Метаболическая активность и функциональные резервы лейкоцитов при наркомании

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Метаболическая активность и функциональные резервы лейкоцитов при наркомании

Каримова Равшания

03.00.04 - биохимия

Душанбе - 2009

Работа выполнена на базе научно-технического и учебного центра Таджик- ского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино.

Научные консультанты:

1. Заслуженный деятель науки РТ, академик АН РТ, доктор биологических наук, профессор - М.М. Якубова.

2. Заслуженный деятель науки РТ, академик МАИА, доктор биологических наук, профессор - Н.Б. Бердиев.

Официальные оппоненты:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор В.А. Козлов

доктор биологических наук, профессор А.М. Сабурова

доктор медицинских наук, профессор Н.М. Шаропова

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт гастроэнтерологии АН РТ

Защита диссертации состоится 18 cентября 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 737.004.05 по защите докторских диссертаций при Таджикском национальном университете по адресу: 734025, г. Душанбе, проспект Рудаки, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского национального университета.

Автореферат разослан «____»______________2009г.

Размещен на сайте ВАК www. ed.. gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент Хамрабаева З.М.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы В последние годы появилось множество работ, свидетельствующих об иммунологической недостаточности у больных наркоманией. [Гамалея Н.Б., 1994; Хотовицкий А.В., 2002; Вавренчук В.В. 2005; Акперов Э.К., 2005; Bouix O., et al., 1995; Eisenstein, 1997; Gaureriaux-Ruff C., et al., 1998]. Однако сведения по изучению биохимических механизмов, лежащих в основе нарушения иммунологических реакций при воздействии наркотических веществ, в литературе весьма ограничены. В связи с этим изучение иммуно-биохимических изменений, происходящих при метаболической перестройке организма у больных наркоманией, позволяет проводимое исследование сделать патогенетически более обоснованным.

Известно, что гранулярные лейкоциты являются важным компонентом защитной системы организма человека и животных. Свою основную функцию они осуществляют с помощью фагоцитоза - филогенетически наиболее древнего механизма защиты от проникающих в организм инородных частиц [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995; Кузнецов В.Ф., 1995; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Klebanoff S.J., 1992; Heufelder A.E., Bahn R.S., 1993; Peterson R.K., Nielsen H.B., 1997; Shiratsuch A., Nakanishi Y., 1999]. Фагоцитоз является частью многообразных функций нейтрофилов, участвующих в промежуточном обмене веществ, реактивности и в системе специфических реакций иммунного надзора и защиты. Однако механизм фагоцитоза до настоящего времени полностью не изучен, что делает актуальной проблему поиска новых подходов и биохимических основ в исследовании естественных и специфических иммунных реакций.

В свете современных представлений поглощение и переваривание микробов осуществляется с помощью разнообразных биохимических реакций: потребление кислорода, гликолиз, а также процессы биосинтеза. Контакт фагоцитарных объектов с поверхностью клетки приводит к функциональным изменениям компонентов плазматической мембраны и стимуляции метаболических процессов в фагоците (рис.1). Повышение активности окислительно-восстановительных реакций при фагоцитозе усиливает окисление глюкозы через гексозомонофосфатный шунт и способствует накоплению перекиси водорода, и свободных радикалов в нейтрофилах Перекись водорода является сильным окислителем клеточных компонентов [Галанкин И.В., Сапрыкин В.П., 1997; Першин Б.Б. и соавт., 2003; Овсянников М.В., 2005; Ambruso D. et al., 1990; Droge W. et al., 1992; Weigent D.A., et al. 1995]. При малой ее концентрации усиливается окислительный метаболизм в фагоцитах, активируются процессы завершенности фагоцитоза и адгезии нейтрофилов к эндотелию сосудов с последующей их миграцией в экстравазальное русло. Высокие ее концентрации приводят к гиперпродукции биологических оксидантов в нейтрофилах с мощным цитотоксическим потенциалом, влияющих на механизм клеточного распознавания антигенов и резистентности самих нейтрофилов.

Для характеристики фагоцитарной активности нейтрофилов первостепенное значение имеет состояние завершенного и незавершенного фагоцитоза. Изучение завершенности фагоцитоза является одним из главных, но наименее изученных звеньев клеточной реактивности организма. Поэтому поиск изучения биохимических особенностей в процессе перестройки и морфофункциональных преобразований нейтрофилов после фазы завершенного фагоцитоза является актуальной в исследованиях естественной резистентности у больных с опийной наркоманией. Изучение биохимических основ единой клеточно-гуморальной защиты организма расширит понятие о патогенезе опийной наркомании и с этих позиций поможет разработать новые пути прогнозирования, диагностики и профилактики наркомании.

Цель исследования. Изучить особенности функциональной активности нейтрофильных фагоцитов в крови больных с героиновой наркоманией, усовершенствовать биохимический подход к фагоцитарному процессу в клинических и экспериментальных исследованиях, разработать способы иммунологической диагностики данного заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить биохимические механизмы фагоцитарной реакции сегментоядерных нейтрофилов крови при наркомании в клинических и экспериментальных исследованиях.

