Иммунологическая реактивность при экспериментальном воздействии лазерной гипертермии с наночастицами на опухолевые ткани

Конъюгаты интерлейкина с золотыми наночастицами вызывают отклик иммунной системы, но наблюдается запаздывание иммунного ответа на 48-72 часа по сравнению с откликом на исходный не конъюгированный препарат интерлейкина-2. Кроме того, наблюдался и побочный эффект от введения конъюгатов интерлейкина с золотыми наночастицами, выразившийся в увеличении количества тромбоцитов в крови.

Биологические и биофизические эффекты экспериментальной лазерной гипертермии тканей животных с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц для фототермического воздействия на ткани экспериментальных животных имеет два основных аспекта: (1) - биоспецифическое «нацеливание» на определенные ткани или клетки и (2) - оптический плазмонный резонанс. При облучении наночастиц, локализованных в биологических тканях, лазерным излучением с длиной волны в области полосы поглощения происходит нагрев частиц и окружающих их клеток.

В настоящей работе на основе компьютерного моделирования проведены оценки пространственного распределения интенсивности поглощенного лазерного излучения в образцах биологических тканей, содержащих плазмонно-резонансные наночастицы, и получены оценки температурных эффектов, возникающих при различных режимах лазерного воздействия. В экспериментах на тестовых объектах измерено пространственное распределение повышения температуры в зависимости от концентрации наночастиц и времени лазерного воздействия.

Исследования на тестовых объектах в сочетании с компьютерным моделированием были необходимы для определения распределения температуры по глубине тканей на основе данных термографического исследования поверхности. Экспериментальные исследования, проведенные в работе, показали, что при концентрации частиц 5·10⁹ см^-3 прогревается не весь освещаемый лазерным излучением объем, а только его поверхностный слой, толщина которого не превышает 5-7 мм. При уменьшении концентрации частиц в 4 раза глубина нагрева увеличивается в 2 раза, однако снижается максимально достигаемая температура. При концентрации частиц 5·10⁹ см^-3 повышение температуры раствора наночастиц составляет 40C, а при 16-ти кратном разведении - 18C. Данный эффект ограничивает оптимальный диапазон концентраций частиц в тех случаях, когда требуется одновременный равномерный прогрев тканей объемом более 1см³.

Исследование температурной кинетики золотых наночастиц при лазерном облучении выявило нелинейность скорости повышения температуры. Как установлено нами, скорость нагрева определяется главным образом концентрацией наночастиц и в меньшей степени мощностью используемого излучения. Наиболее быстрый нагрев происходит за первые 100 секунд лазерного воздействия, а затем температура достигает насыщения. Снижение температуры после прекращения лазерного воздействия происходит в несколько раз медленнее, чем нагрев, и не зависит от концентрации наночастиц. Данный эффект приводит к тому, что реальное время нагрева может значительно превышать длительность непосредственного лазерного облучения.

Выявлено, что лазерная гипертермия с золотыми наночастицами in vivo обладает определенной спецификой. Для её объяснения необходимо прежде всего принимать во внимание эффектны терморегуляции, обусловленные локальным повышением перфузии крови и индуцированные лазерным излучением морфологические изменения тканей животного. При гипертермии опухолевых тканей существенное значение имеет максимально быстрое повышение температуры до заданного диапазона. Золотые наночастицы при этом позволяют значительно увеличить скорость нагрева. В настоящей диссертационной работе статистически значимо доказано, что при использовании плазмонно-резонансных наночастиц для лазерной гипертермии биотканей достигается повышение скорости нагрева в 10 раз.

Автором разработана методика проведения термографических исследований при лазерной гипертермии опухолей у животных, на основе специально разработанной компьютерной программы проведен статистический анализ температурного распределения нормальных и патологически изменённых тканей. Получены экспериментальные двумерные распределения поверхностной температуры при различной глубине инъекции наночастиц лабораторным животным. Исследована динамика лазерной гипертермии при непрерывном и импульсном режимах воздействия. Отчетливо продемонстрировано проявление компенсаторных реакций организма в результате повышении скорости нагрева тканей.

Биологические эффекты, возникающие при лазерной гипертермии тканей животных, определяются не только абсолютными величинами повышения температуры, но и длительностью воздействия и временными характеристиками нагрева. Нагрев опухолевых тканей до 46-60⁰С градусов сдерживает их пролиферацию и предположительно может стимулировать процессы апоптоза. Без наночастиц достичь указанного температурного диапазона удается за 5 минут, а при их использовании - за 30 секунд. Следует отметить такую особенность лазерной гипертермии с наночастицами in vivo, как первоначальное повышение температуры на 1-3 градуса выше устанавливающегося впоследствии стационарного значения температуры (рис. 9).

Рис. 9. Динамика нагрева тканей кожи крысы при непрерывном (,_) и импульсном (^, ) лазерном облучении. Обозначения:1, 3 - без наночастиц; 2, 4 - с наночастицами. Выходная мощность лазера в непрерывном режиме 2 Вт, расстояние от торца волокна до поверхности кожи 2 см, средняя плотность мощности 2 Вт/см², скважность в импульсном режиме ј, длительность импульса 1 мсек, пиковая мощность 4 Вт.

Нами сопоставлены возникающие в биологических тканях изменения, определяемых методами гистологического анализа с термограммами, измеренными на поверхности их локальных участков непосредственно после лазерного воздействия при разных способах введения золотых наночастиц. При этом показано, что проведение лазерного термолиза с использованием наночастиц, локализованных на глубине до 5-7 мм в биологических тканях, в частности, в коже и скелетных мышцах, позволяет селективно нагревать заданные участки в области локализации частиц без разрушения близлежащих тканей (рис.10).

