Оптимизация оценки качества производителей карповых рыб в аквакультуре

Размещено на http://www.allbest.ru/

Оптимизация оценки качества производителей карповых рыб в аквакультуре

Специальность: 03.00.10 - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Залепухин Валерий Владимирович

Астрахань 2009

Работа выполнена в Волгоградском государственном университете

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.В. Стрельников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.А. Кокоза

доктор сельскохозяйственных наук, профессор В.А. Власов

доктор биологических наук, профессор В.И. Козлов

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства (ВНИИПРХ)

Защита состоится «_____»_____________2009 года в ______часов на заседании Диссертационного Совета Д. 307.001.05 при Астраханском государственном техническом университете по адресу: 414025, РФ, Астраханская область, г. Астрахань, ул. Татищева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного технического университета.

Автореферат разослан «_____»____________2009 года.

Ученый секретарь диссертационного Совета Д. 307.001.05 к.б.н., доцент Э.И. Мелякина

кровь морфологический репродуктивный

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Современное состояние водных биоресурсов во внутренних водоемах Российской Федерации следует охарактеризовать как напряженное - из-за угрозы исчезновения отдельных видов и популяций вследствие нерационального промысла и возросшего браконьерства, загрязнения водной среды, снижения эффективности естественного воспроизводства.

Надежды на сохранение и пополнение биологических ресурсов связаны с искусственным разведением ценных видов рыб, которое позволяет поддерживать промысловые запасы и наращивать объемы производства товарной продукции аквакультуры в регулируемых условиях. Прогрессивность и важность этого направления неоднократно подчеркивается в отечественных публикациях (Лукъяненко и др., 1984, Никоноров, Витвицкая, 1993, Виноградов, 1994, Иванов, 2000, Мамонтов и др., 2000, Кокоза, 2004, и др.). Проблемы охраны, рациональной эксплуатации и расширенного воспроизводства биологических ресурсов трудно решить без фундаментальных научных исследований по выявлению основных закономерностей роста, размножения и смертности в популяциях (Никольский, 1980, Дехник и др., 1985). На таких знаниях базируются:

- представления о возможностях управления численностью, продуктивностью и воспроизводством рыб в природных и искусственных водных экосистемах, и др.

- теория формирования биологических ресурсов и эксплуатации промысловых запасов;

- направления перехода к интенсивным формам морской и пресноводной аквакультуры;

Цикл работ, проведенных советскими и российскими исследователями, позволяет говорить о важной роли качества производителей, половых продуктов и молоди в динамике численности популяций. В естественных условиях подобные характеристики определяют качественные показатели пополнения промысловых стад (Никольский, 1974), в искусственных - позволяют перейти к научно обоснованным методам совершенствования биотехники выращивания и оптимизации оценки производителей.

Изучению половых циклов и раннего онтогенеза рыб посвящено значительное количество работ отечественных и зарубежных авторов, но известная специализация на том или ином направлении исследований приводит к отсутствию комплексного подхода ко многим биологическим явлениям. При всей кажущейся изученности различных аспектов оценки качества производителей и потомства в рыбохозяйственной науке до сих пор не проведено комплексного исследования, в котором была бы на единой методической основе проанализирована триада «качество производителей > качество половых продуктов > качество молоди». В отечественной литературе пока не создано такой всесторонней сводки по эндогенной разнокачественности, подобной классической работе В.Н. Жукинского (1986), в которой была проанализирована роль внешних (экзогенных) факторов в раннем онтогенезе рыб.

Совершенствование технологий искусственного воспроизводства предполагает повышение эффективности работы с половозрелыми рыбами, базирующейся на достижениях биологической науки - в том числе на методах физиолого-биохимической индикации репродуктивного потенциала рыб. Традиционные методы выращивания и оценки половозрелых рыб по экстерьерным признакам не в полной мере отражают качественные характеристики производителей в условиях искусственного воспроизводства, так как они слабо связаны с рыбоводными показателями инкубации и эмбриональным развитием. Селекционная работа в сочетании с оценкой качества производителей по цепи функциональных связей «обмен веществ половозрелых рыб > плодовитость > качество половых продуктов > жизнестойкость молоди» может служить одним из направлений повышения эффективности искусственного разведения.

С практической точки зрения единый подход к оценке качества производителей на основе синтеза результатов рыбоводно-биологического и физиолого-биохимического анализа и его математической интерпретации, смог бы внести существенный вклад в совершенствование биотехники искусственного рыборазведения в пресноводных водоемах.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в совершенствовании методов оценки производителей карповых рыб в аквакультуре по компонентам эндогенной разнокачественности на базе комплексного рыбоводно-физиолого-биохимического подхода.

К основным задачам, решаемым для достижения поставленной цели, относятся:

Анализ методов оценки производителей по морфологическим и экстерьерным характеристикам, их репродуктивного потенциала при искусственном разведении.

Исследование функционального состояния производителей по физиолого-биохимическим параметрам крови, в том числе при перезревании и резорбции половых продуктов.

Изучение половых продуктов, получаемых с применением экзогенного стимулирования созревания; биохимических механизмов «нормы» и «патологии» в формировании качества икры.

Анализ основных параметров эмбрионального развития в процессе инкубации и их взаимосвязей с биохимическим составом икры.

Изучение жизнеспособности не питавшихся личинок, полученных из разнокачественной икры, и связей с ее биохимическим составом.

Анализ возможностей использования производителей, выросших в различных экологических условиях (в прудах и в естественных водоемах), для искусственного разведения и их оценки на основе традиционных и физиолого-биохимических методов.