2. Исследовать цитоморфологические преобразования и биохимические процессы фагоцитирующих клеток после завершения переваривания микробов.

3. Исследовать состояние адаптационных и компенсаторных возможностей нейтрофилов при моделировании наркотической зависимости в эксперименте.

4. Определить метаболическую активность и функциональные резервы гранулярных лейкоцитов при воздействии наркотических веществ in vitro.

5. Выявить характер изменения показателей фагоцитоза в системе взаимосвязи с показателями клеточного, гуморального иммунитета и биохимических реакций у наркозависимых лиц.

6. Изучить возможность участия сегментоядерных нейтрофилов в процессе повторного фагоцитоза в циркулирующей крови при усилении окислительного метаболизма в клетках.

7. Разработать способ определения наличия опиатов в крови с использовании ем реакций фагоцитоза.

8. Разработать новый способ расчета НСТ-положительных клеток как показателя кислородзависимых систем бактерицидности гранулоцитов с учетом стадий завершенного и незавершенного фагоцитоза.

Научная новизна: Впервые для определения завершенности фагоцитоза в крови больных наркоманией учитывается фаза «созидательного покоя», которая происходит при истощении энергетических ресурсов в микрофагах.

Впервые приводятся теоретическое и практическое обоснование, а также биохимические подходы к проявлению феномена повторного фагоцитоза нейтрофилов в кровеносном русле.

Впервые выявлена новая форма фагоцитарной недостаточности нейтрофильных лейкоцитов, проявляющаяся в высокой активности (гиперактивности) завершения фагоцитоза при низкой способности к поглощению и перевариванию микробов, вызванная дискоординацией обменных процессов при наркомании.

Разработан простой иммунологический тест определения опиатов в крови с помощью реакции фагоцитоза, основанный на усилении метаболической активности клеток после введения наркотических веществ in vitro.

Модифицирован способ расчета НСТ-позитивных клеток внутри гранулярных лейкоцитов после восстановления нитросинего тетразолия с учетом цитоморфологических изменений нейтрофилов в стадии завершенного и незавершенного фагоцитоза.

Практическая значимость: Разработанный новый способ определения фазы «созидательного покоя дает возможность более четкого выявления стадии завершенности фагоцитоза и может быть использован в качестве дополнительного теста в прогнозировании заболевания и эффективности проводимых лечебных мероприятий.

Выявленная новая форма фагоцитарной недостаточности мало фагоцитирующих и быстро переходящих в стадию завершения и «покоя» позволяет оценить тяжесть абстинентного синдрома, степень наркотической интоксикации и помочь в разработке новых биохимических подходов к патогенезу наркомании.

Феномен повторного фагоцитоза расширяет понимание функцио-нального значения нейтрофилов в крови и биохимических механизмов формирования наркомании.

Разработанный фагоцитарный тест, определяющий наличие опиатов в крови людей и животных, повышает эффективность иммунологической диагностики наркомании.

Модификация способа расчета НСТ-теста упрощает подсчет зерен формазана внутри фагоцита и позволяет более четко дифференцировать стадию переваривания и завершения фагоцитарной реакции, а также степень активности окислительно-восстановительных реакций в микроцитах при наркомании.

Определение показателей перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активности антиоксидантной защиты в сыворотке крови позволяет определить накопление свободных радикалов и активности метаболического взрыва в нейтрофилах.

Результаты исследований можно использовать в учебном процессе, в научно-исследовательских и в клинических лабораториях биохимического, микробиологического и гематологического профиля.

Положения выносимые на защиту:

* У больных с опийной наркоманией в период абстиненции увеличиваются показатели завершенности фагоцитоза, снижается активность НСТ-восстанавливающей и адгезивной способности лейкоцитов. Хроническая опийная интоксикация увеличивает реактивность и скорость фагоцитарного процесса, функционально ослабленные фагоциты мало фагоцитируют и быстро переходят в стадию завершенности и «покоя». У пациентов, страдающих опийной зависимостью, в период отмены наркотиков снижается содержание Т- и особенно В-лимфоцитов, Т-хелперов, наряду с этим увеличивается содержание Т-супрессоров, ЦИК, а также IgM и IgA.

* У наркозависимых больных в период лишения употребления наркотика увеличивается содержание конечных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в начале абстиненции и умеренно снижается в постабстинентном состоянии, а активность супероксиддисмутазы (СОД) в сыворотке крови снижена в течение всего периода абстиненции.

* В крови лабораторных белых мышей наибольшие показатели завершенности фагоцитоза отмечены в стадии отмены введения наркотических веществ, дисфункция нейтрофилов (повышение НСТ-восстанавливающей и снижение адгезивной способности) менее выражена, чем у людей. Активность нейтрофилов, принимающих участие в повторном фагоцитозе у животных выше, чем у больных в состоянии абстиненции.

Внедрение результатов исследования в практику. Имеется 3 патента Государственного патентного ведомства Республики Таджикистан (№ 0800168 от 10.01.2008 г.; № 080071 от 10.01.08 г.; № 0800336 от 18.06.2008 г.), получено 8 удостоверений на рационализаторское предложение, выданное ТГМУ им. Абуали ибни Сино, изданы 2 методических рекомендаций по совершенствованию метода определения фагоцитарной реакции нейтрофилов в крови.