Рис 10. Локальное повышение температуры и соответствующие морфологические изменения тканей экспериментальных животных при лазерном воздействии с золотыми наночастицами в непрерывном режиме с выходной мощностью 2,5 Вт, длительностью 30 сек. А - препарат кожи крысы до воздействия. Б - термограмма поверхности соответствующего участка кожи при подкожном введении золотых наночастиц. В - препарат кожи крысы после подкожного введения наночастиц и лазерного воздействия. Г - препарат скелетной мышечной ткани крысы до воздействия. Д - термограмма поверхности соответствующего участка кожи крысы при внутримышечном введении золотых наночастиц. Е - препарат скелетной мышечной ткани крысы после лазерного воздействия с наночастицами. Окр. гематоксилин-эозин. (Ув. х200).

В работе исследованы патоморфологические изменения тканей под воздействием лазерного излучения с использованием золотых наночастиц в качестве селективного поглотителя и иммуномодулирующие эффекты, возникающие при этом у экспериментальных животных с перевитыми и спонтанными опухолями. Накопление наночастиц в опухолевой ткани приводит к селективному нагреву в области их локализации. Как показывают результаты термографических измерений, пассивное накопление золотых наночастиц при внутривенном введении оказывается достаточным для того, чтобы температура поверхности опухолевой ткани при лазерной гипертермии была выше температуры окружающих здоровых тканей. При плотности мощности лазерного излучения 2 Вт/см² температура на поверхности здоровой ткани повышалась на 5⁰С, а опухолевой на 10⁰С.

Такое повышение температуры наблюдалось при лазерном воздействии через 30 минут после внутривенного введения частиц, что коррелирует с первым пиком насыщения опухолевой ткани золотыми наночастицами вследствие ее повышенной васкуляризации, который приходится на временной промежуток от 30 до 60 минут после внутривенного введения. Повышение температуры при интерстициальном введении наночастиц в опухоль выражено значительнее, чем при внутривенном введении, поскольку такое введение позволяет достичь более высокой локальной концентрации наночастиц. Максимальная температура поверхности кожи над опухолью при той же плотности мощности лазерного излучения при интерстициальном введении достигает 56^оС.

Установлено, что использование наночастиц при лазерной гипертермии позволяет повысить стабильность требуемого температурного режима, при котором диапазон колебания температуры не превышает одного градуса. После лазерной гипертермии с интерстициальным введением золотых наночастиц в эпидермисе кожи над опухолью наблюдается незначительная дистрофия, в кровеносных сосудах выражена сепарация крови и плазма вакуолизирована. В дерме наблюдается лимфоидная инфильтрация, набухшие волокна с признаками отека. В ткани опухоли (рис. 11-Б) имеются достаточно обширные некрозы лентовидной формы. В области некроза клетки опухоли отсутствуют, имеются бесструктурные эозинофильные массы с полиморфноклеточной воспалительной реакцией и множество апоптозных телец. Определение степени выраженности апоптотических процессов до и после лазерного воздействия осуществлялось с помощью иммуноцитохимических и иммуногистохимических исследований с использованием маркера Bcl-2. Полученные результаты показывают, что маркер Bcl-2 лучше использовать при лимфоидной инфильтрации опухоли, или для определения перифокального воспаления после термического воздействия на опухолевые ткани.

А Б

Рис. 11. А - препарат опухолевой ткани подкожно трансплантированного рака почки у крысы, Б - препарат опухолевой ткани с интерстициальным введением золотых нанооболочек после лазерного воздействия, окраска гематоксилин-эозин, ув. х150.

Лазерная гипертермия перевитых опухолей при внутривенном введении наночастиц приводит к уменьшению размера опухоли в среднем на 25% и средней задержке роста опухоли на 7 дней, а при интерстициальном введении наночастиц отмечалось уменьшение размера опухоли в среднем на 50% и задержка роста на 10 дней (рис. 12).

В группе животных, подвергшихся лазерному воздействию без наночастиц, с температурой нагрева в диапазоне 40-42^оС, отмечалось незначительное ускорение роста опухоли по сравнению с контрольной группой. Продолжительность жизни животных указанной группы была ниже, чем в контрольной.

Рис. 12. Динамика роста подкожно трансплантированного рака почки крыс (РА) до и после лазерной гипертермии. _- контрольная группа без воздействия, ¦- группа с лазерным нагревом без наночастиц, ^- группа с лазерным воздействием после внутривенного введения наночастиц, - группа с лазерным воздействием после интерстициального введения наночастиц.

В исследовании проанализировано состояние иммунологической реактивности экспериментальных животных при экспериментальной локальной лазерной гипертермии. Поскольку среди спонтанных опухолей у изученных нами животных наиболее часто встречаются поверхностно расположенные опухоли эпителиальной тканевой природы, а лазерная гипертермия является методом наиболее целесообразным для воздействия на поверхностно расположенные ткани, в настоящем исследовании более детально рассматриваются эпителиальные опухоли и меланома слизистой оболочки ротовой полости.

Локальная гипертермия, в отличие от общей, стимулирует различные звенья иммунной системы организма. В то же время сильная термическая травма, равно как и хирургическая, может вызывать супрессию клеточного иммунитета (Munford R.S., Pugin J., 2001). В работе A. Szasz и G. Vincze (2006) отмечается, что в процессе гипертермии с клетками может происходить три процесса: они могут вернуться к своему первоначальному состоянию, подвергнуться апоптозу, либо погибнуть вследствие некроза. Точный механизм действия гипертермии неизвестен, но можно указать на следующие общепринятые положения. Повышение температуры вызывает расширение сосудов и непрерывное увеличение перфузии крови в здоровых тканях. Повышение температуры приводит также к структурным изменениям трансмембранных белков, вызывающим изменения в активном мембранном транспорте и проницаемости мембраны, в свою очередь приводящим к изменению ионных градиентов калия, натрия и кальция.

