Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств

Размещено на http://www.allbest.ru/

03.00.06. - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств

Адиева Айна Ахмедовна

Москва 2009

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Алла Александровна Кущ

доктор медицинских наук, профессор Лика Львовна Нисевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Галина Генриховна Миллер

доктор биологических наук профессор Елизавета Ефимовна Брагина

доктор медицинских наук, профессор Святослав Георгиевич Чешик

Ведущая научная организация: НИИ переливания крови Научного гематологического центра РАМН

Защита состоится на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, Бурцева Елена Ивановна доктор медицинских наук

Список использованных сокращений

АГ - антиген

АПФ - аминокислотные производные фуллерена С60

АТ - антитело

БКМ - быстрый культуральный метод

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВКЖ - вируссодержащая культуральная жидкость

ВПР - врожденные пороки развития

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ГВИ - герпесвирусные инфекции

ГЦВ - ганцикловир

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА - индекс авидности

ИППП - инфекции, передаваемые половым путем

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон

МИ - множественность инфицирования

МКА - моноклональные антитела

ОАГА - осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА - поликлональные антитела

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР - IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР - RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени

РИФ (РНИФ) - реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции

УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ - фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ - химиотерапевтический индекс

ЦД - цитотоксическая доза

ЦМВ - цитомегаловирус человека

ЦМВИ - цитомегаловирусная инфекция

ЦНС - центральная нервная система

ЦПД - цитопатическое действие

Общая характеристика работы

цитомегаловирусный противовирусный инфекция

Актуальность проблемы

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий - высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра (увеличение размера, изменение формы), в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008], описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G1 - периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии G2 в М, в точке, обозначаемой как G2/М [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их гибели, а также для выбора адекватной терапевтической тактики новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена С60; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить прямые (ДНК и инфекционная активность) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.

2. Установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.

3. Разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования четырех методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.

4. Установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.

5. Оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.

6. Изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена С60 (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.

7. Изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.

8. Оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.

Научная новизна

1. Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.

2. Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её сравнительное количество.

3. Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни - инфекционно активный ЦМВ.

4. Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена С60 - натриевой соли аминокапроновой кислоты (С60-Na-АКК) и натриевой соли аминомасляной кислоты (С60-Na-АМК); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для С60-Na-АКК равен 260-2600; для С60-Na-АМК - 2500-5450.

5. Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК, при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.

6. Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.

Практическая значимость.

На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авидности анти-ЦМВ.

Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования недоношенных новорожденных с низкой и экстремально низкой массой тела до года.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.

Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент - ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ. Сравнительная оценка различных методов лабораторной диагностики при анализе структуры перинатальной патологии и смерти способствует совершенствованию организации лабораторно-клинического обеспечения мониторинга перинатальных потерь, этиологически связанных с герпесвирусами, а также повышению достоверности оценки их роли в перинатальной патологии и разработке на их основе адекватных лечебных и профилактических мер по снижению удельного веса ВУИ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. - Москва, 2008.

Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова г. Москвы.

Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Маркеры ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных с сочетанной врожденной патологией выявляются существенно чаще, чем у доношенных новорожденных. Недоношенные маловесные новорожденные являются группой риска по развитию ЦМВИ на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.

2. ПЦР in situ - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике герпесвирусных инфекций, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определенным тканям при изучении отпечатков органов. Метод эффективен для диагностики и изучения патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ и ВПГ при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Верификация инфекционных агентов при мертворождении, при выявлении врожденных пороков развития, несовместимых с жизнью, способствует адекватной терапии женщин с мертворождениями в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.

3. Аминокислотные производные фуллерена С60 эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.

4. ЦМВ увеличивает длительность S - периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в S - периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо блокируются в метафазе.

5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических митозов.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены в мат. 5 международной конференции «Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Glasgow, Шотландия, 2000); на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Saariselka, Финляндия, 2008); на 11, 12, 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001, 2002, 2003); на 3 Российском научном форуме “Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии” (Москва, 2001), на 3 Международной конференции “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем” (Махачкала, 2001), на 5 Международной конференции “Фуллерены и атомные кластеры” (С.-Петербург, 2002), на 8 Съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на Международной конференции “Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины” (Москва, 2002), на Российском конгрессе “Генитальные инфекции и патология шейки матки” (Москва, 2004), на 3, 4 Конгрессе педиатров-инфекционистов “Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей” (Москва, 2004, 2005), на 8 Российском Форуме “Мать и дитя” (Москва, 2005), на 10, 11, 13 Конгрессе педиатров России “Актуальные проблемы педиатрии” (Москва, 2006, 2007, 2009), на Международном конгрессе «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Pattaya-Bangkok, Тайланд, 2007), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в ХХI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России “Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики” (Москва, 2007), на III Ежегодном конгрессе и VI Cъезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008).