Материалы исследований используются в учебном процессе на кафедрах нормальной физиологии, патологической физиологии, микробиологии и хирургических болезней №1.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на II Всемирном конгрессе по иммунологии и аллергии (М.,2004), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); на международной конференции «Актуальные проблемы физиологии человека и животных» (Душанбе, 2003), в научно-медицинском журнале «Паёми Сино» («Вестник Авиценны») Таджикского государственного медицинского университета им. Абуали ибни Сино; в научном журнале «Вестник национального университета» (Душанбе, 2004-2005 гг.), а также в материалах 53-й научно-практической конференции ТГМУ (с международным участием) (Душанбе, 2005), в материалах научно-практической конференции с международным участием «Семейная медицина и здоровье человека» (Душанбе, 2005), обсуждены на заседании межкафедральной экспертной комиссии по теоретическим дисциплинам ТГМУ им. Абуали ибни Сино (29 июня 2008 г), на расширенном межкафедральном заседании кафедры биохимии биологического факультета ТНУ (31 марта 2009 г)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 научные работы.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 257 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы с общей характеристикой материала и методов исследования, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель включает 370 названий, из них 240 на русском и 130 на иностранных языках.

Содержание работы

лейкоцит наркомания фагоцитоз

Характеристика клинического и экспериментального исследования. С целью выполнения поставленных задач были обследованы больные с героиновой наркоманией при синдроме лишения введения наркотика 80 чел и острой наркотической интоксикации (одурманивания) 40 чел. Все обследованные были мужского пола в возрасте от 23 лет до 41 года. В качестве сравнения исследовали венозную кровь 25 больных с алкоголизмом, 20 с психическими расстройствами, 30 практически здоровых людей (доноров), а также 110 студентов при различной степени эмоционального напряжения.

Состояние наркотической и алкогольной зависимости, острого и хронического воздействия стресса моделировали на 100 беспородных белых мышах массой 18-20 г, которые были разделены на 3 экспериментальные группы: 1- наркотическая зависимость (состояние острой и хронической интоксикации, а также прекращение введения наркотического вещества); 2 - алкогольная зависимость (острая и хроническая интоксикация, а также прекращение введения этанола); 3 - воздействие стресса (острая и хроническая форма). После декапитации животных кровь забирали для анализа, а изъятые после вскрытия внутренние органы (печень, головной мозг и тимус) подвергались гистологическому исследованию.

В работе использован комплекс гематологических, иммунологических, биохимических и гистологических методов исследования.

Методы исследования. Определение неспецифических факторов иммунитета. Изучение фагоцитарной активности сегментоядерных нейтрофилов проводили по методу Н.В. Васильева и соавт., 1972 в нашей модификации (Н.Б. Бердиев и соавт., 1983, 1990). В качестве тест-микроба использовали суточную культуру кишечной палочки. Количественную характеристику полученных результатов проводили по стадиям фагоцитарного процесса в разные периоды времени выдерживания в термостате: 5 мин (ФАН1); 30 мин (ФАН2); и 120 мин (ФАН3). О завершенности реакции фагоцитоза судили по поэтапным морфологическим преобразованиям нейтрофила после полного лизиса захваченных микробов. При определении повторного фагоцитоза в циркулирующей крови после регенерации клеточных элементов, нарушенных в процессе «респираторного взрыва», рассчитывали показатели поглощении и переваривания микробов. НСТ-тест определяли по методу Park. Оценку НСТ-позитивных клеток проводили в нашей модификации с учетом стадий завершенного и незавершенного фагоцитоза. Кроме того, изучали адгезивную способность лейкоцитов (А.А. Бутакова и соавт., 1991), спонтанную аггломерацию лейкоцитов по методу Flech, увеличение ядерной фрагментации (С.А. Навноцкий, 1990) и % лизиса как показатель полного истощения резервов лейкоцитов.

Исследование клеточного и гуморального иммунитета проводили в расширенном наборе тестов I уровня: розеткообразующую способность Т-лимфоцитов (Е-РОК), В-лимфоцитов (ЕАС-РОК) по методу Jondal в модификации Понякиной И.Д. с соавт., 1983, розеткобразующую способность нейтрофилов (Е-РОН) по методу Авдеева В.С. и соавт., 1984. Параллельно Е-РОК определяли количество теофиллинрезистентных (ТФР) и теофиллинчувствительных (ТФЧ) лимфоцитов. Количественное определение IgA, IgM, IgG в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в геле по Mancini, содержание циркулирующих иммунных комплексов - с помощью реакции преципитации 4%-ным раствором полиэтиленгликоля, (мол.м. 6000).

Биохимические методы исследования. Активность ПОЛ оценивали по концентрации (МДА) по методу И.Д. Стальной, 1985. Определение активности антиоксидантной защиты (СОД) проводили методом В.А. Костюк, 1987.

