Молекулярно-генетичні та біохімічні фактори формування фенотипу пацієнтів з хворобою Гоше І типу

nolhovich@gmail.com

Анотація

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНІ ТА БІОХІМІЧНІ ФАКТОРИ ФОРМУВАННЯ ФЕНОТИПУ ПАЦІЄНТІВ З ХВОРОБОЮ ГОШЕ І ТИПУ

Ольхович Н. В., Россоха З. І., Пічкур Н. О., Попова О. Ф., Горовенко Н. Г.

Резюме. Хвороба Гоше (ХГ) це спадкове аутосомно-рецесивне захворювання, яке спричинене порушенням функції однієї з лізосомних гидролаз глюкоцереброзидази (ЕС 3.2.1.45). Хвороба Гоше І типу (ненейронопатична) представляє собою найпоширенішу форму захворювання, яка не асоціюється з неврологічною маніфестацією, але представлена широким спектром клінічної презентації, основними ознаками якої є гепатоспленомегалія, цитопенія та кісткові ураження. В нашій роботі було проведено дослідження біохімічних та молекулярно-генетичних маркерів, які можуть бути використані для оцінки ризику підвищення тяжкості перебігу хвороби Гоше І типу, тому представляють собою потенційні інструменти для поліпшення існуючої терапії. Було показано, що активність хітотриозидази, рівень неоптерину та оксидованих протеїнів в плазмі крові можуть бути критеріями оцінки активності патологічного процесу у пацієнтів і відображати ступінь ураження органів і систем, тоді як рівень загальних глютатіонтрансфераз з цією метою використовувати недоцільно. Крім того, було показано, що наявність делеційного поліморфізму гена GSTM1 та носійство алеля 3953T в гені IL1b можуть використовуватись як окремо, так і у поєднанні один з одним, для прогнозування ризику розвитку ускладнень при хворобі Гоше І типу.

Ключові слова: хвороба Гоше, хітотриозидаза, неоптерін, оксидовані протеїни, гени GSTM1, GSTT1, IL1b, IL8.

хвороба гоше кістковий патологічний

Аннотация

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ФЕНОТИПА ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ГОШЕ І ТИПА

Ольхович Н. В., Россоха З. И., Пичкур Н. А., Попова Е. Ф., Горовенко Н. Г.

Резюме. Болезнь Гоше (ХГ) это наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, которое вызвано нарушением функции одной из лизосомных гидролаз глюкоцереброзидазы (ЕС 3.2.1.45).

Болезнь Гоше I типа (ненейронопатическая) представляет собой самую распространенную форму заболевания, которая не ассоциируется с неврологической манифестацией, но представлена широким спектром клинической презентации, основными признаками которой являются гепатоспленомегалия, цитопения и костные поражения.

В нашей работе было проведено исследование биохимических и молекулярно-генетических маркеров, которые могут быть использованы для оценки риска повышения тяжести течения болезни Гоше I типа, поэтому представляют собой потенциальные инструменты для улучшения существующей терапии.

Было показано, что активность хитотриозидазы, уровень неоптерина и оксидированных протеинов в плазме крови могут быть критериями оценки активности патологического процесса у пациентов и отражать степень поражения органов и систем, тогда как уровень общих глютатион^-трансфераз с этой целью использовать нецелесообразно. Кроме того, было показано, что наличие делеционного полиморфизма гена GSTM1 и носительство аллеля 3953T в гене IL1b могут использоваться как отдельно, так и в сочетании друг с другом, для прогнозирования риска развития осложнений при болезни Гоше I типа.

Ключевые слова: болезнь Гоше, хитотриозидаза, неоптерин, оксидированные протеины, гены GSTM1, GSTT1, IL1b, IL8.

Annotation

MOLECULAR-GENETIC AND BIOCHEMICAL FACTORS INFLUENCING THE PHENOTYPE OF GAUCHER DISEASE PATIENTS

Olkhovych N. V., Rossoha Z. I., Pichkur N. A., Popova E. F., Gorovenko N. G.