В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела прикладной вирусологии и иммунологии, Отдела молекулярной вирусологии и лаборатории биохимии института экспериментальной ветеринарии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Учреждения РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 24 сентября 2009 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе 23 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, статей за рубежом - 1, в сборниках международных конгрессов за рубежом - 3, в сборниках материалов международных конгрессов и форумов - 38.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 6-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 273 страницах текста, иллюстрирована 29 таблицами и сколько 38 рисунками. Список цитированной литературы включает 124 отечественных и 325 иностранных источников.

Степень личного участия автора: разработка дизайна исследования беременных женщин, недоношенных новорожденных и материала аутопсии, изучение влияния ЦМВ на пролиферативную активность клеток и антивирусной активности АПФ, организация работы на всех этапах от определения возбудителей ВУИ различными методами до систематизации и анализа, а также статистическая обработка результатов проведены лично автором.

Материалы и методы исследования

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), полученные из лаборатории клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и из Медико-генетического научного центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2мМ L-глутамина, 50мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали референс штамм ЦМВ человека AD 169, любезно предоставленный доктором D. Emanuel (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам IEp72 и рр65. Окрашенные бляшки идентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Пациенты. Объектами исследования были женщины репродуктивного возраста, беременные и новорожденные дети, а также материалы аутопсии различных органов плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни. Объем исследований характеризуют данные таблицы 1. Для обследования пациентов использовали комплекс лабораторных методов: ПЦР (HCMV, HSV, Chlam.trach., Myc. gen.,Ureapl., HPV 16/18, Neis.gon., Trich.vag.); ПЦР real time (HCMV); ПЦР in situ (HCMV; HSV); БКМ (HCMV); РИФ (HCMV, HSV, enterovirus - Коксаки А, Коксаки В 6, 68-71 серотипов, краснуха, вирусы гриппа, парагриппозные вирусы 1-3 серотипов, аденовирусы, Myc. pneum., RSV, Chlam. Pneum.); ИФА; микробиологический посев флоры, патологоанатомические исследования органов и плацент и анализ анамнестических данных матерей умерших детей.

Таблица 1.

	Количество обследованных	Количество анализов
Скрининговое обследование беременных и небеременных женщин в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов	n=3796	n=18675
Исследование материала аутопсии плодов и умерших новорожденных в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов	n=650	n=9750
Исследование плацент	n=181	n=665
Мониторинг включения метаболической терапии (n=260) и Виферона (n=74) в комплексное лечение беременных и небеременных женщин с ОАГА	n=260 n=74	n=5980 n=1314
Комплексное обследование доношенных и недоношенных новорожденных детей (n=204), в динамике до года (n=174)	n=204	n=2850
Исследование материала аутопсии плодов и детей, умерших на первом году жизни на ГВИ	n=135	n=1764

Клинический материал. Объектами исследования у новорожденных служили моча, кровь, слюна и ликвор - по показаниям, в случаях смерти ребенка - отпечатки и лизаты от 3-5 органов. У беременных женщин исследовали кровь, мочу и урогенитальный соскоб. Цельную кровь и мочу центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин. В лунки 24 - луночной панели с клетками ФЛЭЧ вносили по 0,2 мл лейкоцитарной фракции и по 0,2 мл клеток из осадка мочи. Ликвор и слюну разводили в 2 раза средой ИГЛА-МЕМ без сыворотки и вносили в культуру клеток в объеме 0,2 мл.

Выявление возбудителей ВУИ в материале аутопсии. Выявление возбудителей ВУИ в пробах органов погибших плодов и новорожденных, у которых при жизни или при патологоанатомическом исследовании возникло подозрение на врожденную инфекцию, проводили четырьмя методами: иммуноцитохимическим, быстрым культуральным методом (БКМ), ПЦР и ПЦР in situ. Были исследованы материалы аутопсии различных органов (мозга, сердца, легких, печени, почек, селезенки, тимуса, плаценты). Детекцию антигенов Adeno, HRSV, Rub, HSV в мазках - отпечатках органов осуществляли прямым методом иммунофлюоресценции с помощью антител, разработанных в НИИ гриппа РАМН (ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов», Санкт-Петербург). Антигены HSV 1,2 и HCMV определяли с помощью МКА к белкам р72, рр65 и gB HCMV, 4А1 и gB HSV, полученных ранее в лаборатории клеточной инженерии (НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва). Антигены энтеровирусов выявляли в РНИФ с помощью ПКА (ФГУП «ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва).