Экспериментальные методы. С целью моделирования наркотической и алкогольной зависимости лабораторные белые мыши были разделены на три параллельные экспериментальные группы: с острой и хронической интоксикацией, а также при лишении введения препарата. В качестве контроля была использована интактная группа животных. Для наркотизации животных использовали раствор морфина гидрохлорида (5 мг/кг), алкоголизацию проводили с помощью внутрижелудочного введения 40%-ного раствора этанола (0,2-0,6 мл). Состояние острого эмоционального стресса изучали после 2 ч иммобилизации животных, физического - после принудительного плавания.

Степень интоксикации и влияния стресса определяли с помощью тест-системы поведенческих реакций методом «открытое поле» по Константинопольскому М.А. и соавт., 1992. После декапитации в крови животных изучали неспецифические факторы иммунитета, а внутренние органы (печень, сердце, головной мозг и вилочковую железу) подвергали гистологическому исследованию.

Методы статистической обработки материала. Статистический анализ результатов проведен с использованием специализированной программы SPSS-16,0. Различия между двумя величинами считали достоверными, если вероятность их отклонения не превышала 5% (Р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Иммунологическое и биохимическое исследование крови у больных с опийной наркоманией проводили в состоянии лишения употребления наркотиков - на 1, 3, 5, 7, 9 и далее сутки, поскольку именно в этот период в организме развивается симптомокомплекс, оказывающий влияние на нормальное функционирование всех органов и систем, включая и механизмы естественной защиты. Основное внимание было сосредоточено на изучении состояния сегментоядерных нейтрофилов после полного переваривания микробов и процесса цитоморфологического преобразования клеток после завершенности реакции фагоцитоза. Приведенный материал свидетельствует о выраженной фагоцитарной активности микроцитов у больных с наркоманией в начальные периоды наблюдения, характеризующиеся увеличением показателей завершенности фагоцитоза (табл. 1). В последующие сроки ФАН отличается незначительным снижением интенсивности суммарных показателей, однако уровень их активности остается выше, чем в группе доноров. Усиление окислительного метаболизма в нейтрофилах под действием наркотиков приводит к гиперпродукции активных форм кислорода - биологических оксидантов, ускоряющих процесс завершенности фагоцитоза. В ряде исследований авторы [Гусев С.А., 1990; Клюбин И.В., 1996; Сапин М.Р., 2000; Bayer B.M.et al., 1990; Blalock I.E., 1992; Klebanoff S.J., 1992], также высказывают предположение о способности лейкоцитов приспосабливаться к условиям резко возросшей функциональной активности изменением метаболизма. Динамика изменений активности кислородзависимого метаболизма ПМЯЛ, определяемая с помощью НСТ-теста, свидетельствует о подавлении восстанавливающей способности нейтрофилов в крови больных в сравнении с практически здоровыми людьми (рис. 2). Активность НСТ-восстанавливающей способности лейкоцитов после проведенного лечения сохраняется на уровне показателей, выявленных при поступлении, однако уровень их остается ниже контроля. Индекс переваривающей способности, напротив, имеет отчетливую тенденцию к повышению и почти в 2 раза превышает исходную величину (P<0,01). В результате проведенного исследования выявлено, что наркотические препараты стимулируют метаболическую активность микрофагов. Активизация фазы завершенности фагоцитоза протекает на фоне ослабления процессов поглощения и переваривания, что отражает нарушение механизмов антибактериальной системы фагоцитов.

При изучении адгезивных свойств нейтрофилов выявлена тенденция снижения показателей у наркозависимых больных. Анализ средних значений указывает на наличие отрицательных связей между фагоцитарной и адгезивной активностью гранулярных лейкоцитов. Данная закономерность особенно выражена на 5 и 7 сут наблюдения.

В качестве сравнения проведены исследования функционально-метаболической активности микрофагов в динамике алкогольной абстиненции (табл. 2). У этой категории больных показатели ФАН характеризуются волнообразным течением - существенным повышением на 1 и 3 сут и некоторым снижением в последующие сроки, хотя и с превышением результатов (в 1,5 раза) контрольных величин. Также обнаружена более четкая обратная зависимость между изменениями параметров адгезии и завершенности фагоцитоза по сравнению с больными наркоманией. В динамике снижения показателей НСТ-теста выявляется более равномерный характер, а в показателях интенсивности процессов цитоморфологического преобразования нейтрофилов, напротив, стабильное повышение величин как в состоянии алкогольной, так и наркотической абстиненции. Следует отметить, что клиническая картина выздоровления больных чаще опережает восстановление функции нейтрофилов в крови.

Разработанный нами способ определения завершенности фагоцитоза и этапов структурного обновления фагоцитов позволяет определить интенсивность фагоцитарных реакций в циркулирующей крови и функциональной готовности нейтрофилов к пополнению прикраевого пула сосудистого русла для миграции в ткани с повышенной метаболической активностью. Выявленная особенность функционирования нейтрофилов в условиях патологии - увеличение реактивности и скорости фагоцитарного процесса приводит к истощению энергетического ресурса микрофагов и делает фагоцитоз неэффективным. Вследствие чего функционально ослабленные фагоциты мало фагоцитируют и быстро переходят в стадию завершенности и покоя. Снижение активности антиоксидантной системы и повышение накопления продуктов ПОЛ способствуют появлению в клеточных мембранах токсических радикалов, ускоряющих дегенеративные изменения клеточных структур фагоцитов - разрыву оболочки и высвобождению внутриклеточных резорбтивных ферментов в окружающую среду.