Кроме того, гипертермия повышает скорости многих метаболических процессов. Однако при этом недостаток кислорода может приводить к снижению метаболизма вследствие гипоксии и образованию молочной кислоты в результате анаэробного метаболизма и разрушению клеток вследствие ацидоза. В лихорадочном диапазоне температур в опухолях возникают те же самые изменения, но при более высоких температурах в некоторых опухолях происходит вазоконстрикция, приводящая к уменьшению перфузии крови и уменьшению теплопроводности, при этом направление расширения сосудов в пограничных с опухолью здоровых тканях меняется, приводя к повышению перфузии крови и теплопроводности в этом регионе.

Кроме непосредственных биологических тканевых эффектов фототермолиза с золотыми наночастицами в настоящей работе выявлен ряд его иммуномодулирующих эффектов. Согласно результатам наших исследований на животных с базальноклеточным раком кожи, локальная лазерная гипертермия приводит к следующим изменениям иммунологической реактивности. Динамика состояния организма, поражённого опухолью характеризуется повышением уровня паратгормоноподобного белка, при этом максимальное значение данного показателя соответствует моменту максимального разрушения опухолевой ткани. Повышение объема циркулирующих в кровотоке опухолевых антигенов в процессе разрушения опухоли приводит к увеличению процентного содержания натуральных киллеров и уменьшению отношения CD4/CD8 позитивных клеток, а также повышению количества продуцируемого CD4-позитивными клетками интерлейкина-2. После максимальной элиминации опухолевых клеток происходит снижение указанных выше показателей до физиологической нормы.

Динамика изменения указанных показателей коррелирует с интервалами между лазерными воздействиями. Использование золотых наночастиц при лазерной гипертермии позволяет достичь элиминации эквивалентного объема опухоли при меньшей длительности воздействия, при этом наблюдается более выраженный иммунный отклик. Иммунный отклик организма животного на пролонгированную стимуляцию опухолевыми антигенами проявляется в повышении процентного содержания натуральных киллеров и уровня интерлейкина-2 и иммуноглобулинов IgG, снижению соотношения CD4/CD8 позитивных клеток. Уровень антигенности опухоли коррелирует с уровнем паратгормоноподобного белка.

Лазерный фототермолиз, как и инструментальное удаление опухоли, при моделировании можно рассматривать как резкое уменьшение объема опухолевой ткани в организме, возможно приводящее к силовому переключению биологического триггера. Кроме того, лазерный фототермолиз, как установлено нами, обладает рядом статистически значимых иммуномодулирующих эффектов.

В исследовании установлены различия в чувствительности различных гистологических типов опухолей к лазерной гипертермии с наночастицами. Так, в случае неороговевающего плоскоклеточного рака кожи для достижения полной элиминации опухоли достаточно было однократного воздействия и иммунный ответ организма на воздействие был выражен слабо, а при ороговевающем плоскоклеточном раке кожи у собак лазерное воздействие для достижения полной элиминации опухоли необходимо было применять многократно. В случае неороговевающего плоскоклеточного рака кожи полной элиминации опухоли удавалось достичь за 1 сеанс (37%) или за 2 сеанса (63%). В случае ороговевающего плоскоклеточного рака кожи элиминация опухоли достигалась за 3 сеанса (25%) или 4 сеанса (75%).

Полученные результаты свидетельствуют о более высокой устойчивости клеток ороговевающего плоскоклеточного рака к лазерной гипертермии по сравнению с клетками неороговевающего плоскоклеточного рака кожи у собак. В последнем случае длительность безрецидивного периода составляла от 6 до 8 месяцев в 30% случаев, в 25% случаев длительность безрецидивного периода составляла от 8 до 12 месяцев, в остальных 45% случаев длительность безрецидивного периода составляла от 12 до 18 месяцев. В случае ороговевающего рака кожи безрецидивный период составлял от 6 до 8 месяцев у 5% собак, от 8 до12 месяцев - у 20% собак, от 12 до 18 - у 35%, и у 40% - от 18 до 24 месяцев. Эти различия обусловлены, на наш взгляд, специфическими тканевыми особенностями этих опухолей и исходным состоянием иммунологической реактивности экспериментальных животных.

Проведенный в работе сравнительный анализ состояния иммунологической реактивности экспериментальных животных с меланомой слизистой рта показал, что как изолированная иммуномодуляция (1 группа), так и иммуномодуляция в сочетании с лазерной гипертермией с золотыми наночастицами (2 группа) приводит к повышению уровня иммуноглобулинов до нормальных значений, однако изолированная иммуномодуляция приводит к кратковременному эффекту с тенденцией к снижению в течении 14 дней, а в сочетании с лазерной гипертермией нормализация показателей сохраняется в течение 30 дней после окончания воздействия.

Селективной лазерная гипертермии с золотыми наночастицами, в отличие от изолированной иммуномодуляции, повышает процентное содержание В-лимфоцитов и NK-клеток. Повышение уровня интерлейкина-2 в крови животных при изолированной иммуномодуляции имело пиковый характер, а иммуномодуляция в сочетании с гипертермией приводила к более раннему иммунному ответу, причем повышенный уровень интерлейкина-2 оставался стабильным в течение всего срока наблюдения.

Биоинформационная модель взаимодействия иммунной системы и опухолевого процесса в условиях воздействия биологических и биофизических эффектов управляемого лазерного фототермолиза с золотыми наночастицами. В работе сформулированы основные биологические закономерности взаимоотношения опухоли с иммунной системой организма, необходимые для построения адекватной математической модели. Проведен анализ требований к математической модели коррекции опухолевого иммунодефицита. В работе впервые проведено математическое моделирование иммунологической реактивности организма при лазерной гипертермии опухолевой ткани. Представленную в работе математическую модель, описывающую нелинейную динамику системы антиген-«антитело»-интерлейкин, можно рассматривать как обобщение моделей иммунной системы, предложенных ранее [Романовский Ю.М, Степанова Н.В, Чернавский Д.С., 1984], [Kirschner D., Panetta J.C., 1998].