Быстрый культуральный метод (БКМ). Для определения инфекционной активности ЦМВ в клиническом материале использовали количественный вариант БКМ, который проводили согласно Методическим рекомендациям Роспотребнадзора №02.030-08 [Москва, 2008]. Клетки ФЛЭЧ высаживали в 24-луночные панели в концентрации 250 тыс. клеток в 1 мл. В культуру вносили клинический материал и проводили совместное центрифугирование клеток ФЛЭЧ с клиническими образцами в течение 35 мин. при 2500 об./мин. После отмывки вносили среду поддержки - среду Игла-МЕМ с 2% ЭТС. Через 24 часа клетки фиксировали в холодном ацетоне - 10 минут для проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции, либо в охлажденном метаноле (-200С) в течение 20 минут для реакции иммунопероксидазного окрашивания. Для обнаружения ЦМВ использовали МКА к белкам ЦМВ [Макарова и др., 1994]. Выявляющими антителами служили антимышиные антитела, коньюгированные с FITC или конъюгированные с пероксидазой хрена. Подсчет окрашенных клеток проводили на 2,5х105 клеток ФЛЭЧ. Положительные результаты представляли в количестве вирусных частиц (в.ч.) на 0,2 мл клинического материала. Чувствительность БКМ соответствовала активности 5 вирусных частиц в 1 мл [Адиева и др., 2008].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК производили с помощью сертифицированных коммерческих наборов «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В», «ДНК-сорб-С» и «Реамикс» согласно инструкции фирмы-производителя. ПЦР в качественном варианте проводили с помощью коммерческих наборов ООО НПФ "Гентех» и ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора согласно инструкции фирмы-производителя. Исследование аутопсийного материала проводили с помощью модифицированного совместно с НПФ “Литех” nested варианта ПЦР. Чувствительность определения ДНК составила 103 молекул вирусной ДНК в 1 мл.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР real time). ДНК ЦМВ из лизированных клеток выделяли с помощью «ДНК-сорб-АМ» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. ПЦР - амплификацию проводили с применением набора реагентов для выявления ДНК цитомегаловируса человека (HCMV) в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно - флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® CMV-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Детекцию продуктов ПЦР - амплификации в количественном варианте осуществляли при помощи прибора «iQ iCycler» (Bio-Rad, США), согласно рекомендации производителя тест-систем.

Полимеразная цепная реакция in situ (ПЦР in situ). Метод ПЦР in situ был модифицирован и использован для анализа фиксированных препаратов-отпечатков аутопсийного материала и препаратов монослойных культур клеток. Препараты готовились на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond). В качестве положительных контролей использовали зараженные клетки ФЛЭЧ и Vero. В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ и к консервативному сверхраннему региону ЦМВ. Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ и ЦМВ, наблюдались темно-коричневые точки - метки на поверхности или внутри клеток. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител к ЦМВ классов M и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА), используя коммерческие тест-системы НПО «Диагностические системы» (Нижний Новгород). Для выявления антител класса IgM использовали тест-систему «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», для выявления антител класса IgG «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G. Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Авидность антител. Индекс авидности (ИА) специфических IgG к ЦМВ в сыворотке крови определяли с помощью тест-систем «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G Авидность» (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород). Оценку результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (Рниф). Клетки ФЛЭЧ, неинфицированные и инфицированные ЦМВ, промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4 и фиксировали. Использовали различные способы фиксации в зависимости от поставленных задач. Для анализа препаратов при пероксидазном окрашивании - абсолютным метанолом фиксировали 10 мин при -20єС; охлажденным ацетоном для Рниф - 10 мин при +4єС; для анализа морфологии клеток 3% параформальдегидом на фосфатном буфере 15 мин при комнатной температуре с последующей обработкой 0,1% раствором Тритона Х-100 на буфере PBS в течение 8 мин.

На фиксированные препараты наносили очищенные моноклональные антитела (МКА) и инкубировали в течение 1 часа при 370С. Затем клетки промывали буфером PBS и инкубировали с антителами, конъюгированными с флуорохромом ФИТЦ в течение 30 минут при 370С, с пероксидазой хрена - в течение 1 часа при 370С (DakoCytomation, Дания). Для окраски хроматина ядер использовали флуорохром DAPI в концентрации 1мкг/мл. После окраски стекла заключали в глицерин или в мовиол. Препараты анализировали с помощью флюоресцентного/светового микроскопа Olympus BX - 51 (Япония), оснащенного объективами 4х, 10х, 40х и цифровой камерой Olympus U-CMAD3.