Замечено, что в разгар развернутого абстинентного синдрома у больных наркоманией увеличены относительные величины агрегации и лизиса лейкоцитов. Повышение индекса этих показателей при ФАН2 отмечается на 3 и 5 сут заболевания. Возможно, это связано с тем, что максимальная выраженность клинического проявления болезни приходится на 2-3, а ослабление - на 5-7 сут синдрома лишения наркотиков, что свидетельствует о напряженности неспецифической защиты организма в этот период.

Представленный материал указывает на то, что величина фагоцитарных критериев находится под многоуровневым контролем со стороны различных систем организма и что дефектность фагоцитоза может явиться универсальным фактором патогенеза при многих заболеваниях человека.

Формирование наркотической зависимости в экспериментальных исследованиях при внутрибрюшинном введении морфина белым мышам констатирует повышение интенсивности фагоцитарного процесса в исследуемой крови (табл. 3). Показатели завершенности фагоцитоза достигают своего максимального уровня как при хронической интоксикации препаратом, так и при его отмене. Наибольшая стимуляция метаболической активности микрофагов замечена при отмене введения морфина, что, по-видимому, связано с усилением центральных механизмов регуляции защитных систем организма.

Наряду с увеличением напряженности ФАН в крови экспериментальных животных достоверно увеличивается число лейкоцитов и сегментоядерных нейтрофилов. Наличие антигенных раздражителей в крови экспериментальных животных стимулирует выработку лейкоцитов в красном костном мозге и повышает активность их в циркулирующей крови.

Стимуляция функциональной активности нейтрофилов подтверждается увеличением НСТ-восстанавливающей способности фагоцитов. Процент поглотительной активности зерен формазана почти в 3-4 раза превышает величину показателей интактной группы (Рис. 3). В сравнительном анализе данных фагоцитарных параметров (СПЗФ) и количеством НСТ-позитивных клеток выявлена положительная взаимосвязь. Наличие опиатов в крови вызывает резкое увеличение поглощение зерен красителя и ускорение процесса завершенности фагоцитоза. В то же время замечено, что с повышением интенсивности фагоцитарной реакции снижается количество поглощенных микробов одним нейтрофилом. В данном случае преобладает негативная взаимосвязь между активностью нейтрофилов, вовлеченных в фагоцитарный процесс, и снижением индекса переваривания. Снижение резервных возможностей микроцитов у наркотизированных мышей характеризует подавление неспецифической резистентности организма в борьбе с бактериальной инфекцией.

В приведенном материале отмечаются разнонаправленные связи фагоцитарных величин с результатами реакции НСТ и адгезивностью нейтрофилов. По отношению к НСТ-востанавливающей способности клеток, отражающей бактерицидную активность нейтрофилов, выявлена положительная взаимосвязь (P<0,05), а по отношению к показателям адгезивной активности, характеризующей готовность микрофагов к присоединению к прикраевому пулу сосудистой стенки, - негативную связь (P<0,001). Количественные показатели адгезии в 1,5-2 раза ниже по сравнению с величинами интактной группы. Такая особенность гранулоцитов свидетельствует об увеличении времени пребывания фагоцитов в циркулирующей крови.

В данной работе нами впервые представляются доказательства существования феномена повторного фагоцитоза сегментоядерных нейтрофилов в системе кровеносного русла. Высокая активизация полиморфнорядерных лейкоцитов к завершенности фагоцитоза, снижение адгезивности гранулоцитов и усиление стимулирующих факторов, позволяют нейтрофилам, по-нашему мнению, пройти ряд этапов обновления клеточных структур в период стадии «созидательного покоя» и некоторому количеству наиболее активных клеток вновь вступить в реакцию повторного фагоцитоза.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что у практически здоровых людей при 5- и 30-минутном фагоцитарном процессе явлений повторного фагоцитоза не наблюдается. При 2-часовой длительности фагоцитарной реакции 7% сегментоядерных нейтрофилов оказываются вовлеченным в процесс повторного фагоцитоза. У больных с опийной наркоманией на 5 сут стационарного лечения интенсивность повторного фагоцитоза достигает 11% даже при кратковременной стимуляции нейтрофилов (5 мин) фагоцитарным объектом. Однако наибольшая активность повторного фагоцитоза проявляется при 2-часовом фагоцитарном процессе, при котором величина активности нейтрофилов у больных почти в 2 раза превышает уровень контрольной группы (P<0,001). У больных с алкоголизмом активизация этого процесса на 6% отмечается на 3 сут алкогольной абстиненции, а у больных с психическими расстройствами данный феномен не наблюдается.

В экспериментальных исследованиях показатели активности нейтрофилов, принимающих участие в повторном фагоцитозе, оказываются более выраженными, чем у людей.