Применительно к задачам исследования оптимизацией следует считать поиск условий и факторов, приближающих нас к наилучшим вариантам формирования, оценки и эксплуатации маточных стад карповых рыб в аквакультуре.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный анализ биологической и физиолого-биохимической эндогенной разнокачественности трех видов карповых рыб различного происхождения, экологии и доместикации в условиях V и VI зон рыбоводства. На основе синтеза биологического и математического анализа исследованы морфологические, репродуктивные, физиологические и биохимические параметры в триаде объектов исследований «качество производителей > качество половых продуктов > качество молоди». Определены зависимости основных рыбоводных показателей в ходе инкубации и жизнестойкости личинок от гематологических характеристик производителей и биохимического состава икры, продемонстрированы механизмы снижения качества икры при экзогенном стимулировании созревания и овуляции. Показаны биохимические изменения при дозревании, пре- и постовулярном перезревании и резорбции икры. Впервые проанализированы взаимосвязи индивидуальной рабочей плодовитости с физиологическим состоянием рыб, количественными показателями овулировавшей икры, ходом эмбрионального развития и жизнеспособностью личинок. Проведен сравнительный анализ половозрелых рыб, биохимического состава разнокачественной икры, личинок пестрого толстолобика и сазана, выросших в природных водоемах и использованных для заводского разведения. Сформировано представление о функциональных связях в раннем онтогенезе рыб. В итоге сформулированы основные представления о роли компонентов эндогенной разнокачественности для оценки качества производителей в условиях искусственного воспроизводства карповых рыб.

Основные положения, выносимые на защиту:

Оценка влияния физиологического состояния производителей и качества овулировавшей икры на эмбриональное развитие и жизнеспособность личинок в условиях искусственного разведения

Условия и механизмы формирования качества овулирующих ооцитов в условиях искусственного воспроизводства; биохимические процессы, связанные со снижением качества икры при перезревании и резорбции.

3. Анализ взаимозависимостей морфологических и репродуктивных признаков самок карповых рыб с характеристиками эмбрионального развития и биохимическим составом разнокачественной икры.

4. Воздействие технологических факторов искусственного воспроизводства на качество икры и ход эмбрионального развития

Сравнительный анализ эндогенной разнокачественности у рыб различной степени доместикации, выросших в естественных водоемах и использованных для заводского разведения, и производителей из маточных стад прудовых хозяйств.

Факторы и условия пополнения маточных стад производителями карповых рыб из естественных водоемов.

Теоретические, диагностические, прикладные и ресурсосберегающие направления использования компонентов эндогенной разнокачественности для оценки качества производителей в условиях искусственного воспроизводства.

Оптимизация оценки качества производителей на основе взаимосвязей биометрических и физиолого-биохимических параметров.

Практическая значимость заключается в разработке комплексного подхода к оценке качества производителей, получаемой икры и личинок в условиях искусственного воспроизводства карповых рыб в V и VI зонах рыбоводства. Выявлен ряд биологических и биохимических характеристик, перспективных для оценки качества производителей (рабочая плодовитость, показатели красной крови) и икры (диаметр набухшей икры, содержание общего белка, фосфоглицеридов, свободного холестерола и др.). Показано, что некоторые биологические и биохимические показатели (диаметр и вариабильность размеров овулировавших икринок, содержание воды, неэстерифицированных жирных кислот, соотношение натрия и калия, коэффициент Дьерди и др.) могут использоваться при диагностике перезревания и резорбции икры. Данные по жизнеспособности не питающихся личинок и ее взаимосвязям с биохимическим составом овулировавшей икры необходимы для создания рыбоводно-биологического стандарта для личинок и молоди карповых рыб. Продемонстрирована возможность использования и оценки производителей сазана и пестрого толстолобика из природных водоемов для искусственного разведения. Оценено влияние различных компонентов эндогенной разнокачественности на формирование биологических ресурсов в пресноводных водоемах на основе представлений о соотношении производителей и потомства.

Материалы диссертации используются в учебных курсах «Общая экология», «Биологические ресурсы водоемов», «Теоретические проблемы биоразнообразия» в Волгоградском государственном университете; «Современные проблемы науки» и «Управление природопользованием» в Волгоградском государственном педагогическом университете.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XXXV, XXXVI и XXXVII научно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава Астраханского технического института рыбной промышленности и хозяйства (1981 - 1984 гг.), V и VI Всесоюзных конференциях по экологической физиологии и биохимии рыб (Севастополь, 1982, Паланга, 1985), III Всесоюзном совещании по раннему онтогенезу рыб (Калининград, 1983), Всесоюзном совещании молодых ученых «Методы интенсификации прудового рыбоводства» (Рыбное, 1984), Всесоюзной конференции молодых ученых «Гидрорыбпроекта» (Москва, 1985), Х и ХI Всесоюзных совещаниях по проблемам освоения растительноядных рыб (Славянск, 1984, Кишинев, 1988), XIX конференции «Биологические основы рыбного хозяйства водоемов Средней Азии и Казахстана» (Ашхабад, 1986), Первом Всесоюзном симпозиуме по экологической биохимии рыб (Ярославль, 1987), Всесоюзном совещании «Репродуктивная физиология рыб» (Минск, 1991), Круглых столах по эколого-экономическим проблемам природопользования и устойчивого развития в Нижневолжском регионе, проводимых Волгоградским государственным университетом (2001-2009 гг.), региональных Экологических чтениях, проводимых Волгоградским отделением Российской Экологической Академии (Волгоград, 2001-2005 гг.), российско-германской научно-практической конференции «Экономика. Экология. Право» (Волгоград, 2002), ежегодных Областных краеведческих чтениях (Волгоград, 2001-2009 гг.), международной научно-практической конференции «Животные в антропогенном ландшафте» (Астрахань, 2003), российско-японской конференции «Ядерная, радиационная и экологическая безопасность» (Волгоград, 2003), научно-практической конференции «Инновационные технологии в экологическом образовании: пути, формы и методы их реализации» (Волгоград, 2004), международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем» (Астрахань, 2004), IX Международной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006), международном симпозиуме «Тепловодная аквакультура и биологическая продуктивность водоемов аридного климата» (Астрахань, 2007), международной конференции «Ихтиологические исследования на внутренних водоемах» (Саранск, 2007), Второй научной конференции с участием стран СНГ «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2007), Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2008), международной научно-практической конференции «Современные проблемы биоразнообразия» (Воронеж, 2008), II Международной научной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2009), международной конференции «Инновационные технологии в аквакультуре» (Ростов-на-Дону, 2009).