Интерфероновый статус. Изучение интерферонового статуса проводили в лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерферона НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (заведующая лабораторией - д.б.н., проф. В.В. Малиновская). Концентрации альфа-ИФН и гамма-ИФН определяли методом твердофазного ИФА. Для альфа-ИФН использовали тест-систему производства ООО «Протеиновый контур» (С.-Петербург, Россия), для тестирования гамма-ИФН применяли набор реагентов Biosource IFN? (Бельгия). В качестве индукторов использовали: для альфа-ИФН - вирус болезни Ньюкасла (ВБН), для гамма-ИФН - ФГА. Чувствительность тест-систем для иммуноферментного определения альфа-ИФН составляла 5 пкг/мл, для определения гамма-ИФН - 3 пкг/мл.

Определение цитотоксичности производных фуллерена. Цитотоксичность определяли по влиянию на жизнеспособность клеток ФЛЭЧ, которую оценивали методом исключения витального красителя трипанового синего. Цитотоксичность (ЦД) характеризовали как концентрацию каждого из тестируемых соединений, вызывающую гибель подавляющего большинства клеток или 50% клеток в популяции (ЦД95 и ЦД50, соответственно) на 4-е сутки после внесения АПФ - так называемая хроническая цитотоксичность или (ЦД50). Определяли также концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток в течение 24 часов, соответствующую острой цитотоксичности (ОЦД50).

Пролиферативная активность клеток ФЛЭЧ в присутствии АПФ. Влияние АПФ на репликацию ДНК ФЛЭЧ анализировали методом радиоавтографии. Клетки ФЛЭЧ вносили в 24-луночные панели в низкой концентрации (6х104кл./мл). На следующий день после посадки вносили АПФ в различных концентрациях. Через 24, 48 и 72 часа инкубации вносили в культуральную жидкость радиоактивно меченый тимидин (3Н-ТД). За 50%-ую ингибирующую дозу (ИД50) принимали концентрацию препарата, вызывающую 50% подавление включения радиоактивного тимидина в ДНК клеток.

Определение антивирусной активности АПФ. Для определения анти-ЦМВ активности использовали три схемы воздействия АПФ: лечебную, профилактическую и вирулицидную.

Лечебная схема. Монослой клеток заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. - 0,001 БОЕ/кл). После адсорбции в течение 1 часа при 37?С дважды промывали и вносили поддерживающую среду, содержащую 2% сыворотки и аминопроизводные фуллерена в различных концентрациях.

Профилактическая схема. На клеточный монослой вносили среду поддержки, содержащую АПФ в различных концентрациях, и инкубировали в течение 24 часов. После обработки клетки дважды промывали и заражали вирусом с различной множественностью инфицирования (1,0 БОЕ/кл. - 0,001 БОЕ/кл) в течение 1 часа при 370С. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Вирулицидная схема. Вирус с МИ 0,01 БОЕ/кл инкубировали совместно с АПФ в различных концентрациях в течение 1 часа при 370С. Затем вирус, инкубированный с АПФ, наносили на монослой клеток и выдерживали в течение 1 часа. Монослой клеток дважды промывали и вносили среду поддержки.

Антивирусную активность во всех схемах оценивали по способности ЦМВ к бляшкообразованию и по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Концентрацию вещества, вызывающую подавление ЦПД вируса на 50% по отношению к контролю, принимали за 50%-ую эффективную дозу (ЭД50). Химиотерапевтический индекс (ХТИ), или индекс селективности (ИС), рассчитывали как отношение концентрации препарата, вызывающей клеточную деструкцию (ЦД50) или снижающую синтез клеточной ДНК на 50% (ИД50), к концентрации, вызывающей 50% антивирусный эффект (ЭД50).

Определение продукции инфекционно активного вируса. Для определения влияния АПФ на репродукцию ЦМВ клетки заражали вирусом с МИ 0,1 БОЕ/кл. и 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вносили АПФ в различных концентрациях. При развитии в контроле (без АПФ) 100%-ого ЦПД отбирали культуральную среду из опытных и контрольных культур и заражали неинфицированные клетки ФЛЭЧ, которые культивировали в среде Игла с 2% сыворотки без АПФ. Об активности урожая вируса судили по цитопатогенному действию в динамике инфекционного процесса.

Изучение динамики накопления ДНК ЦМВ методом ПЦР в реальном времени. Монослой ФЛЭЧ заражали ЦМВ с МИ 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса вносили изучаемые вещества в соответствующей концентрации. На 4, 7 и 10-е сутки клетки промывали 0,1М фосфатно-солевым буфером и обрабатывали трипсином. Осадок клеток обрабатывали лизирующим буферным раствором и исследовали методом ПЦР real-time.