Обобщение указанных моделей заключается в учете влияния продуктов биодеградации ткани при лазерной гипертермии на иммунологическую реактивность организма. Также учитывается динамика поступления извне интерлейкина-2 дискретно или непрерывно. Каждый параметр модели был получен с использованием фактических экспериментальных данных. Когда фактические данные отсутствовали, параметры выбирались таким образом, чтобы максимально соответствовать имеющимся экспериментальным данным о динамике опухолевого роста. Предложенная модель лазерной гипертермии учитывает как эффекты уменьшения опухоли вследствие термической деструкции, так и иммунный ответ на повышение антигенпрезентации продуктов распада опухоли. Полученная в результате математическая модель включает три дифференциальных уравнения:

, (1)

,(2)

.(3)

где x - количество опухолевых клеток (размер опухоли), y - совокупное количество опухолевых антител и цитотоксических Т-лимфоцитов, z - концентрация интерлейкина, и - коэффициенты, характеризующие рост опухоли (с насыщением), - коэффициент противоопухолевой активности антител и цитотоксических Т-лимфоцитов, n -номер сеанса фототермолиза, t_n -момент времени, в который происходит сеанс гипертермии, - объем выжигаемой опухолевой ткани. Z₁ - характеризует время жизни антител, - коэффициент, характеризующий убыль антител и цитотоксических Т-лимфоцитов при уничтожении опухоли.

В правой части уравнения (2) член () моделирует поддержание концентрации интерлейкина в организме, не подвергнувшемся влиянию антигена, на некотором постоянном уровне , который определяется состоянием иммунной системы. Последнее слагаемое отвечает за убыль интерлейкина в процессе генерации антител. Оно описывает эффекты саморегуляции иммунной системы, препятствуя неограниченному росту концентрации антител и интерлейкина, -- -функция Дирака, -- функция Хевисайда, количество продуктов распада после гипертермии опухоли спадает по экспоненте.

Предложенная модель в зависимости от управляющих параметров демонстрирует различные режимы динамики, которые качественно согласуются с представлениями о поведении иммунной системы. Без лазерного воздействия могут наблюдаться следующие ситуации. Для низкого уровня антигенности существует стабильное устойчивое состояние опухоли большого размера, которого достигает система. Для более высокого уровня антигенности имеется цикл с небольшой амплитудой и коротким периодом, при очень высоком уровне антигенности организм может действительно уничтожить опухоль. Все эти моменты рассматриваются при моделировании с реальными параметрами, чтобы получить прогнозы развития ситуации. Если скорость размножения антигена велика, в фазовом пространстве существуют два неустойчивых положения равновесия, а также одно устойчивое положение. При однократном лазерном воздействии даже при практически полном выжигании опухоли модель предсказывает возобновление опухолевого роста. При трехкратном проведении процедуры лазерного фототермолиза опухоли в зависимости от объема выжигаемой опухолевой ткани моделируемая система демонстрирует различные сценарии развития ситуации - от возобновления роста опухоли до практически полного исчезновения опухоли (рис.13).

Рис. 13. Динамика показателей исследуемой системы при трехкратном лазерном воздействии различной мощности (объем выжигаемой ткани).

При одинаковых количественных параметрах фототермического воздействия на опухоль, но при различных коэффициентах стимуляции иммунной системы, зависящих от длительности периода полураспада продуктов опухоли после фототермолиза, сценарии поведения моделируемой системы могут кардинально различаться. Развитие ситуации после лазерной гипертермии также зависит от исходного состояния иммунной системы и выраженности повышения антигенпрезентации в процессе лазерного термолиза с золотыми наночастицами. Причем очень незначительное изменение значений управляющих параметров, определяемых указанными процессами, может кардинально менять исход от полной элиминации опухоли до прогрессирования процесса. Результаты моделирования хорошо коррелируют с экспериментальными исследованиями на животных.

лазерный гипертермия наночастица опухоль

Заключение

Таким образом, в основе концептуальной схемы проведённого исследования реализован вариант системного информационного подхода к анализу иммунобиологического равновесия в системе «иммунитет-опухоль» в динамике спонтанных опухолевых процессов эпителиальной тканевой природы и в условиях эксперимента трансплантации культуры клеток рака почки. На разных этапах развития сложного многокомпонентного взаимодействия между специфическими и неспецифическими системами иммунологического надзора с опухолевыми клетками его динамика может быть представлена в виде биоинформационной модели нестабильного состояния между отдельными, в первую очередь ведущими, компонентами системы, переключение на стимуляцию или подавление которых осуществляют биологические триггеры двунаправленного действия (рис. 14).

Факторы внешнего воздействия на систему на молекулярно-генетическом, тканевом и организменном уровнях запускают разные по направленности и неоднозначные по конечному эффекту процессы в зависимости от переключающего эффекта триггеров, смещая нестабильное равновесие системы в ту или иную сторону. Специфика опухолевых процессов эпителиальной природы определяется в значительной степени гормональным фоном организма и чувствительностью клеток опухоли и иммунной системы к сигналам гормонов, причём продуцентами гормонов могут выступать, в том числе и сами опухолевые ткани.