По материалам диссертации опубликовано 74 печатных работы (среди них 9 - в рецензируемых научных изданиях, отнесенных к перечням ВАКа) общим объемом свыше 50 печатных листов, в том числе учебно-методическое пособие «Теоретические аспекты биоразнообразия» (2003) и монография «Концепция эндогенной разнокачественности в условиях искусственного воспроизводства карповых рыб» (2006). Материалы диссертации вошли в коллективные монографии «Волго-Ахтубинская пойма - природный дар человечеству» (2006) и «Энциклопедия Волгоградской области» (2007).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 432 страницах машинописного текста, включая 100 таблиц и 45 рисунков; состоит из введения, семи глав, выводов, практических рекомендаций и заключения. Список литературы включает 686 публикаций отечественных и зарубежных авторов. В 23 приложениях приведены данные экспериментальных исследований, корреляционные таблицы, компьютерные графики и другие материалы.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 «Обзор литературы» содержит анализ публикаций отечественных и зарубежных авторов по методам оценки животных в сельскохозяйственном производстве; методам оценки качества производителей, половых продуктов и молоди в рыбохозяйственной науке.

Глава 2. Материал и методики исследований.

Собственный экспериментальный материал получен в течение 1980-1998 гг. в условиях V и VI зон рыбоводства (Волгоградская и Астраханская области). Работа выполнена на базе Башмаковского инкубационного цеха Астраханского производственного комбината прудового рыбоводства, инкубационных цехов рыбколхоза «40 лет Октября» и рыбосовхоза «Волжанка» объединения «Волгоградрыбхоз».

Объектами исследований послужили производители, половые продукты и личинки трех видов карповых рыб - основных объектов современного прудового рыбоводства и аквакультуры: сазана и карпа Cyprinus carpio L., белого амура Ctenopharyngodon idella Val. и пестрого толстолобика Aristhichthys nobilis Rich.:

Сазан - производители, отловленные в естественных водоемах и завезенные с тоней Нижней Волги (1980-1986 гг.);

Карп - молдавский местной селекции (1984-1986 гг.) и украинский карп, завезенный с Донрыбокомбината (1989-1998 гг.);

Белый амур - производители из местных пользовательных стад;

Пестрый толстолобик - производители из местных пользовательных стад, а также выросшие в природных условиях, отловленные в дельте Волги в 1984 году и использованные в дальнейшем для искусственного воспроизводства («прудовые» и «речные»).

Гидрохимический режим в водоемах, служащих источниками водоснабжения для всех рыбоводных хозяйств (реки Волга и Ахтуба, Волгоградское водохранилище), а также в аппаратах, бассейнах и прудах контролировался по общепринятым методикам (Строганов, Бузинова, 1980; Бессонов, Привезенцев, 1987). Величины отдельных показателей в период исследований не выходили за рамки рыбоводно-биологических нормативов для прудовых хозяйств.

У производителей определяли основные биологические характеристики: возраст, длину L и ?, массу Р и наибольшую высоту тела Н; рассчитывали упитанность по Фультону и Кларку, коэффициент высокоспинности ? / H, коэффициент зрелости - по общепринятым в ихтиологии методикам (Правдин, 1966). Индивидуальную рабочую плодовитость у каждой самки определяли весовым методом, относительную рабочую плодовитость рассчитывали на 1 кг массы рыбы. На свежем материале измеряли диаметр овулировавшей икры (n = 25 ч 40 для каждой самки), подсчитывали количество икринок в 1 грамме и среднюю массу одной икринки. Плотность овулировавших икринок рассчитывали как отношение массы к объему (Жукинский, Дъячук, 1964). При анализе спермы определяли объем эякулята, концентрацию сперматозоидов путем просчета в камере Горяева, качество - по пятибалльной шкале Персова, учитывающей подвижность спермиев. Анализ спермы проведен у 226 рыб различного происхождения и выросших в разных экологических условиях.

Качество икры оценивалось по комплексу биологических и биохимических показателей. Для предварительной оценки в полевых условиях использовались методики, предложенные Е.Л. Соколовой (1971) для карпа; Л.В. Ерохиной и В.К. Виноградовым (1968) и В.Ф. Кривцовым и сотр. (1988) для растительноядных рыб. Они включают:

визуальную оценку овулировавшей неоплодотворенной икры (окраску, консистенцию, количество овариальной жидкости, внешний вид икринок, наличие посторонних включений), единовременность или растянутость овуляции и отцеживания икры и др.;

анализ эмбрионального развития, в ходе которого определяется оплодотворяемость, типичность и синхронность дробления; наличие аномально развивающихся эмбрионов и характер уродств; растянутость и дружность вылупления и т.д.