Радиоавтография. В клетки ФЛЭЧ, выращенные на покровных стеклах в 24- луночных панелях, вносили радиоактивно меченый 3Н-ТД на 1 час в концентрации 1 мкКю/мл для включения в реплицирующуюся ДНК. Фиксацию проводили через различные интервалы времени смесью этилового спирта и концентрированной уксусной кислоты в соотношении 3:1 в течение 40 минут. Затем стекла с клетками обрабатывали холодной 5% трихлоруксусной кислотой 3 раза в течение 5-10 минут для удаления невключившегося предшественника и промывали водой. После высушивания на воздухе покровные стекла монтировали на предметные стекла клетками вверх. Все препараты с радиоактивной меткой покрывали фотоэмульсией типа М (НИИ химфотопроект, Москва) и экспонировали в течение 6-7 дней в темноте. Проявляли амидоловым проявителем и окрашивали гематоксилином Карацци.

Статистическая обработка. Для статистической обработки полученных результатов использован ПК и пакет прикладных программ Statistika V6.0.

Результаты исследования и их обсуждение

Для оценки факторов риска внутриутробного инфицирования большое значение имеет состояние здоровья матери. Мы провели ретроспективный анализ анамнестических данных 658 матерей умерших (плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни). Было отмечено, что только 35% матерей умерших считали себя практически здоровыми. Даже среди матерей до 20 лет, где были и подростки, здоровых было только 51,2%. С увеличением возраста матерей количество здоровых снижалось, и уже в возрасте от 25 до 30 лет их оказалось достоверно меньше (40%; р <0,001), чем среди молодых матерей, а среди женщин старше 30 лет здоровыми себя считали только 20,9%. Подавляющее большинство имели те или иные хронические болезни, среди которых наиболее частыми были болезни мочеполовой системы.

У матерей умерших был отмечен и отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (ОАГА). В анамнезе у женщин было отмечено большое количество искусственного прерывания беременности. Даже у женщин до 20 лет их количество составило 12,8%. С увеличением возраста женщин количество медабортов значительно увеличивалось, и у женщин старше 30 лет их количество достигло 69,6% (нередко не по одному разу). Кроме искусственного прерывания беременности в анамнезе отмечались выкидыши, мертворождения, замершая беременность, смерть ребенка в раннем неонатальном периоде, в том числе и у женщин моложе 20 лет. Настоящая беременность и роды независимо от возраста практически у всех протекали с обострением хронических болезней, с острыми респираторными заболеваниями (иногда по несколько раз), с различными осложнениями (анемия, угроза прерывания часто на протяжении всей беременности, маловодие, многоводие, длительный безводный промежуток, слабость родовой деятельности, стремительные роды), которые могли стать причиной острой или хронической гипоксии плода. В подавляющем большинстве случаев женщины не проходили предгравидарную подготовку.

Активная ЦМВИ у беременных по данным серологического анализа имела место в 30% случаев смерти ребенка. Рецидивы кожной формы простого герпеса были зарегистрированы у 60,7% беременных женщин.

Скрининговое вирусологическое исследование 3796 небеременных и беременных женщин выявило в подавляющем большинстве случаев смешанную инфекцию. Энтеровирусы в популяции были выявлены от 34,6% до 90% случаев (в том числе, антигены Коксаки А - в 34,6% случаев, Коксаки В - в 38% случаев), вирус краснухи был обнаружен у 19-23% обследованных. Частота определения антигенов ВПГ составила 11-13%. В 7,8% случаев в обеих группах была выявлена папиломавирусная инфекция, ВПЧ преимущественно 16 типа. Важно отметить, что ЦМВ был обнаружен в 19,1% случаев у небеременных женщин и статистически значимо чаще (26,2%; р=0,001) - у беременных женщин.

Таким образом, ухудшающееся состояние здоровья женщин и инфекционные заболевания, в числе которых ЦМВИ занимает существенное место, являются фактором риска перинатального инфицирования плода, патологии и смерти в перинатальном и младенческом возрасте.

Разработка алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с осложненным течением раннего неонатального периода

Недоношенные новорожденные дети представляют особую группу риска по развитию внутриутробной ЦМВИ, однако до настоящего времени нет общепринятого алгоритма диагностики ЦМВИ у новорожденных детей с признаками ВУИ. В связи с этим были обследованы 204 новорожденных ребенка, родившихся в ГБ №8 Департамента здравоохранения города Москвы. Обследованные дети были разделены на 4 группы: первую группу (группа 1) составили недоношенные новорожденные дети (n=107) c гестационным возрастом (ГВ) 29,8±2,8 недель с клиническими признаками ВУИ. Во 2-ю группу были включены недоношенные новорожденные дети без клинических признаков ВУИ (18 детей, ГВ - 34,6±1,2 недель). Контрольную группу (группа 3) составили доношенные новорожденные дети без признаков ВУИ (32 ребенка, ГВ - 38,9±0,8 недель). Отдельную группу (группа 4) составили 47 детей с признаками ВУИ, первично обследованных в возрасте 1-3 месяцев.