Рис. 1. Характеристика окислительно-восстановительных реакций в полиморфноядерных лейкоцитах в процессе фагоцитоза

Таблица 1

Фагоцитарная активность сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови больных с наркоманией по фазам фагоцитарного процесса (М±м)

Примечание: Звездочка - различие достоверно по сравнению с аналогичными показателями в контроле (доноры),

* Р < 0,05, ** Р < 0,01, *** Р < 0,001.

Таблица 2

Функциональные особенности нейтрофилов у больных с алкоголизмом в динамике абстинентного синдрома (М±м)

Примечание: * различие показателей по отношению к донорам (Р < 0,05)

У интактных мышей частота выявлений их при ФАН3 более чем в 3 раза превышает уровень здоровых людей (доноров). Наиболее активны в этом отношении были фагоцитарные клетки при хронической форме наркотической интоксикации. При ежедневном введении алкоголя внутрь животным активность микроцитов к повторному фагоцитозу менее выражена.

Влияние постоянного стресса на организм белых мышей также вызывает стимуляцию фагоцитарных реакций, выявляя признаки повторного фагоцитоза. Удельный вес показателей выше при 30-минутном (20%), нежели при 2-часовом фагоцитарном процессе (18%). Влияние острого (иммобилизационного) стресса вызывает гиперактивизацию лейкоцитов с высоким показателем повторного фагоцитоза, даже при кратковременном 5-минутном взаимодействии нейтрофилов с объектом фагоцитоза. При 30-минутной продолжительности фагоцитарной реакции этот показатель наиболее выражен и почти в 2 раза превышает уровень повторного фагоцитоза, отмеченный у людей в состоянии острого эмоционального напряжения.

Таким образом, проявление повторного фагоцитоза нейтрофилов в циркулирующей крови, выявленное как в клинических, так и в экспериментальных исследованиях свидетельствуют о высокой степени напряженности факторов неспецифического иммунитета. Высокая активизация процессов окислительного характера способствует тому, что после фазы «созидательного покоя» гранулоциты вновь готовы приступить к выполнению своей основной функции - фагоцитированию агентов с чужеродной информацией с целью восстановления нарушенного антигенного баланса в крови. Возможно, увеличение срока пребывания зрелых нейтрофилов в крови снижает скорость их миграции через экстравазальное русло и является причиной повреждения внутренних органов у больных с наркоманией.

Таблица 3

Исследование интенсивности фагоцитарных реакций полиморфноядерных лейкоцитов крови у экспериментальных животных при введении морфина in vitro (М±м)

Примечание: * достоверное отличие показателей после введения препарата от показателей до введения (Р < 0,001

Существующие литературные данные указывают на подавляющее действие морфина на клетки иммунной системы, в частности на Т- и В-лимфоциты, однако фактов относительно проведения анализов с воздействием морфина in vitro на сегментоядерные нейтрофилы в процессе фа- гоцитоза нами не обнаружено. С этой целью мы провели ряд клинических (на больных с наркоманией, алкоголизмом, на лицах в состоянии психоэмоционального напряжения и донорах) и экспериментальных исследований (при различных формах наркотической, алкогольной интоксикации, при стрессе и на интактных белых мышах).

Материалы анализов свидетельствуют о резком угнетении функциональной активности нейтрофилов у здоровых лиц при введении раствора морфина гидрохлорида in vitro. Суммарные показатели завершенного фагоцитоза почти в 3 раза ниже, чем до введения морфина. У больных с алкоголизмом процент переваривающей активности выше после введения препарата, а фагоцитарный показатель приближается к фоновым величинам со слабым проявлением повторного фагоцитоза. У больных с наркоманией процент завершенности фагоцитоза достигает своего «плато» с максимальной выраженностью признаков повторного фагоцитоза. В экспериментальных исследованиях установлено, что при введении морфина in vitro у интактных животных отмечается резкое подавление фагоцитарной функции лейкоцитов с высоким процентом лизиса клеток (60%). Аналогичная картина наблюдается и в состоянии длительного стресса. При алкогольной интоксикации введение препарата вызывает усиление процессов переваривания и лизиса микробов, а показатели морфофункционального преобразования приближаются к исходным величинам с более выраженной, чем у больных с алкоголизмом активностью повторного фагоцитоза. При наркотической интоксикации результаты по всем фагоцитарным критериям выше, чем в предыдущих группах. Выявленные особенности функционирования полинуклеаров при воздействии морфина позволяют сделать предположение о том, что наркотические препараты, включая алкоголь, способны изменять свойства опиоидных рецепторов на поверхности иммунокомпетентных клеток, в том числе нейтрофилов периферической крови человека [Зозуля А.А., Пшеничкин С.Ф., 1990; Сarr D.J., 1991; Сhukwuocha R., et al., 1994; Makman M.N.., et al., 1995; Roy S., Loh H.H., 1996]. Морфин обладает сродством к мю-опиоидным рецепторам, а при его введении происходит изменение конформационного состояния опиатных рецепторов, так что при их блокаде происходит повышение уровня внутриклеточного цАМФ и усиление метаболизма в нейтрофилах. Проведенные исследования позволяют оценивать функциональное состояние опиоидных рецепторов на поверхности нейтрофилов периферической крови человека и животных, что имеет диагностическое и прогностическое значение в плане выявления наличия опиатов в крови.