Икра каждой самки осеменялась спермой 3-6 самцов, имеющей оценку по шкале Персова в 4 и 5 баллов и инкубировалась в отдельных аппаратах в соответствии с общепринятой биотехникой заводского воспроизводства карпа (Конрадт, Сахаров, 1969) и растительноядных рыб (Виноградов и др., 1975).

Периодизация оогенеза - по А.П. Макеевой (1992). Стадии и этапы эмбрионального развития изучаемых видов определяли по В.В. Васнецову (1953), Б.П. Лужину (1977) и С.Г. Соину (1963). Регистрировались такие аномалии развития как нарушения дробления и появление уродливых бластомеров, неравномерная сегментация тела и искривления позвоночника, водянка желточного мешка и др.

В процессе эмбрионально-личиночного развития определяли:

а) процент оплодотворения - на стадиях 4-8 бластомеров;

б) процент нормально и уродливо развивающихся эмбрионов - после завершения этапа сегментации тела;

в) процент выхода предличинок - на стадиях вращающегося эмбриона, незадолго до вылупления.

Все просчеты осуществлялись в камере Богорова, в каждой партии икры просматривалось не менее 100 развивающихся икринок.

г) длину предличинок при вылуплении и при переходе на внешнее питание - под окуляр-микрометром, сразу после фиксации их 4%-ным раствором формалина (n = 50 для каждой самки).

В ходе анализа нами были выделены следующие группы икры в соответствии с ее рыбоводным качеством:

Группа 0 («фоновая» группа), в которой изучались гематологические характеристики производителей в период, предшествующий нерестовой кампании - за 5-20 дней до применения экзогенной стимуляции созревания половых продуктов.

В группах I - VII проведено одновременное изучение крови производителей, получаемой от них икры различного качества и жизнестойкости личинок.

Группа I - «недозрелая» икра. Соответствует подфазе Е1 - незавершенной IV СЗГ. У сазана и карпа характеризуется малым количеством полостной жидкости («густая» икра) и отцеживается малыми порциями. При обесклеивании образует трудно разбиваемые комки.

У растительноядных рыб овариальной жидкости, наоборот, много, икринки мелкие и упругие по тактильным ощущениям.

На контрольных гистологических препаратах и у карпа, и у растительноядных рыб не у всех самок в такой икре отмечен заметный сдвиг ядра к оболочке.

Развитие осемененной икры характеризуется появлением разноразмерных бластомеров, большим количеством уродливых эмбрионов, погибающих задолго до вылупления. Процент оплодотворения низкий, не превышает 50%, процент нормально развивающихся эмбрионов близок к нулю. У сазана и растительноядных рыб вылупившихся предличинок мало.

Группа II и III - «Зрелая икра», соответствующая IV завершенной СЗГ и подфазе Е2 . Отцеживание икры быстрое. После оплодотворения дробление синхронное и равномерное, уродливых эмбрионов мало. К группе II (икра хорошего рыбоводного качества) отнесена икра с процентом оплодотворения 50-70%, высоким процентом нормально развивающихся эмбрионов (80-90%) и близким к нормативному процентом выхода предличинок (от 30 до 60%). В группу III (икра отличного рыбоводного качества) выделена икра с максимальной оплодотворяемостью (более 70%), наиболее высокими показателями нормально развивающихся эмбрионов (от 80% до 100%) и выхода предличинок (более 60%). Группы, следовательно, выделены по отношению к важнейшим рыбоводным характеристикам, выявляемым в ходе инкубации.

Группы IV и V - «постовулярно перезревшая икра» (передержанная в полости тела самки после овуляции при несвоевременном отцеживании). Соответствует IV СЗГ и IV - VI СЗГ. Характеризуется большими и заметно набухшими икринками, среди которых встречаются уже побелевшие, легко деформируемыми при нажатии, Дробление асинхронное, бластомеры разной формы часто отрываются от бластодиска. Процент оплодотворения может быть и низким, и высоким, но из-за множества уродливо развивающихся эмбрионов процент выхода предличинок незначителен (5-10%). К группе IV отнесена икра, сохранившая способность к оплодотворению (подфаза Е2), а к группе V - полностью ее утратившая (подфазы Е3 - F). У сазана и карпа до 10% икринок такую способность сохраняют вследствие асинхронного характера созревания ооцитов и выметывания икры.

В группу VI выделены самки с постовулярно перезревшей икрой, потерявшей способность к оплодотворению и отцеженной у специально отсаженных самок спустя 8 часов после завершения очередного тура инкубации. Аналогично в группе VII такая икра отцежена через 48 часов.

Всего за период исследований полный биологический и биохимический анализ самок, икры и личинок проведен для 95 самок карпа, 123 - белого амура и 167 - пестрого толстолобика, относящихся к местным пользовательным стадам, причем по каждой самке проанализировано свыше 70 параметров (биометрических и физиолого-биохимических). В общей сложности проведено свыше 1800 биохимических анализов. Кроме того, в экспериментальных работах с производителями, завезенными с естественных водоемов, такому же анализу подвергнуты 139 самок сазана и 68 самок пестрого толстолобика, использованных в дальнейшем для искусственного воспроизводства. Гематологическому и биохимическому анализу (определение количества гемоглобина, эритроцитов и лейкоцитов; СОЭ; общего белка, липопротеидов, коллоидоустойчивости сывороточных белков (КСБ) и др.) в общей сложности подвергнуто 36 самок карпа, 30 самок белого амура, 68 самок пестрого толстолобика. При этом применялся метод прижизненного взятия крови (Попов, 1972) и иногда - каудэктомия; в анализе использовались сыворотки без признаков гемолиза.