Проведен анализ частоты выявления ЦМВ у детей на первой неделе жизни. Ребенка рассматривали как инфицированного, если маркеры ЦМВИ были обнаружены, по крайней мере, в одном из полученных от него образцов клинического материала. Данные по частоте выявления маркеров ЦМВИ приведены в таблице 2. Анализ показал, что ДНК ЦМВ была выявлена во всех группах, в том числе доношенных и недоношенных новорожденных без признаков ВУИ. Наиболее часто ДНК ЦМВ выявлялась в 4-й группе, даже значительно чаще (р <0,001), чем у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни.

Таблица 2. Выявление прямых маркеров ЦМВИ у новорожденных детей.

Группы детей	ДНК (ПЦР)	Инфекционная активность (БКМ)
группа 1 (основная) недоношенные с ВУИ	15,9% (17/107)	16,8% (18/107)
группа 2 (сравнения) недоношенные без ВУИ	5,6% (1/18)	0% (0/18)
группа 3 (контрольная) доношенные	6,3% (2/32)	0% (0/32)
группа 4 (дополнительная)	46,8% (22/47)	29,7% (14/47)

Инфекционно активный вирус был выявлен только у детей с ВУИ и ни в одном случае во 2 и 3 группах. Более частое выявление ДНК и инфекционно активного вируса в 4 группе может свидетельствовать об обострении врожденной инфекции или о постнатальном инфицировании.

Если учитывать результаты обследования двумя методами, то ДНК и/или инфекционно активный вирус у новорожденных с ВУИ, обследованных на первой неделе жизни был выявлен у 28 из 107 обследованных (26,2%), то есть на 9-10% чаще, чем каждым методом отдельно. Таким образом, обследование двумя метода повышает эффективность лабораторной диагностики.

При анализе выявления маркеров ЦМВИ в различных биологических средах было установлено, что наиболее часто инфекционно активный ЦМВ выявлялся в моче (14,5%), а в крови только в 1% случаев. ДНК ЦМВ в моче выявлялась в 18,7%, и несколько реже - в крови 13,3%. Суммарно тем или другим методом в моче ЦМВ обнаружен в 41% случаев, в слюне - в 27%, в крови и в ликворе у 14-18% детей с признаками ВУИ. Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые показали, что в моче ЦМВ обнаруживается в количествах в 180 раз больших, чем в крови [Halwachs-Baumann G., 2002]. В целом ДНК ЦМВ выявлялся в 85 из 710 проб (12,1%), а инфекционно активный вирус в 52 из 710 проб (7,3%), то есть достоверно чаще (р=0,003).

Представляло интерес выяснить вирусную нагрузку в клинических материалах от обследованных детей. Данные количественного изучения ЦМВ во всех положительных образцах показали, большая часть образцов, в которых был обнаружен инфекционно активный ЦМВ, содержали 10-50 вирусных частиц, максимальные значения достигали 5000 вирусных частиц, что свидетельствует о большей вирусной нагрузке при инфицировании недоношенных новорожденных детей. Сходная тенденция была выявлена в результате анализа ДНК. Результаты показали, что в группе детей с признаками ВУИ вирусная нагрузка и инфекционная активность ЦМВ достоверно выше по сравнению с контрольной группой. Прямая корреляция между величиной вирусной нагрузки и интенсивностью клинических симптомов при врожденной ЦМВИ была недавно констатирована в работе исследователей США [Arav-Boger R., Pass R., 2007].

Для выяснения связи между данными БКМ и ПЦР был проведен анализ относительного количества ДНК в клинических образцах методом ПЦР - RT. Вычисляли значение порогового цикла Ct для каждого образца путем определения точки, при которой флюоресценция превышала фоновое значение. Сравнивали результаты для проб, в которых БКМ была обнаружена инфекционная активность ЦМВ, с результатами для проб, отрицательных по БКМ. Статистическая обработка показала, что в образцах, положительных по данным БКМ, вирусная нагрузка была достоверно выше, чем в пробах, отрицательных по результатам БКМ. Данные настоящей работы совпадают с результатами исследователей, изучавших прямые маркеры герпесвирусных инфекций методами ПЦР - RT и БКМ [J.van Doornum G., 2003].

Изучение показателей специфического гуморального иммунитета у новорожденных детей (выявление антител классов IgG и IgM и определение индекса авидности специфических антител) представлено в таблице №3.