Abstract. Gaucher disease (GD) is a hereditary autosomal-recessive disorder, caused by the functional deficiency of one of lysosomal hydrolases glucocerebrosidase (EC 3.2.1.45). Type I Gaucher disease (nonneuronopathic) is the most common form, not associated with neurological manifestation, but present in a wide spectrum of clinical signs, the main ones being hepatosplenomegaly, cytopenia and bone system abnormalities. The severity of clinical signs of this disease and the age of the disease onset vary from practically asymptomatic cases to severe disabling conditions, when secondary hematological and bone changes lead to high prevalence of complications and often result in the death of patients. Taking into consideration the fact that the clinical course of Gaucher disease is conditioned by a whole number of pathogenic mechanisms of the cell response to the accumulation of glucocerebrosidase, the key role among which is played by chronic inflammation and oxidative stress, the individual specificities of such response are different for different organisms, which is caused by both genetic, epigenetic and environmental factors. The blood samples of patients, who are suffering from Gaucher disease and have been found to have genotypes р.N409S/р.N409S, р.N409S/р.L483P and р.N409S/р.R159W in the GBA gene, served as the study material. To estimate the factors, which may influence the development of the clinical course of the disease, our study involved the investigation of the level of secondary biochemical markers of intracellular pathological processes, activated in response to the primary biochemical deficiency as well as genetic factors, impacting the intensity of this response.

It was established that there was a difference in the biochemical phenotype of patients with a different severity rate of Gaucher disease but the identical genotype. It was demonstrated that the activity of chitotriosidase, the level of neopterin and oxidized proteins in blood plasma may serve as criteria of evaluating the activity of the pathological process in patients and reflect the degree of damage of organs and systems, whereas it is unreasonable to use the level of general glutathione-S-transferases for this purpose. In addition, it was demonstrated that the availability of the deletion polymorphism of the GSTM1 gene and the presence of allele 3953T in the IL1b gene may be used both separately and in combination with one another to predict the risk of developing complications of type I Gaucher disease. But the highest risk of complications may be predicted in patients with the triple combination of the deletion polymorphism of the GSTM1gene, the presence of allele 3953T in the IL1b gene and the presence of allele 781Т in the IL8 gene. These data may be used while planning pathogenic and symptomatic therapeutic measures for patients, suffering from Gaucher disease, conditioned by genotypes р.N409S/р.N409S, р.N409S/р.L483P and р.N409S/р. R159W in the GBA gene, with the purpose of enhancing treatment efficiency and improving the quality of patients' life.

Keywords: Gaucher disease, chitotriosidase, neopterin, oxidized proteins, genes GSTM1, GSTT1, IL1b, IL8.

Вступ

Представлена робота є фрагментом НДР «Оцінка ролі генетичних факторів у формуванні та перебігу лізосомних хвороб накопичення для оптимізації клінічної та лабораторної діагностики цих захворювань» і виконана на базі ДУ «ІГРМ НАМН України», № державної реєстрації 0115U003006.

Хвороба Гоше (ХГ) це спадкове аутосомно-рецесивне захворювання, яке спричинене порушенням функції однієї з лізосомних гидролаз глюкоцереброзидази (ЕС 3.2.1.45) [19]. Недостатня активність цього ферменту призводить до внутрішньолізосомного накопичення глюкозилцераміду в клітинах організму, перш за все у вісцеральних макрофагах. Клінічно виділяють 3 типи ХГ на підставі наявності та ступеня прогресування неврологічних уражень. Усі три типи зазвичай маніфестують гепатоспленомегалією з накопиченням глікозилцераміду у макрофагах печінки, селезінки, лімфатичної тканини та кісткового мозку [7].

Хвороба Гоше І типу (ненейронопатична) представляє собою найпоширенішу форму захворювання, яка не асоціюється з неврологічною маніфестацією, але представлена широким спектром клінічної презентації, основними ознаками якої є гепатоспленомегалія, цитопенія та кісткові ураження. Хвороба Гоше ІІ типу гостра нейронопатична є найрідкіснішою і характеризується тяжкими прогресуючими неврологічними порушеннями, які можуть маніфестувати раніше, ніж ураження вісцеральних органів, і призводять до летального наслідку протягом перших двох років життя. До ІІІ-го хронічного нейронопатичного типу хвороби Гоше відносять всі випадки захворювання з будь-якими неврологічними проявами, які не призвели до ранньої смерті.

Характерною особливістю спадкових метаболічних захворювань взагалі, і ХГ зокрема, є широкий клінічний поліморфізм. Тяжкість клінічних проявів симптомів та вік початку захворювання широко варіюють від практично асимптоматичних випадків до тяжких інвалідизуючих станів, при яких вторинні гематологічні та кісткові зміни призводять до високої частоти ускладнень, а нерідко і до смерті пацієнтів [6]. Така широка варіабельність клінічних проявів захворювання і тяжкості перебігу спостерігається навіть серед пацієнтів з однаковим генотипом [11]. Більше того, існують клінічні дефекти, які представляють собою вторинні ураження, що можуть бути незалежні від ступеня внутрішньолізосомного накопичення метаболітів [7].