гемоглобин - по Г.З. Дервизу и А.И. Воробьеву (1960) на фотоэлектроколориметрах ФЭК-56М и КФК-2М;

количество эритроцитов и лейкоцитов - путем просчета в камере Горяева (Голодец, 1955, Кудрявцев и др., 1969; Лабораторные методы…, 1987);

СОЭ - в аппарате Панченкова (Голодец, 1955);

общий белок - по Lowry et all., (1951) и по биуретовой реакции (Биохимические методы…, 1969);

б-липопротеиды и в-липопротеиды - по методике О.Н. Никольской и В.П. Тихонова (1968), основанной на определении их по Бурштейну и Самаи (Биохимические методы…, 1969) - на фотоэлектроколориметрах «Specol», КФК-2М и ФЭК-56М,

КСБ - по ленте Вельтмана (Кычанова, Герфанова, 1981);

общие липиды в сыворотке крови - с сульфофосфованилиновым реактивом (Колб, Калашников, 1976)

фосфоглицериды в сыворотке крови - по Свенбергу и Свеннерхольму (1961) на спектрофотометрах СФ-26 и СФ-4А;

холестерин в сыворотке - методом Илька (I?ca, 1961);

общий фосфор в сыворотке - по Г.А. Грибанову и Г.А. Базанову (1976); кальций - по Де Ваарду (Васильева, 1983).

Общий биохимический состав икры (содержание воды, сухого вещества, белка, липидов, золы) определяли по общепринятым методам. Количество общего белка в икре определяли по Lowry et all., (1951), а в полевых условиях - по биуретовой реакции (Биохимические методы…, 1969); фракционный состав белков - методом электрофореза в блоке 5%-ного полиакриламидного геля (по Г. Мауреру, 1971) в сравнении с параллельной разгонкой белков сыворотки крови человека. Общие липиды определяли по методу Фолча (Folch et all., 1957), а их фракционный состав - методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Si?ufo?» (Сторожук, 1980). Идентификацию фракций липидов проводили по «маркерам-свидетелям», в качестве которых использовались растворы свободного холестерола, смеси пальмитиновой и олеиновой кислот, триолеина как представителя триацилглицеринов (Римш, 1969; Сидоров и др., 1972, 1981). Количество фосфоглицеридов и общего холестерола определяли (в качестве дополнительного метода) по цветным реакциям на спектрофотометре СФ-26 и спектроколориметре «Specol» по Свенбергу и Свеннерхольму (1961) и Ильку (1961) соответственно (Биохимические методы…, 1969). в- липопротеиды в икре - по Бурштейну и Самаи. Количество гликогена определялось по методике М.И. Прохоровой и З.Н. Тупиковой (1965) с антроновым реактивом.

Количественное определение микроэлементов (меди, цинка, кобальта, никеля, марганца) проведено на атомно-абсорбционном спектрофотометре фирмы «Hitachi» модели AAS 180-50. На том же приборе в режиме пламенной фотометрии определено содержание натрия и калия. Магний и марганец в икре определены методом эмиссионного спектрального анализа в модификации В.И. Воробьева (1975).

Опыты по определению выживаемости не питавшихся личинок проводили в кристаллизаторах объемом 1 литр при n = 100 ± 2 штуки для каждой самки. Температура воды и гидрохимический режим в экспериментальных условиях соответствовали условиям инкубации каждого вида. Фиксировалось время гибели 50% и 100% всех не питавшихся личинок (L 50 и L 100) - в часах. Проанализирована выживаемость личинок, полученных от 91 самки карпа и сазана, 61 самки пестрого толстолобика различного происхождения.

Собранный материал обработан статистически по Н.А. Плохинскому (1961) и Г.Ф. Лакину (1990). Линейные корреляции, нелинейные регрессии и оценка силы влияния факторов рассчитаны на ЭВМ ЕС-1020 и ЕС-1022, а также с использованием стандартного пакета программ Microsoft Excel на персональных компьютерах различных типов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Разнокачественность производителей карповых рыб.

3.1. Морфометрические и репродуктивные показатели производителей в условиях искусственного воспроизводства. В условиях ежегодной бонитировки маточных стад при анализе экстерьерных признаков производителей выявлена значительная разнородность маточных стад по основным параметрам - возрасту, массе, длине рыб и ряду индексов. В условиях искусственного воспроизводства при экзогенной стимуляции процессов созревания и овуляции сохраняются общебиологические закономерности - высокодостоверные корреляции массы, длины и рабочей плодовитости с возрастом рыб. Однако высококачественную зрелую икру можно получить от представителей почти всего возрастного ряда, за исключением впервые созревающих рыб - в экологических условиях V и VI зон рыбоводства карп и сазан становятся половозрелыми в возрасте 3-4 лет, белый амур в 5 лет, пестрый толстолобик - в 6 лет (Сборник …, 1986).

Объективным критерием высокого качества самок и отражением их эндогенной разнокачественности может служить рабочая плодовитость - как абсолютная (индивидуальная), так и относительная (рассчитанная на 1 кг массы). Данный показатель является «функцией отклика» организма рыб на экзогенную стимуляцию созревания, зависящей от степени зрелости гонад перед инъецированием и в то же время от реакции собственной нейро-гуморальной системы - то есть от уровня подготовленности к нересту. В различных экологических условиях V и VI зон рыбоводства увеличение рабочей плодовитости ведет к повышению процентов оплодотворения, нормально развивающихся эмбрионов и выхода предличинок, а также длины вылупляющихся предличинок, что особенно ярко выражено у растительноядных рыб. На наш взгляд, такие сильные корреляции являются свидетельством важного значения однородности ооцитов, синхронности их созревания и дружной нерастянутой овуляции - это лишний раз подчеркивает особую роль состояния гонад перед инъецированием. В свою очередь, уменьшение вариабильности диаметра ооцитов может указывать на более или менее равномерное распределение эссенциальных веществ в гонадах, и тотальная овуляция под действием экзогенного стимулирования созревания может охватить максимальное количество яйцеклеток. Дружная единовременная овуляция, по-видимому, является следствием лучшей подготовленности ооцитов к ней, с одной стороны, и оптимальным ответом нейро-гуморальной системы на внешнее стимулирование, с другой. Наибольшая рабочая плодовитость связана с определенной степенью зрелости ооцитов, которые характеризуются завершенностью мейотических преобразований в них и достаточным уровнем накопления структурных и энергетических веществ. Такие данные подчеркивают необходимость отбора в селекционных целях высокоплодовитых самок сазана, карпа, белого амура и пестрого толстолобика.

3.2. Физиолого-биохимические параметры крови. Анализ физиологического состояния рыб по разнообразным параметрам крови показал высокую лабильность многих показателей (табл. 1). Статистический анализ однозначно указывает лишь на чётко отличаемый минимум КСБ (коллоидоустойчивость сывороточных белков) у самок обоих видов, продуцирующих высококачественную икру (II - III группы). Например, у таких самок карпа в крови содержится меньше б- и в-липопротеидов по сравнению с рыбами c недозрелой (I группа) или с постовулярно перезревшей икрой - IV и V групп (Р < 0,05). Хорошо заметные отличия имеются по многим другим характеристикам.

Таблица 1 Гематология самок с икрой различного качества

По коэффициентам корреляции и графикам нелинейной регрессии можно выявить ряд параметров крови, связанных с качеством получаемой икры. Такими следует считать прежде всего показатели системы эритрона (красной крови) - концентрацию гемоглобина и эритроцитов. При увеличении концентрации этих показателей у самок возрастает оплодотворяемость и процент выхода, уменьшается количество уродливых эмбрионов. Это особенно заметно у пёстрого толстолобика, где все коэффициенты корреляции статистически достоверны и сохраняются в течение всего эмбрионального развития. Показателем, отрицательно связанным с ходом инкубации, являются высокие значения КСБ у обоих видов, а у карпа, кроме того, уровень общих липидов, б- и в-липопротеидов и общего кальция. У обоих видов с процентом оплодотворения достоверно связан уровень свободного холестерола в сыворотке крови (r ху = +0,45 для карпа и +0,67 для пёстрого толстолобика), что согласуется с литературными данными для карпа и белого толстолобика (Баденко и др., 1986, Корниенко, Дорошева, 1986).

Далеко не во всех литературных источниках указывается момент взятия крови относительно времени овуляции и отцеживания половых продуктов. Если брать кровь перед экзогенной стимуляцией созревания и овуляции (обычно это делается за несколько суток до инъецирования), то получаемая при этом информация о динамике гематологических показателей будет отражать степень готовности к нересту у рыб, находящихся в IV незавершенной или IV завершенной СЗГ, но не ход эмбрионального развития и не параметры жизнестойкой молоди. Это обусловлено следующими обстоятельствами: как известно, в период между инъекциями происходит переход яйцеклеток сначала в IV завершенную СЗГ и далее в V СЗГ (Ю.К. Кузнецов, 1972). Одновременно происходят и существенные изменения в физиологическом состоянии производителей и мобилизация всех энергетических и пластических резервов в организме, что не может не отражаться на показателях крови. При таком выборе времени для отбора проб крови целесообразно сопоставлять гематологические характеристики с цитологическими (в частности, со степенью поляризации ядра) и лишь с определенной долей вероятности - с оплодотворяемостью икры. Если же необходимо сопоставление гематологических параметров с качеством получаемых половых продуктов и ходом эмбрионального развития, то прижизненное взятие проб крови осуществляем максимально приближенным к моменту отцеживания икры и спермы и искусственного осеменения. Только в этом случае достигается согласование всех параметров разносторонней оценки качества производителей, овулировавшей икры, развивающихся эмбрионов и личинок.

По совокупности графиков нелинейной регрессии, отражающих взаимосвязи разнообразных параметров крови с показателями развивающейся икры, мы приходим к представлению о «гематологическом оптимуме» для карпа и пестрого толстолобика - комплексе характеристик, соответствующих наибольшим значениям оплодотворяемости, процента нормально развивающихся эмбрионов (НРЭ) и выхода предличинок, т.е. к понятию «нормы» для конкретных экологических условий и существующей биотехники искусственного воспроизводства (Залепухин, 2006). Таким образом, и у карпа, и у пестрого толстолобика можно выделить ряд физиолого-биохимических параметров крови, пригодных для оценки качества производителей в условиях искусственного воспроизводства (табл. 2 и 3). Все они отражают эндогенную разнокачественность половозрелых рыб, используемых для разведения, и взаимосвязи гематологических показателей с ходом эмбрионального развития

Таблица 2 Показатели крови карпа, соответствующие максимальным рыбоводным показателям

* - превышение нормативного выхода.