Таблица 3. Результаты обследования новорожденных детей с помощью серологических методов

Группы детей	Выявление анти-ЦМВ IgM-АТ	Отсутствие анти-ЦМВ IgG-АТ	Авидность анти-ЦМВ-IgG-АТ (ИА)
			<0,6	>0,6
1-я (основная)	0,93% (1/107)	8,4% (9/107)	38,6% (32/83*)	61,4% (51/83*)
2-я (сравнения)	0% (0/18)	16,7% (3/18)	33,3% (5/15*)	66,7% (10/15*)
3-я (контрольная)	0% (0/32)	9,4% (3/32)	13,8% (4/29*)	86,2% (25/29*)
4-я (дополнительная)	23,4% (11/47)	19,1% (9/47)	33,3% (12/36*)	66,7% (24/36*)

* авидность IgG определяли только у детей, у которых было достаточно материала и в сыворотках крови которых были выявлены АТ к ЦМВ класса IgG;

Анализ показал, что у подавляющего большинства детей всех групп присутствовали антитела класса IgG. У 1 ребенка из основной группы на первой неделе жизни были идентифицированы маркеры острого инфекционного процесса - анти-ЦМВ-IgM. Невысокая частота выявления анти-ЦМВ-АТ класса IgM у новорожденных детей отмечалась и другими авторами [Nelson et.al., 1997]. В 4-й группе (впервые обследованные в 1-3 мес.) показатель частоты выявления анти-ЦМВ IgM составил 23,4% (р<0,001). Важно отметить, что у 9 из 11 детей с анти-ЦМВ-IgM антитела класса G отсутствовали, но были выявлены ДНК и инфекционно активный вирус.

Оценка авидности IgG-АТ показала, что у большинства обследованных были выявлены высокоавидные АТ. Антитела с низким или промежуточным значением ИА выявлялись практически с одинаковой частотой у детей с ВУИ и в группе сравнения. В контрольной группе была отмечена наиболее низкая частота выявления низкоавидных антител (13,8%; р=0,026). Необходимо отметить, что у 65,4% детей с ВУИ, в крови которых АТ класса IgG отсутствовали, либо обладали ИА<0,6, были выявлены прямые маркеры ЦМВ.

При количественном анализе IgG анти-ЦМВ антител в группе детей с признаками инфицирования (группа 1 и 4) выявлялись антитела с низкой концентрацией достоверно чаще, чем в группах без ВУИ (p<0,05).

Анализ прямых и непрямых маркеров ЦМВИ (рис. 1) при оценке риска развития инфекционного процесса у новорожденных детей показал, что в группе инфицированных детей ДНК и инфекционная активность вируса выявляются в больших количествах, антитела IgG - в низкой концентрации и с низким индексом авидности.

Рис. 1. Частота выявления прямых и непрямых маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных

У детей без признаков инфицирования инфекционный вирус не выявляется, ДНК вируса обнаруживается в низких количествах и в небольшом проценте случаев (5-6%). IgG антитела характеризуются высокой концентрацией и ИА>60. Наличие низких концентраций материнских типоспецифических нейтрализующих антител у новорожденных детей увеличивает риск постнатального инфицирования ребенка [Hill J. and Roberts S., 2005]. Надо учитывать, что у недоношенных новорожденных детей доля антител, обладающих нейтрализующими свойствами, зависит от гестационного возраста. Так, только к 34-й неделе гестации 99% нейтрализующих материнских антител обнаруживаются в периферической крови плода [Karen et.al., 2006]. Это указывает на то, что специфическая диагностика ЦМВИ при оценке риска развития активного инфекционного процесса у новорожденных детей, особенно у недоношенных, требует использования комплекса лабораторных методов.

Изучение маркеров в динамике показало, что через 1-3 месяца после рождения у 19,2%, отрицательных при первичном обследовании, вирус был обнаружен впервые, через 4-7 мес. еще у 11,5% детей, отрицательных по ЦМВ при рождении впервые появились прямые маркеры ЦМВИ. Эти данные свидетельствуют о том, что для достоверной диагностики ЦМВИ необходимо неоднократное обследование.

Таким образом, на первом году жизни у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками ВУИ в 65,4% случаев на разных сроках были выявлены прямые маркеры ЦМВИ, что согласуется с результатами других исследований [Maschmann et.al., 2001; Меджидова и др., 2005], подтверждающими высокий риск развития ЦМВИ у этой группы новорожденных детей. Следует отметить, что в целом при повторных исследованиях количество вирусной нагрузки увеличивалось. Это может быть связано с инфицированием в неонатальном периоде при вскармливании грудным молоком [Lawrence et.al, 2006], а также с отсроченным проявлением внутриутробной бессимптомной ЦМВИ, которое отмечалось рядом авторов [Barbi et.al., 2003; Maligner et.al., 2003].