Гистологическое исследование препаратов не выявило особых изменений в органах животных при введении морфина, этанола и воздействии стресса. По-видимому, интоксикация психоактивными веществами и воздействие сильного и длительного стресса в течение недели приводит к существенным изменениям в нейро-гуморальных регуляторных процессах организма белых мышей, но не вызывает необратимых нарушений в жизненно-важных органах грызунов.

Как известно, при опийной наркомании происходят выраженные изменения в состоянии специфического иммунитета и неспецифической резистентности, направленные на поддержание внутренней среды организма. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном снижении количественной и функциональной активности Т-лимфоцитов, Т-хелперов, особенно В-лимфоцитов и напротив, увеличение содержания Т-супрессоров, ЦИК, IgМ и IgА. Эти различия у больных с опийной наркоманией в состоянии абстиненции носят универсальный характер. Мы попытались выявить взаимосвязь между фагоцитарными параметрами и клеточно-гуморальными факторами защиты.

В проведенном исследовании установлено, что количество Т-лимфоцитов негативно связано с суммарным показателем завершенности фагоцитоза как при ФАН1, так и при ФАН2. Причем при ФАН1 эта закономерность более выражена, что свидетельствует о снижении поглотительной активности и выраженной способности нейтрофилов к завершению реакции фагоцитоза. Причиной недостаточности в функционировании лимфоцитов и микрофагов, вероятно, является то, что увеличение потребления наркотиков снижает активность фермента СОД в сыворотке крови, нейтрализующая действие свободных радикалов. Одновременное повышение активности фермента аденилатциклазы (АД) приводит к снижению реакции розеткообразования Т-лимфоцитов и нарушению клеточного гомеостаза. В динамике наркотической абстиненции эта взаимосвязь наиболее выражена на 1 и 2 сут наблюдения. На 3 и 5 сут выявлен дисбаланс между способностью к розеткообразованию лимфоцитов и к завершенности фагоцитоза нейтрофилов. Между показателями теофиллинрезистентных (ТФР) функции лимфоцитов и фагоцитарными критериями в динамике наблюдения отмечена положительная взаимосвязь, а в отношении теофиллинчувствительных лимфоцитов к фагоцитозу - отрицательная. Соотношение иммунорегуляторного индекса ТФР/ТФЧ на протяжении острой фазы и в постабстинентном состоянии больных остается стабильно сниженной в сравнении с группой здоровых лиц. Повышение Т-супрессорной и снижение Т-хелперной активности лимфоцитов в процессе адаптации к отмене наркотиков свидетельствуют о снижении иммунологической реактивности и напряженности аутоиммунных процессов в организме больных с героиновой наркоманией. Установлено особенно резкое угнетение функции В-лимфоцитов у наркозависимых лиц со слабой способностью к нормализации в процессе проведенного лечения. Снижение экспрессии СД22+-детерминант может служить признаком тяжести заболевания. Между розеткообразующей способностью нейтрофилов и интенсивностью в фазе завершения фагоцитарной реакции наблюдается обратная зависимость: уменьшение одного из показателей приводит к накоплению второго и наоборот.

Таким образом, снижение количества В-лимфоцитов свидетельствует о тяжести абстинентного состояния больных, а повышение способности к розеткообразованию данных клеток - о снижении остроты патологического процесса. Одновременно с понижением числа Т- и В-лимфоцитов у пациентов с хронической опийной интоксикацией отмечается дисбаланс в пуле основных классов иммуноглобулинов. Между содержанием IgG и СПЗФ отмечается слабая негативная связь (P?0,05) Повышение уровня IgМ в 3,5 раза в период острой фазы абстиненции положительно коррелирует с показателями фагоцитоза (IgM-v=-0,99). На 5 и 7 сут эта закономерность не выявляется, а на 9 сут оказывается даже негативной. Содержание IgА в развернутую стадию абстиненции и до конца исследования имеет тенденцию к умеренному снижению показателей. При выявлении взаимосвязи с критериями ФАН выраженность ее пропорциональна величинам предыдущих классов иммуноглобулинов.

Полученные данные свидетельствуют о напряжении гуморального иммунитета в разгар абстиненции. Индукция реакций антителообразования является, по всей вероятности, достаточно необходимой, поскольку хроническое поступление опия и его производных запускает иммунный ответ, конечным итогом которого является связывание антигена с антителом и элиминация его из организма. Избыточное антителообразование приводит к повышению уровня циркулирующих иммунных комплексов и увеличению активности нейтрофилов к фагоцитозу. Реакция нейтрофила, направленная на элиминацию избытка иммунных комплексов, зависит во многом от силы и времени антигенного воздействия на иммунную систему и исходного уровня функциональной активности клеток. Между ЦИК и СПЗФ выявлена прямая взаимосвязь. Ослабление фагоцитарной функции нейтрофилов способствует накоплению иммунных комплексов в крови и оседанию их в тканях в повышенной концентрации. Наряду с этим, длительная персистенция в организме иммунных комплексов у больных с наркоманией приводит к истощению функционального резерва гранулоцитов, а вследствие гиперактивизации и скорой гибели клеток - к формированию нейтропении. У больных в состоянии острой наркотической интоксикации отмечается высокая реактивность зернистых лейкоцитов при 5-минутном фагоцитарном процессе: показатели завершенности фагоцитоза выше, чем у больных в стадии абстиненции. Вместе с тем, отмечается увеличение числа лейкоцитов в циркулирующей крови. При 30-минутном фагоцитарном процессе величина суммарных показателей снижена, хотя и сохраняется на уровне двукратного увеличения показателей фона.