Модификаторами гормонального фона и иммунной системы, стимулирующей направленности могут выступать фармакологические агенты и иммуномодуляторы естественной природы, совокупные эффекты которых проанализированы нами отдельно для определения их роли в изменении ключевых показателей иммунитета. Эта группа факторов представляет один из векторов системы стремящегося остановить процесс развития опухоли и элиминировать их из организма животного. Аналогичным по направленности, но отличным по механизмам действия является вектор другой группы модификаторов. В качестве такой группы модификаторов выступают физические воздействия на опухоль (хирургическое удаление, облучение, термолиз). Их иммуномодулирующие эффекты также разнонаправлены и неоднозначны по конечным эффектам на нестабильное равновесие системы. Одними из важнейших временных факторов при этом выступает динамика многоэтапного процесса развития опухоли и её чувствительность к физическим воздействиям с одной стороны, и время физического воздействия, как фактор, определяющий развитие конечных биологических эффектов и переключение триггеров на стимуляцию или подавление иммунитета с другой.

Рис. 14. Концептуальная биоинформационная модель анализа взаимодействия иммунной системы и опухолевого процесса эпителиальной природы в условиях воздействия биологических и биофизических эффектов управляемого лазерного фототермолиза.

В этом смысле поиск наиболее быстрых по времени воздействия, точных по его направленности и естественных по конечным эффектам способов удаления опухолей эпителиальной природы представляет собой важнейшую научную проблему экспериментальной онкологии. На основе полученной в настоящем исследовании базы данных разработана и экспериментально верифицирована биоинформационная модель системы «иммунная система-опухоль».

Обучение на полученной базе данных бинарного нейросетевого классификатора полностью подтвердило возможность эффективного использования ряда ключевых показателей иммунной системы, биохимических параметров сыворотки крови для анализа и прогнозирования возможных исходов опухолевых процессов эпителиальной природы. Разработанная биоинформационная модель нелинейной динамики нестабильного равновесия системы «иммунитет-опухоль», основанная на реальных экспериментальных данных демонстрирует 4 основных вида её состояния в виде графических портретов фазовых переходов:

а) - неустойчивое равновесие, высокая скорость нарастания концентрации опухолевых антигенов, низкая реактивность иммунной системы и гибель организма независимо от исходных условий состояния системы,

б) - неустойчивое равновесие с высокой скоростью нарастания опухолевых антигенов и высокой реактивностью иммунной системы с исходом в зависимости от условий начального состояния системы,

в) - устойчивое равновесие динамики перехода в хроническое заболевание, выздоровление или гибель в зависимости от исходных условий состояния системы,

г) - неустойчивое равновесие динамики полного выздоровления и регистрации процесса в иммунологической памяти организма.

На основе разработанной биоинформационной модели теоретически предсказана и экспериментально подтверждена возможность стимуляции иммунного ответа при локальной лазерной гипертермии, причём эффективность такого воздействия многократно возрастает при использовании золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Использованный в настоящем исследовании лазерный фототермолиз с применением золотых плазмонно-резонансных наночастиц по своим биофизическим эффектам (селективный нагрев тканей на заданной глубине, повышение скорости их нагрева, динамика уменьшения объёма опухоли) и биологическим эффектам реакций на термовоздействие (ожоговый стресс, воспаление, стимуляция апоптоза, стимуляция иммунитета продуктами послеожоговой биодеградации тканей) обладает комплексным иммуномодулирующим действием. В исследовании экспериментально доказано, что при согласовании длины волны лазерного излучения, соответствующей окну прозрачности биоткани и пика поглощения плазмонно-резонансных золотых наночастиц возможна точная, высокоэффективная и быстрая деструкция опухолевых тканей эпителиальной природы на глубине до 8 мм без повреждения вышележащих слоёв неизменённых тканей.

Выводы

1. Частота встречаемости исследованных опухолей у животных зависит от пола: у животных женского пола преобладает рак молочных желез, мужского - рак параанальных желез и меланома слизистой оболочки ротовой полости. Низкодифференцированные формы рака составляют 10% всех эпителиальных злокачественных опухолей. Основными гистологическими типами опухолей у собак являются протоковый рак молочных желез высокой и средней степени дифференцировки, высокодифференцированные цистокарцинома и аденокарцинома яичников, солидные формы базальноклеточного рака кожи, высокодифференцированные аденокарциномы предстательной и параанальных желез, эпителиоподобный и невусоподобный варианты меланомы слизистой оболочки ротовой полости.

2. Развивающееся в динамике опухолевого процесса иммунодефицитное состояние животных, выражается в снижении содержания иммуноглобулинов классов IgG и IgM, процентного содержания NK-клеток и общей лимфоцитопении и сопровождается таким дисбалансом эндокринной системы, как повышение уровня кортизола, эстрадиола, прогестерона, кальцитонина и паратгормоноподобного белка.

3. На основе сравнительного анализа установлено, что по эффективности воздействия на гуморальное звено иммунитета при опухолях у экспериментальных животных иммуностимуляторы располагаются в следующей последовательности: миелопид, Т-активин, полиоксидоний. При супрессии циклофосфамидом выработки иммуноглобулинов класса IgG параллельная стимуляция цитотоксических Т-лимфоцитов позволяет преодолеть явление экранирования опухолевых клеток, при этом наиболее выраженный эффект был получен при применении полиоксидония.

4. Сформирована база данных и впервые реализовано успешное обучение нейросетевого классификатора для определения наличия злокачественного процесса по эндокринным, иммунным и биохимическим показателям с верификацией на основе морфологического анализа. В результате контрастирования нейросети установлено, что наибольшими весовыми коэффициентами обладают следующие параметры крови уровень кальция в сыворотке крови, активность аспартат- и аланин трансаминаз, уровень кальцитонина и иммуноглобулинов класса IgG.