Зважаючи на те, що клінічна картина хвороби Гоше обумовлена цілим каскадом патогенетичних механізмів відповіді клітини на накопичення глюкоцереброзиду, ключову роль серед яких відіграють хронічне запалення та оксидативний стрес, індивідуальні особливості такої відповіді у кожного організму різні, що обумовлено як генетичними, так і епігенетичними і середовищними факторами [12]. Так, відомо, що ферменти родини глютатіонS-тренсфераз (GST) являються важливою ланкою антиоксидантного захисту клітинного рівня через здатність інактивації вільних радикалів і активних похідних кисню [14]. їх наявність та функціональний стан можуть впливати на чутливість клітин до оксидативного стресу і, як наслідок, відігравати певну роль у патогенезі розвитку клінічної картини у конкретної особи. Активовані макрофаги, не дивлячись на накопичення глюкоцереброзиду, залишаються метаболічно активними і продукують велику кількість прота антизапальних медіаторів, запускаючи вроджену імунну відповідь і активуючи механізм хронічного запалення [9]. Кількість і функціональний стан цих медіаторів також впливають на інтенсивність запального процесу і, як наслідок, тяжкість перебігу захворювання. Таким чином, генетичні фактори, які не є первинно детермінуючими розвиток хвороби Гоше у пацієнта, але обумовлюють особливості вторинної відповіді клітини на накопичення патологічного субстрату, можуть бути тими факторами, що спричинюють клінічний поліморфізм захворювання.

Метою нашої роботи було дослідження біохімічних та молекулярно-генетичних маркерів, які можуть бути використані для оцінки ризику підвищення тяжкості перебігу хвороби Гоше І типу, тому представляють собою потенційні інструменти для поліпшення існуючої терапії.

Об'єкт і методи досліджень. Матеріалом для дослідження були зразки крові пацієнтів з хворобою Гоше, у яких було виявлено генотипи р.N409S/р. N409S, р.N409S/р.L483P та р.N409S/р.R159W в гені GBA. Діагностика хвороби Гоше і визначення генотипу проводилась в лабораторії медичної генетики НДСЛ «Охматдит» МОЗ України. Ступінь тяжкості прояву захворювання визначали згідно індексу тяжкості (SSI), запропонованому Zimran et al. [22].

Активність глютатіон-S-трансферази загальної проводили в плазмі крові за допомогою відповідних комерційних наборів реагентів (вир-во Sigma) відповідно до протоколу виробника.

Хітотриозидазну активність в плазмі крові оцінювали за деградацією флуорогенного субстрату 22 мкМ 4-МУФ-тріацетилхітотриозид (Sigma) в цитрат-фосфатному буфері рН 5,2 за стандартною методикою [1]. Результати наводили у нмоль/год/мл плазми.

Вміст неоптерину в плазмі крові оцінювали методом ВЕРХ за методом, описаним Blau et al. [8].

Рівень оксидативно-модифікованих протеїнів оцінювали шляхом визначення карбонільних груп за реакцією з динітрофенілгідразином (ДНФГ), як описано Mello et al. [20].

Виділення препаратів ДНК з крові хворих та ампліфікацію здійснювали з використанням комерційних наборів реагентів виробництва Неоген (Україна).

Алельний поліморфізм GSTT1 та GSTM1 генів GSTs визначали за допомогою мультиплексної полімеразної ланцюгової реакції [13]. Для визначення поліморфних варіантів генів IL-1$ C3953T(rs1143634 ) та IL-8 C781T (rs2227306) використовували модифіковані протоколи з олігонуклеотидними праймерами із застосуванням методу ПЛР та наступним аналізом поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) [18].

Ампліфіковані фрагменти розподіляли з використанням горизонтального електрофорезу в 1,5% агарозному гелі із забарвленням бромистим етидієм. Візуалізацію та подальше архівування отриманих ампліконів здійснювали за допомогою відеосистеми Vitran.

Статистичний аналіз одержаних результатів проводили з використанням пакету статистичних програм Statistica 10.0. Розподіл значень біохімічних досліджень аналізували з використанням тесту Колмогорова-Смірнова, порівняння середніх значень здійснювали за допомого одномірного ANOVA тесту з використанням непараметричного критерію МанаУітні U. Аналіз впливу молекулярно-генетичних факторів ризику на клінічний фенотип оцінювали з використанням стандартних критеріїв хі-квадрат (хІ), Фішера та показника відношення шансів Odds Ratio (OR) з 95% довірчим інтервалом.

1. Результати дослідження та їх обговорення

Хвороба Гоше це спадкове метаболічне захворювання, при якому спостерігаються прогресуючі мультиорганні клінічні прояви. Показано, що клінічний перебіг захворювання і, навіть, реакція на ФЗТ у пацієнтів з ХГ має достатньо широку варіабельність навіть у хворих з однаковим генотипом [3]. