. Сопоставление содержания цитокинов с клиническим течением этих офтальмоинфекций выявило ассоциацию более высоких уровней TNF-, IL-1, IL-6, IFN- и IFN- в СК и СЖ при неблагоприятном (глубокие формы, рецидивы) течении заболевания, что может иметь прогностическое значение. Развитие воспалительных процессов в конъюнктиве глаза (аденовирусная и хламидийная офтальмоинфекции) ассоциируется с менее высоким локальным уровнем цитокинов, по сравнению с воспалением роговицы (офтальмогерпес), что объясняется наличием в конъюнктиве глаза человека мукозоассоциированной лимфоидной ткани, связанной со слизистыми оболочками и имеющей все компоненты, необходимые для гуморального иммунного ответа [Mondal S. K., 2008]. Что касается герпетической инфекции, то выявленная взаимосвязь уровней цитокинов с глубиной локализации воспаления в тканях роговицы обусловлена, возможно, активацией иммунологически неактивных в норме клеток интраокулярных тканей, в т. ч. эндотелия роговицы, что вызывает каскад цитокиновых реакций [Zheng M., Atherton S. S., 2005; Dace D. S. et al, 2007].

2. Значение цитокинов и иммуно-эндокринные взаимодействия в развитии воспалительных процессов в сосудистой оболочке глаза

Профиль цитокинов при воспалительных процессах в сосудистой оболочке глаза

Развитие воспалительных процессов в сосудистой оболочке глаза (увеальный тракт) обусловлено наличием большого количества разветвленных сосудов, где резко снижается скорость кровотока, создавая условия для оседания и фиксации в нем различных бактериальных и токсических агентов. При воспалении сосудистой оболочки глаза нами установлена тенденция к снижению соотношения иммунокомпетентных клеток (CD4+/CD8+), достоверное (р<0,05) повышение относительного числа CD95+ лимфоцитов. Отмечено увеличение содержания В-клеток крови и гипериммуноглобулинемия классов IgА и IgG. Выявленная взаимосвязь числа В-клеток (CD19+) в период максимального развития воспаления с содержанием IgМ (r=0,7731, p=0,024), вероятно, свидетельствует о продукции антиувеальных аутоантител этого класса Ig.

Воспаление сосудистой оболочки глаза (увеит) сопровождается смещением баланса цитокинов в пользу их продукции Th1 иммунокомпетентными клетками крови, что проявлялось значимым повышением уровней IL-1, TNF-, IL-6, IL-2, IFN- и IFN- в СК относительно практически здоровых лиц (табл.4).

Таблица 4 - Уровни цитокинов в сыворотке крови и слезной жидкости при воспалительных процессах сосудистой оболочки глаза (MSd)

Цитокин	Содержание цитокинов, пкг/мл
	сыворотка крови	слезная жикость
	контроль, n=37	стадии воспаления	контроль, n=28	стадии воспаления
		pазвитие n=96	завершение, n=75		pазвитие n=62	завершение,n=48
IL-1	34,35,6	203,2 37,3 ***	259,4 103,1***	93,415,7	245,4 37,2*	123,0 22,4
TNF-	40,59,3	140,9 36,6**	98,2 25,2*	98,920,4	305,2 38,2*	93,321,9
IL-6	44,67,0	779,5 44,6 ***	453,1 39,0*	226,4 30,2	518,6 114,5*	485,2 91,0 *
IL-2	426,0 55,2	547,8 52,0	754,0 87,1*	259,7 ± 42,3	424,8 40,5	331,6 38,2
IFN-	15,84,2	31,02,9	38,810,3*	26,2±6,3	55,418,2	47,18,5
IFN-	415,2 76,0	1274,7 208,2**	816,583,0*	506,2 98,5	1622,4 173,0*	894,5 81,8
IL-4	37,85,8	84,2 19,3*	114,6 32,5*	26,35,8	79,2 26,3**	98,9 24,2*
IL-1RA	147,4 56,5	808,4 81,8 ***	579,2 62,8**	215,5 52,0	763,9 71,3**	329,9 46,8

* - различие с контролем статистически значимо (р0,05); ** - р0,01;

*** - различие с контролем статистически значимо (р0,001 и менее)

Выявленные взаимосвязи (r=0,4652, р=0,028) уровня TNF- с содержанием CD4+ лимфоцитов, а также IL-1 с концентрацией IgМ (r=0,7620, р=0,024) в СК характеризуют активное участие различных компонентов иммунитета в развитии воспалительного процесса. Купирование воспаления нестероидными противовоспалительными препаратами приводит к восстановлению баланса цитокинов.