5. Системные биологические и локальные тканевые эффекты при введении золотых наночастиц в организм экспериментальных животных имеют размерно-обусловленный характер. Частицы диаметром 160 нм воздействуют на стенку кровеносных сосудов, что приводит к вакуольной дистрофии эндотелиальных клеток, сепарации клеток крови и плазмы, незначительной дистрофии клеток паренхиматозных внутренних органов. Частицы диаметром 50 нм приводят к более выраженным изменениям внутренних органов, менее выраженной сепарации крови, умеренной дистрофии паренхиматозных клеток внутренних органов и нарушениям кровообращения. Специфические изменения в головном мозге отсутствуют.

6. Использование золотых плазмонно-резонансных наночастиц для лазерной гипертермии неизменённых и опухолевых биологических тканей повышает скорости их нагрева и выхода на стационарный управляемый температурный режим в диапазоне 46-60⁰С, стимулирует в них процессы апоптоза опухолевых клеток и оказывает системные иммуномодулирующие эффекты. Пространственное распределение температуры биологических тканей при лазерной гипертермии с наночастицами коррелирует с возникающими в них морфологическими изменениями.

7. Количественная динамика пассивного накопления золотых наноочастиц в перевитых опухолях имеет два временных интервала максимального повышения концентрации золота в опухоли. Первый максимум, обусловленный васкуляризацией опухоли, соответствует максимальной концентрации наночастиц в циркулирующей крови, второй максимум обусловлен фенестрацией эндотелия сосудов опухоли и наблюдается спустя 24 часа после системного введения золотых наночастиц. Локальная лазерная гипертермия с плазмонно-резонансными золотыми наночастицами приводит к регрессии и ингибированию роста перевитых опухолей у экспериментальных животных.

8. Быстрая и эффективная деструкция опухолевых клеток без повреждения вышележащих тканей возможна на глубине до 8 мм при согласовании длины волны лазерного излучения, соответствующей окну прозрачности биоткани и пика поглощения золотых плазмонно-резонансных наночастиц. Клетки ороговевающего плоскоклеточного рака имеют более высокую устойчивость к такому воздействию, чем клетки неороговевающего.

9. Многократная лазерная гипертермия с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц приводит к усилению иммунного отклика организма животного на пролонгированную стимуляцию опухолевыми антигенами и проявляется в повышении процентного содержания натуральных киллеров, уровней IgM и интерлейкина-2, снижении соотношения CD4/CD8. Сочетание фармакологической иммуномодуляции и локальной гипертермии с использованием золотых плазмонно-резонансных наночастиц усиливает общую иммунореактивность организма экспериментальных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Терентюк Г.С., Максимова И.Л. Нейросетевой подход в диагностике злокачественных новообразований молочных желез. //Альманах клинической медицины. МОНИКИ, 2006. Т.XII, С.63.

2. Тимофеев С.В., Терентюк Г.С. Особенности функционального состояния иммунной системы у собак, больных раком молочной железы. //Ветеринарная медицина, 2006. № 4. С.19.

3. Zharov V., Galanzha E., Shashkov E., Maksimova I., Khlebtsov B., Khlebsov N., Terentuk G., Akchurin G., Tuchin V. In vivo detection and killing of individual circulating metastatic cells. // Laser Surg. Med., 2007. V.19. p.47-48.

4. Maksimova I.L., Akchurin G.G., Khlebtsov B.N., Terentyuk G.S., Akchurin G.G.Jr., Ermolaev I.A., Skaptsov A.A., Soboleva E.P., Khlebtsov N.G., Tuchin V.V. Near-infrared laser photothermal therapy of cancer by using gold nanoparticles: Computer simulations and experiment. //Med Laser Appl., 2007. V.22. р. 199-206.

5. Терентюк Г.С., Жандарова Л.Ф., Конопацкова О.М., Непомнящая Е.М. , Гудцкова Т.Н., Сулейманова Л.В., Черванев В.А., Максимова И.Л., Хлебцов Б.Н., Богатырев В.А, Дыкман Л.A., Хлебцов Н.Г. Применение иммуностимуляторов и фототермической лазерной терапии при меланоме у собаки. //Известия ВУЗов Северо-Кавказский регион, 2007. № 5. С.139-141.

6. Терентюк Г.С. Химиотерапия рака молочных желез у собак. //Ветеринарная патология. 2008. №1(24). С.76-80.

7. Забродский П.Ф., Терентюк Г.С., Плахута И.А. Сравнительная характеристика эффективности иммуномодуляторов при иммунодефиците, обусловленном циклофосфамидом. //Вестник ВолГМУ, 2007. №1(21). С.37-39.

8. Терентюк Г.С., Трояновская Л.П., Конопацкова О.М., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л. Термографический метод в ветеринарной и сравнительной онкологии. //Российский ветеринарный журнал мелкие домашние и дикие животные, 2008. №3. С.11-15.

9. Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г., Долганова М.В., Иванов А.Н., Киричук В.Ф., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Трояновская Л.П., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В. Особенности воздействия золотых наночастиц и их конъюгатов на физиологические показатели организма при онкозаболеваниях. //Российский биотерапевтический журнал, 2008. Т.7. №1. С.33.

10. Максимова И.Л., Акчурин Г.Г., Ревзина Е.М., Рябухо В.П., Скапцов А.А., Терентюк Г.С., Тучин В.В., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г. Использование наночастиц для контрастирования злокачественных новообразований при оптических методах диагностики (низкокогерентная томография, спектроскопия диффузного отражения). //Российский биотерапевтический журнал, 2008. Т.7. №1. С.30.

11. Максимова И.Л., Акчурин Г.Г., Терентюк Г.С., Хлебцов Б.Н., Акчурин Г.Г.мл., Ермолаев И.А., Скапцов А.А., Ревзина Е.М., Тучин В.В, Хлебцов Н.Г. Лазерный фототермолиз биотканей с использованием плазмонно-резонансных наночастиц. //Квантовая электроника, 2008. Т.38. №6. С.536-542.

12. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ дренирования области удаленного подмышечного лимфоузла у собак при мастэктомии первой пары молочных желез с лимфапоэктомией Патент на изобретение № 2298421, дата приоритета 26.09.2005, Бюл. № 13

13. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ лечения остеолизиса при метастазировании злокачественного образования в кости у собак. Патент на изобретение № 2299738. 2007, дата приоритета 08.12.2005, Бюл. №15.

14. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ коррекции иммунной недостаточности при лечении верифицированных форм рака молочной железы и меланомы собак. Патент на изобретение № 2320293, дата приоритета 07.11.2006, Бюл. №9.

15. Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Сулейманова Л.В., Пчелинцева Н.О., Терентюк Г.С., Черванев В.А. Способ лазерной деструкции меланомы слизистой оболочки у собак. Патент на изобретение № 2329074, дата приоритета 7.02.2008, Бюл. №20.

16. Черванев В.А., Терентюк Г.С. Способ овариогистерэктомии при раке левого яичника с экстирпацией метастаз из забрюшинного пространства у животных. Патент на изобретение № 2338472, дата приоритета 19.03.2007, Бюл. №32.

17. Терентюк Г.С. Способ расширенной мастэктомии пятой молочной железы с первичной опухолью при наличии метастазов в поверхностный паховый лимфоузел у собак. Патент на изобретение №2342102, дата приоритета 24.08.2007.

18. Терентюк Г.С. Полихимиотерапевтический способ лечения и реабилитации собак при неоплазии молочных желез. //Труды 2 международной конф. "Здоровье, разведение, защита мелких домашних животных" - Уфа, 2001. С.77-79.

19. Терентюк Г.С. Мастэктомия в сочетании с лимфоденэктомией опухоли молочных желез у собак. //Труды 10 Московского международ. ветеринар. Конгресса - Москва, 2002.С.170-172.

20. Бабушкин В.А., Терентюк Г.С., Ключников А.Г. Коррекция гиповолемии у собак при тяжелых формах гестозов ЭМИ КВЧ-диапазона. //ММ-волны в биологии и медицине. 2003. №3. С.17-19.

21. Терентюк Г.С. Практический подход к диагностике и лечению неоплазии репродуктивных органов у сук. //Ветеринария Поволжья, 2003. №2(5). С.30-31.

22. Терентюк Г.С., Авдеенко В.С. Оценка состояния плода и новорожденного приплода при синдроме внутриутробной задержки развития. // Труды Международ. науч.-практ. конф. "Развитие народного хозяйства в Западном Казахстане" - Уральск, 2003. С.290-291.

23. Терентюк Г.С., Авдеенко В.С. Диагностика фетоплацентарной недостаточности у беременных собак с экстрагенитальной патологией. // Труды Международ. науч.-практ. конф. "Развитие народного хозяйства в Западном Казахстане" - Уральск, 2003. С.293-294.

24. Терентюк Г.С. Проведение реанимации мелких домашних животных. //Ветеринария Поволжья, 2003. №1(4). С.37-38.

25. Терентюк Г.С., Черванев В.А., Трояновская Л.П., Пальцев С.С. Практические рекомендации по иммуноферментной диагностике онкологических заболеваний органов размножения у животных, - Воронеж, Изд-во ВГАУ, ISBN 5-7267-0404-5, 2005. - 35с.

26. Терентюк Г.С. Диагностика и оперативно-консервативные методы лечения злокачественных новообразований молочных желез у собак. - Воронеж, "Истоки", ISBN 5-7267-0409-6, 2006. - 40с.

27. Дмитриев А.В., Терентюк Г.С. Распространение, этиология и клинические проявления мочекаменной болезни у котов и кошек. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина», - Саратов, 2006. С.132-135.

28. Музалевская А.В., Терентюк Г.С. Лечение хронической интоксикации на фоне фиброзно-кистозной мастопатии собак. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина», - Саратов, 2006. С.256-257.

29. Пчелинцева Н.О., Терентюк Г.С. Биохимические показатели крови при различных видах простатита. //Материалы VI Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина», - Саратов, 2006. С.283-284.

30. Терентюк Г.С. К вопросу о терапии рака молочной железы у собак. //Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных», - Воронеж, 2006. С.295-296.

31. Терентюк Г.С. Применение ронколейкина в ветеринарной онкологии. //Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных», - Воронеж, 2006. С.297-299.

32. Терентюк Г.С. Значение определения уровня D-димера в плазме крови собак, больных раком молочной железы.//Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы диагностики, терапии и профилактики болезней домашних животных», - Воронеж, 2006. С.328-329.

33. Терентюк Г.С. Применение метода клинической цитологии в ветеринарной практике. - Воронеж, «Истоки», ISBN 5-7267-0410-X, 2006. - 24с.

34. Терентюк Г.С., Черванев В.А., Пальцев С.С. Неоплазии молочных желез у собак. - Воронеж, «Истоки», ISBN 5-7267-0418-5, 2007. - 152с.

35. Terentuk G.S., Plahuta I.A. Features of pharmacological regulation of disturbances of the immune answer caused by cyclophosphamide. ICT XI 2007 Montreal, Canada International Congress of Toxicology 15-19 July ICT XI, IUTOX2007-3156.

36. Maksimova I.L., Terentyuk G.S., Genina E.A., Skaptsov A.A., Tuchin V.V., Khlebtsov B.N., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N.G. Diagnostic potentialities of plasmon-resonant nanoparticles as contrast agents for the diffuse back scattering spectroscopy of biotissues. //Proc. SPIE. 2007. V. 6536. P. 65360C (1-10) (doi: 10.1117/12.753447).