Таблица 3 Физиолого-биохимические параметры крови самок ПТ, соответствующие максимальным рыбоводным показателям

*- при бульших значениях процент выхода опускается ниже нормативного;

**- при любых значениях нормативный процент выхода не достигается.

По коэффициентам корреляции нам удалось выявить позитивные взаимосвязи рабочей плодовитости самок с параметрами гемоглобина и эритроцитов: у карпа r xy равны +0,68 ч +0,71, у пестрого толстолобика +0,36 ч +0,39. Это означает, что лучшую по качеству икру продуцируют самые плодовитые самки с высокой интенсивностью обменных процессов - максимальная плодовитость требует обеспечения созревающих и овулирующих яйцеклеток кислородом и жизненно необходимыми веществами. В то же время высокий уровень белка в сыворотке крови свидетельствует о нормальном физиологическом состоянии рыб и наличии определенного резерва пластического материала в организме производителей, что отражается на качестве овулировавшей икры и ее биохимическом составе (см. главу 4). Пониженный уровень белка указывал бы на истощение рыб, что можно связать с нарушениями биотехники преднерестового содержания - например, отсутствием подкормки.

Кроме того, на примере белого амура показано, что постовулярное перезревание и резорбция яйцеклеток существенно и достаточно быстро (за 8-48 часов) ухудшают физиологическое состояние рыб, о чем сигнализируют различные параметры крови (гемоглобин, лейкоциты, СОЭ) и внешние признаки (вялость рыб, побледнение жабр и др.), свидетельствующие о развивающейся анемии.

В отличие от естественного размножения, возраст рыб имеет лишь ориентировочное значение при оценке качества производителей. Почти во всех случаях статистический анализ показывает невысокие и недостоверные корреляции между возрастом и рыбоводными характеристиками инкубации. Лишь по графикам нелинейной регрессии можно выявить тенденцию улучшения показателей инкубации и выживаемости личинок с возрастом самок и у сазана, и у растительноядных рыб (см. главу 5).

Глава 4. «Оценка качества половых продуктов при экзогенном стимулировании созревания». В триаде объектов нашего исследования наибольшее значение принадлежит качеству половых продуктов, ибо именно в них реализуются изменения обмена веществ производителей в период гаметогенеза, созревания и нереста. При искусственном разведении отличительной особенностью карпа и растительноядных рыб является быстрая потеря способности икры к оплодотворению - за 0,5 - 1,5 часа. Качество получаемой икры оказывает существенное влияние на количественные характеристики выживаемости эмбрионов в период инкубации и не питающихся личинок. Именно поэтому возникает необходимость перехода к оценке икры по биохимическим показателям, которые дают более точную информацию о способности к оплодотворению и нормальному развитию.

4.1. Разнокачественность самцов и их половых продуктов. Использование для искусственного осеменения высококачественной спермы трех-шести самцов не только увеличивает внутривидовую гетерогенность потомства, усиливая тем самым генетический полиморфизм популяций, но и сводит к минимуму возможность негативного влияния недоброкачественной спермы на индивидуальное развитие. Полученные нами данные по объему эякулята, концентрации и продолжительности движения спермиев сопоставимы с результатами других исследователей в различных экологических условиях и в разных зонах рыбоводства (Попова, 1968, Белова, 1981а, б; Пронин, 1981, Жукинский, Вовк, 1986, и др.).

4.2. Морфология и развитие разнокачественной икры. Анализ биометрических показателей овулировавших икринок в V и VI зонах рыбоводства показал наличие ряда закономерностей, свойственных икре различного качества:

- недозрелая икра всех видов имеет наименьший диаметр и наименьшую среднюю массу икринок;

- доброкачественная зрелая икра имеет, как правило, достоверные отличия по диаметру и массе в сравнении с недозрелой икрой;

- постовулярное перезревание икры сопровождается увеличением диаметра икринок, что связано с интенсивной гидратацией;

- плотность икринок у всех трех видов уменьшается в ряду: недозрелая икра, зрелая, перезрелая;

- с ухудшением качества икры растет вариабильность диаметра овулировавших яйцеклеток.

Корреляционный анализ показал высокодостоверные зависимости средней массы икринок от возраста и массы самок: для сазана r xy = +0,745 и +0,432 соответственно, для белого амура +0,660 и +0,438, для пестрого толстолобика +0,497 и +0, 331. Однако только для сазана, сохраняющего в условиях Нижневолжского региона асинхронность созревания и субпорционность выметывания ооцитов, установлена статистически достоверная связь между массой овулировавших икринок и процентом оплодотворения (r xy = +0,539 при Р < 0,01), а также длиной вылупляющихся эмбрионов (r xy = +0,592 при Р < 0,01), чего у других видов не наблюдается. Только у толстолобика выявлена положительная корреляция между упитанностью самок и средней массой икринок (r xy = +0,37 при Р < 0,05), у сазана и белого амура такие связи отрицательны и недостоверны.

Высококачественная икра у изученных видов набухает лучше, чем недозрелая или перезрелая, что подтверждается сильными достоверными корреляциями между величиной диаметра набухших икринок и показателями инкубации в условиях Астраханской области:

Примечания: в корреляционных таблицах при n = 30 ч 41 Р 0,05 > 0,33; Р 0,01 > 0,42.