Как и при воспалении конъюнктивы и роговицы, дисбаланс локального уровня цитокинов при воспалительном процессе в увеальном тракте отличается большей степенью выраженности, чем системный.

При этом период развития воспаления характеризуется достоверным (р<0,05) повышением содержания IL-1, TNF-, IL-6, IL-1RA (в 2-3 раза) и тенденцией к повышению уровней IL-2 в СЖ, по сравнению с таковым в контроле, что соответствует классическим представлениям об активации иммунной системы.

Коэффициент соотношения уровней IFN-/IL-4 в острый период заболевания в СК и СЖ составляет соответственно 15,1 и 20,5 ед., при выздоровлении - соответственно 7,2 и 9,0 единиц.

Особенности дисбаланса местного и системного содержания провоспалительных цитокинов при воспалении сосудистой оболочки глаза определяются его этиологией: выявлено значимое увеличение их уровней при аутоиммунной патологии - системных ревматических заболеваниях (РЗ), в сравнении с герпетической (рис.6).

Рис.6. Сравнительная характеристика уровней цитокинов в cыворотке крови и слезной жидкости при воспалении сосудистой оболочки, ассоциированном с ВПГ и системными ревматическими заболеваниями.

Отличием герпетического воспаления в увеальном тракте от воспаления, ассоциированного с РЗ, является достоверный рост уровней в СК и СЖ IFN- (соответственно в 9,9 и 13,2 раз) и IFN- (соответственно в 3,4 и 3,6 раза), которые остаются повышенными и при выздоровлении. Это связано с высоким их содержанием в тканях глаза, обусловленном особенностями патогенеза вирусной инфекции, в т. ч. длительной персистенцией ВПГ в нервных ганглиях, приводящей к продолжительной продукции интерферонов [Акберова С.И., 2001]. Выявленная взаимосвязь уровня продукции TNF- и числом CD95+ лимфоцитов (r=0,78, p=0,054) крови при герпес-индуцированном воспалении сосудистой оболочки глаза свидетельствует об участии данного цитокина в регуляции апоптоза [Симбирцев А.С., 2004; Wang L. et al, 2007].

Важную роль в патогенезе воспаления сосудистой оболочки глаза играют нарушения гемодинамики и ангиогенеза. Установлено участие васкулоэндотелиального фактора роста (VEGF) в развитии РЗ без вовлечения в патологический процесс органа зрения [Марченко Ж.С., Лукина Г.В., 2005; Nakahara Н. еt al, 2003]. Проведенные нами исследования также выявили существенное повышение уровня VEGF в СК при воспалении увеального тракта, наиболее выраженное при развитии увеита на фоне системных РЗ (табл.5).

Таблица 5 - Содержание васкулоэндотелиального фактора роста в сыворотке крови при воспалении сосудистой оболочки глаза (MSd)

Воспаление увеального тракта	Содержание VEGF, пкг/мл
	стадия развития воспаления, n= 36	стадия завершения, n=25
В целом	468,074,8 ***	242,554,2 **
- при ревматических заболеваниях	572,881,5***	471,244,8***
- при герпетической инфекции	295,445,2**	108,027,5
- неясной этиологии	348,748,4***	290,349,2 *
Контрольная группа	36,98,6

** - различие с контролем статистически значимо (р<0,01);

*** - различие с контролем статистически значимо (р0,001 и менее)

В СК у больных с рецидивом отмечен более высокий уровень VEGF (в среднем 762,459,2 пкг/мл), по сравнению с таковым у впервые заболевших пациентов (в среднем 237,634,8 пкг/мл, р<0,001). При этом содержание VEGF в СК в интервале 550-1750 пкг/мл при рецидиве заболевания отмечали в 66,7% случаев, тогда как при первой атаке - в 16,7%, что, вероятно, является неблагоприятным признаком и имеет прогностическое значение.

При сравнительном анализе системного содержания цитокинов установлена его зависимость от анатомо-функционального строения оболочки глаза, вовлеченной в воспалительный процесс (рис.7). Наименьшие концентрации IL-6, TNF- и IL-1 в СК отмечаются при его развитии в конъюнктиве, наибольшие - в сосудистой оболочке глаза, отличающейся наличием густой сети кровеносных сосудов, возможностью миграции антигенов, Т - и В-лимфоцитов, медиаторов межклеточных реакций из тканей глаза в кровь [Катаргина Л.А., Архипова Л.Т., 2004].

Рис.7. Содержание цитокинов в сыворотке крови зависимости от локализации воспалительного процесса в оболочках глаза.

...