37. Terentyuk G.S., Maksimova I.L., Tuchin V.V., Zharov V.P., Khlebtsov B.N., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Khlebtsov N. G. Application of gold nanoparticles to x-ray diagnostics and photothermal therapy of cancer // Proc. SPIE. 2007. V.6536. P. 65360B (1-12). (doi: 10.1117/12.753446).

38. Akchurin G.G.Jr, Akchurin G.G., Bogatyrev V.A., Maksimova I.L., Seliverstov G.A., Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G., Terentyuk G.S., Tuchin V.V. Near-infrared laser photothermal therapy and photodynamic inactivation of cells by using gold nanoparticles and dyes. // Proc. SPIE, 2007. V. 6645, p. 66451U.

39. Terentyuk G.S., Akchurin G.G., Maksimova I.L., Maslyakova G.N., Suleymanova L.V., Tuchin V.V. Optimization of laser heating with the treatment of spontaneous tumors of domestic animals by the use of the thermography. //Proc. SPIE, 2008. V. 6791, p. 67910Q-10, DOI:10.1117/12.803985.

40. Akchurin G.G., Khlebtsov B.N., Khlebtsov N.G., Kolbenev I.O., Lychagov V.V., Maksimova I.L., Ryabukho V.P., Skaptsov A.A., Terentyuk G.S., Tuchin V.V. Dynamic of gold nanoparticles labeling studied on the basis of OCT and backscattering spectra of tissues and phantoms //Proc. SPIE. 2008. V. 6855, р. 68550K

41. Терентюк Г.С. Отчет по НИР «Разработка нанотехнологии лазерного селективного фототермолиза и контрастирования злокачественных новообразований на основе использования плазмонно-резонансных наночастиц» рег. номер темы 0120.0 801037, инвентарный № 0220.0 800223 в ЦИТиС, 2008. 78с.

42. Данилова Т.В., Конопацкова О.М., Терентюк Г.С. Компьютерная обработка термограмм для оценки параметров новообразований кожи и слизистых оболочек. //Математические методы в технике и технологиях. - ММТТ-21, Сборник трудов ХХI Международной научной конференции в 10т. Т.9, ISBN 978-5-7433-1926-8 - Саратов, 2008. - c.52-54.

43. Терентюк Г.С., Трояновская Л.П., Соболева Е.П., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Сулейманова Л.В. Оптимизация режимов лазерного термического воздействия для стимуляции процессов апоптоза при онкологических заболеваниях у мелких домашних животных. Материалы ХVI Московского международного конгресса по болезням мелких домашних животных, - Москва, 26-28 апреля 2008. с.44-45

44. Терентюк Г.С., Трояновская Л.П., Соболева Е.П., Храмова М.И. Лечение миокардита, осложненного синоатриальной блокадой у лошадей. Материалы Всероссийского ветеринарного конгресса, - Москва, 26-28 апреля 2008. с.137-138

45. Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Сулейманова Л.В., Тучин В.В., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В. Применение золотых наночастиц для селективной фототермической терапии злокачественных новообразований. Труды V Съезда фотобиологического общества. - Пущино 8-13 июня 2008. С.216.

46. Максимова И.Л., Рыскин НМ., Терентюк Г.С. Особенности иммунного ответа при лазерной гипертермии. Труды V Съезда фотобиологического общества. - Пущино 8-13 июня 2008. С.234.

47. Акчурин Г.Г., Акчурин Г.Г., Максимова И.Л., Селиверстов Г., Терентюк Г.С., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Тучин В.В. Инфракрасный лазерный фототермолиз и фотодинамическая инактивация клеток при взаимодействии излучения с фотосенсибилизаторами и плазмонно-резонансными наночастицами. Труды V Съезда фотобиологического общества. - Пущино 8-13 июня 2008. С. 163.

48. Akchurin G.G.; Akchurin G.G.; Ivanov A.N.; Kirichuk V.F.; Terentyuk G.S.; Khlebtsov B.N.; Khlebtsov N.G. Influence of gold nanoparticles on platelets functional activity in vitro. //Proc. SPIE, 2008. V. 6869, p. 68690V-6.

49. Akchurin G.G.; Maksimova I.L.; Rybukho V.P.; Lychagov V.V.; Khlebtsov B.N.; Khlebtsov N.G.; Akchurin G.G., Jr.; Kolbenev I.O.; Maksimov V.Y.; Naumova O.G.; Skaptsov A.A.; Terentyuk G.S.; Tuchin V.V. Dynamic of gold nanoparticles labeling studied on the basis of OCT and backscattering spectra of tissues and phantoms. //Proc. SPIE, 2008. V. 6855, p. 68550K-10.

50. Данилова Т.В., Терентюк Г.С., Компьютерная обработка термограмм для оценки асимметрии новообразований кожи и слизистых оболочек у человека и животных, 2008 Труды конференции (АПЭП-2008) 24-25 сентября 2008. - Саратов. С.473-478.

51. Suleymanova L.V., Тerentyuk G.S., Maslyakova G.N., Kogan B., Khlebtsov N.G., Khlebtsov B.N., Akchurin G. G., Maksimova I.L., Shantrocha A.V., Tuchin A.V., Changes of biological tissues and biochemical changes after intravenous injection of gold nanoparticles, Proc. 7th International Conference on Photonics and Imaging in Biology and Medicine, - Wuhan, China, 24-27 November 2008. P.6-37.

52. Хлебцов Н.Г., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Хлебцов Б.Н., Терентюк Г.С., Максимова И.Л., Акчурин Г.Г., Шантроха А.В., Тучин В.В. Золотые наночастицы для применений в диагностике и терапии онкозаболеваний, Труды всероссийской конференции с международным участием «Нанотехнологии в онкологии 2008», - Москва, Российский научный центр «Курчатовский институт», 2008. - C. 176.

Размещено на Allbest.ru