Частота выявления серологических показателей и вирусных маркеров в динамике проведено у 75 недоношенных детей с ВУИ из 1-й группы (рис.2).

Рис. 2. Динамика выявления серологических маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей.

Изучение маркеров в динамике показало прямую корреляцию между обнаружением или отсутствием ЦМВ и серологическими показателями. При активации ЦМВИ в 68,4% случаев при повторном исследовании происходило либо выведение высокоавидных (по всей видимости, материнских IgG-АТ), либо появление собственных низкоавидных IgG-АТ с ИА<0,6 (52,6%), либо резкое снижение активности IgG-АТ и выявление анти-ЦМВ IgM (15,8%). Это и могло служить основной причиной обнаружения ЦМВ в клинических материалах и развития ЦМВИ при последующих исследованиях. В 75% случаев элиминация вируса сопровождалась появлением собственных анти-ЦМВ IgG или сменой низкоавидных IgG-АТ (50%) на высокоавидные или повышением активности IgG антител в несколько раз (25%). Известно, что низкоавидные антитела циркулируют в периферической крови приблизительно в течение 20 недель после первичной инфекции, затем авидность IgG-АТ увеличивается и остается высокой в течение всей жизни [Lazzarotto T., 2008]. За время проведения исследования в 1-й группе отмечены 12 летальных исходов (11,2%); при этом у 7 из 12 детей (58,3%) были выявлены прямые маркеры ЦМВИ. В контрольной группе летальных исходов не было.

Для анализа частоты выявления ЦМВИ в различных органах было исследовано 147 органов от 47 мертворожденных и 252 органа от 88 умерших, умерших на первом году жизни и (таблица 4). Патологоанатомические исследования проводились сотрудниками кафедры патологической анатомии (зав. кафедрой - д.м.н., проф. Талалаев А.Г.).

Таблица 4. Выявление ЦМВ в различных органах у мертворожденных и детей, умерших в течение первого года жизни

Изученные органы	Мертворожденные	Дети, умершие на первом году жизни
	Общее число проб (n)	Число положительных проб, (%)	Р	Общее число проб (n)	Число положительных проб, (%)
мозг	41	9 (21,9%)	р=0,33	61	20 (32,8%)
печень	37	7 (18,9%)	р<0,02	55	25 (45,5%)
легкое	33	5 (15,2%)	р<0,0001	48	44 (91,6%)
почка	27	7 (25,9%)	р<0,03	43	24 (55,8%)
сердце	9	1 (11,1%)	р=0,87	45	9 (20,0%)
Всего	147	29 (19,7%)	р<0,0001	252	122 (48,4%)

При патологоанатомическом исследовании у умерших были выявлены признаки врожденной генерализованной вирусной инфекции, которая проявлялась как различными воспалительными изменениями (менингит, энцефалит, гепатит, миокардит, пневмония и др.), так и фетодиспластическими изменениями и/или с пороками развития органов. Анализ показал, что ЦМВ выявляется практически во всех исследованных органах: легкие, сердце, печень, почки, мозг. При этом в материалах аутопсии обнаружен как ДНК вируса (ПЦР), так и антигены (РНИФ) и инфекционно активный ЦМВ (БКМ).

В целом у умерших на первом году жизни маркеры ЦМВ обнаруживались значительно чаще, чем у мертворожденных (48,4% против 19,7%, р<0,0001). Необходимо отметить, что в группе детей, умерших на первом году жизни, инфекционно активный ЦМВ определялся значительно чаще, чем у мертворожденных (р<0,05).

Если говорить о суммарном выявлении прямых маркеров ЦМВИ хотя бы одним из методов в любом из исследованных органов, то в группе детей, умерших на первом году жизни ЦМВ был обнаружен в 61,5% случаев, в случаях мертворождения - в 35,4% случаев.

Более частое выявление ЦМВ в материалах детей, умерших на первом году жизни, может свидетельствовать о реактивации врожденной инфекции (учитывая положительные результаты быстрого культурального метода, который позволяет выявить инфекционно активный вирус). Но при этом нельзя исключить и факт постнатального инфицирования. Одной из причин этого может быть иммунодефицитное состояние в группе детей высокого риска. Как показало исследование отпечатков тимуса 60 умерших детей, у 48 (80%) были выявлены антигены различных вирусов. При патологоанатомическом исследовании в 8% случаев был поставлен диагноз врожденного неклассифицированного иммунодефицита (в 65,7% случаев на фоне врожденной вирусной инфекции), что позволяет предположить ее участие в развитии иммунодефицита и наоборот: активацию инфекционного процесса на фоне иммунодефицита.

...