У больных с острым наркотическим отравлением выявлена прямая позитивная связь СПЗФ с содержанием IgМ и IgА в сыворотке крови. В результате накопления нерастворимых иммунных комплексов в крови стимулируется кислородзависимый путь метаболизма нейтрофилов, приводя их к гиперактивности как при ФАН1, так и при ФАН2.

Для больных с алкоголизмом в отличие от больных наркоманией характерно менее выраженное угнетение способности лимфоцитов к розеткообразованию. Выявлена негативная взаимосвязь между показателями биоцидности нейтрофилов и количеством Т-лимфоцитов (E-POK-v=-1). Эта зависимость более выражена в условиях ФАН1 (P<0,001), нежели при более длительном фагоцитарном процессе (ФАН2), что подтверждает высокую реактивность сегментоядерных нейтрофилов при алкогольной и наркотической интоксикации. Снижение количественного состава В-лимфоцитов при алкогольной интоксикации не столь значительно по сравнению с таковым у наркозависимых больных. Вместе с тем отмечается умеренное повышение количества всех классов иммуноглобулинов. Избыточное антителообразование приводит к повышению уровня ЦИК. Уровень иммунных комплексов в крови данной категории больных значительно выше, чем в предыдущей группе, что по всей вероятности является следствием длительности антигенной стимуляции недоокисленных продуктов этанола в крови.

Функционирование иммунной системы зависит от влияния и выраженности психоэмоциональных стрессовых факторов, Психологический статус играет решающую роль в устойчивости организма к стрессу. При изучении влияния психоэмоционального напряжения на иммунологические показатели крови студентов в период сдачи экзаменов во время летней экзаменационной сессии установлено увеличение интенсивности фагоцитарного процесса а 2,5 раза по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем, отмечается увеличение числа лейкоцитов в 1 мкл крови абсолютного и относительного количества сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови. Повышение тонуса симпатической нервной системы возбуждает альфа-адренорецепторы, локализованные в органах депо и стимулирует красный костный мозг, обеспечивая ускорение выхода лейкоцитов в кровь.

Установлено, что процесс фагоцитоза зависит от взаимоотношений высших отделов нейроэндокринной регуляции, а также от закономерностей функционирования мембранных систем, участвующих в сохранении гомеостаза. Накопление свободных радикалов, происходящее в ходе ПОЛ или метаболической активации фагоцитов, нарушает нормальное течение процессов окислительного фосфорилирования с нарушением структуры клеточных мембран. В табл. 4 приведены результаты исследования систем ПОЛ и антиоксидантной защиты (АОЗ) в крови потребителей наркотических веществ. Анализ полученных данных показывает, что у больных с опийной наркоманией в период лишения употребления наркотиков достоверно увеличивается содержание в крови продуктов ПОЛ по сравнению с показателями здоровых людей (P<0,01). Статистически выраженное повышение отмечается в разгар абстинентного состояния, удельный вес показателей указанных величин у пациентов более чем в 3 раза выше уровня контроля. Анализ динамики показателей ПОЛ указывает на снижение активности накопления в крови токсичных продуктов кислорода при спаде клинических проявлений болезни, тем не менее цифровые данные остаются выше уровня фона (P<0,05).

Результаты исследования состояния системы АОЗ, предотвращающие образование гидроксильных радикалов, выявили выраженную тенденцию к подавлению активности ферментов. Показатели активности СОД в сыворотке крови наркозависимых больных характеризуются достоверным снижением по сравнению с таковыми у доноров (P<0,001). Существенное подавление активности этого фермента до 2,5 раза отмечается на 3 сут. В дальнейшие сроки исследования отмечена положительная динамика указанных показателей, но величина их на 60% остается ниже уровня фона.

Подавление активности антиоксидантных ферментов может быть причиной неполной нейтрализации перекиси водорода, способствуя развитию затяжного течения абстинентного состояния.

В результате проведенного сравнения с группой больных с алкоголизмом выявлено усиление процесса ПОЛ в период алкогольной интоксикации, хотя напряженность показателей менее выражена, чем у больных с наркоманией. В начальные сроки наблюдения зарегистрировано достоверное повышение (P<0,05) уровня ПОЛ относительно контроля. В последующем напряженность цитоцидной активности мембран, связанная с гиперпродукцией супероксидов снижается, и их величина приближается к уровню фона. Снижение удельного веса МДА на протяжении всего срока сочетается с уменьшением показателей СОД. Анализ активности фермента АОЗ при алкогольной интоксикац...