Такие же достоверные зависимости для диаметра набухшей икры выявлены и в условиях Волгоградской области для украинского карпа и пестрого толстолобика (см.: Залепухин, 2006). Столь сильные корреляции отражают особенности целого ряда биологических процессов: механизмов образования перивителлинового пространства при оплодотворении (Зотин, 1961, Гинзбург, 1968), усиления газообмена зародыша (Соин, 1977) и эмбриональной моторики (Резниченко, 1982), возможности утилизации из водной среды жизненно важных для развития органических и неорганических веществ (Владимиров, 1974, Воробьев, 1979). По нашим данным, у сазана и растительноядных рыб выявлены зависимости диаметра набухшей икры от диаметра и плотности овулировавших икринок и ряда биохимических параметров, связанных с проницаемостью мембран (коэффициента Дьерди, соотношения «натрий / калий», холестерина). Очевидно, что сочетание таких условий, связанное с интенсивным набуханием икринок, благоприятна для развивающихся эмбрионов и обеспечивает их лучшую выживаемость.

У всех видов в ходе эмбрионального развития постовулярно перезревшей икры наблюдаются различные аномалии, считающиеся проявлениями эндогенной разнокачественности (Жукинский, Недялков, 1980, и др.). Их наличие объясняют реализацией морфо-физиологических дефектов, возникающих в период, когда разнокачественная икра находится на начальных этапах дегенерации, но сохраняет способность к оплодотворению (IV группа). Чаще всего встречались:

1) нарушения дробления (несимметричное расположение бластомеров на бластодиске и отрыв отдельных бластомеров от него) - по визуальным наблюдениям, до 80% случаев;

2) аномалии гаструляции (неравномерное обрастание желтка бластодермой и неправильная форма желточной пробки);

3) нарушения сегментации тела (искривление осевого скелета, деформация различных частей и непропорциональное развитие отдельных частей зародыша);

4) водянка либо некроз желточного мешка (на этапах развития, близких к вылуплению).

Арбитражным методом при анализе качества икры нам послужило определение рыбоводных показателей инкубации: процента оплодотворения, процента нормально развивающихся эмбрионов (НРЭ) и процента выхода предличинок, а дополнительными характеристиками - степень набухания икры и наличие аномалий развития. Подсчет соотношения нормально и уродливо развивающихся эмбрионов необходим при анализе различных нарушений развития, в частности, возникающих при постовулярном презревании. На долю аномалий дробления приходится подавляющая часть видимых нарушений эмбрионального развития, и в дальнейшем отход зародышей не представляет значительных величин.

У всех изученных видов между рыбоводными показателями инкубации существует достаточно тесная взаимосвязь (рис. 2-4 - на примере украинского карпа). Аналогичные зависимости получены и для остальных видов: сазана, белого амура, «прудовых» и «речных» самок пестрого толстолобика. Их существование показывает, что в большинстве случаев определение процента оплодотворения дает достаточно точную оценку качества овулировавшей икры, полученной после экзогенного стимулирования созревания. Уловить взаимосвязь между физиолого-биохимическими параметрами икры и причинами элиминации эмбрионов удавалось ранее только при использовании высокоточных методов анализа активности ферментов (Жукинский, Гош, 1979, Гош, 1986, и др.).

Рис. 2 Взаимосвязь между процентом НРЭ и процентом оплодотворения икры украинского карпа (R = 0,71 при Р < 0,01)

Рис. 3 Взаимосвязь между процентом выхода и оплодотворяемостью икры украинского карпа (R = 0,66 при Р < 0,01)

33

Рис. 4 Взаимосвязь между % выхода и % НРЭ у украинского карпа (R = 0,94 при Р < 0,01)

4.3. Биохимический состав разнокачественной икры. С качеством икры, полученной после гипофизарных инъекций, связаны многие биохимические показатели. Так, у всех видов, выросших и обитающих в различных экологических условиях, недозрелая икра (I группа) характеризуется наименьшей обводненностью, относительно низким уровнем белка и липидов, но более высоким содержанием минеральных элементов по сравнению со зрелой икрой (II и III группы). Постовулярно перезревшая икра (IV и V группы) имеет наименьший уровень общего белка и наибольшее содержание воды (рис. 5) - даже при незначительной передержке икры в полости тела самок после овуляции начинаются интенсивный протеолиз и гидратация. Количество липидов в икре может увеличиться или уменьшиться, что обусловлено общим уровнем жиронакопления и энергетическими тратами в ближайший преднерестовый период. Отмечены также существенные межсезонные отличия по содержанию общих липидов (до 30%). У всех видов в овулировавшей икре при постовулярном перезревании возрастает уровень свободных жирных кислот.

У сазана нам не удалось выявить ни одного биохимического показателя, достоверно связанного с показателями инкубации. У растительноядных рыб таким является содержание общего белка в овулировавшей икре: наибольшее его количество (свыше 20 г% в расчете на сырую массу) свойственно икре лучшего рыбоводного качества, что подтверждается достоверными корреляциями с процентом оплодотворения (r xy = +0,516 у белого амура и +0,382 у пестрого толстолобика), процентом НРЭ (+0,461 и +0,370 соответственно), процентом выхода предличинок (+0,490 и +0,381).

Электрофоретический анализ белков овулировавшей икры всех видов и сравнение белковых спектров с сывороткой крови человека и препаратов сывороточного альбумина и овальбумина позволил нам выделить от 3 до 5 фракций: гамма-глобулин, в-3-глобулин, в-2-глобулин, в-1-глобулин и альбумин, причем две последних фракции ...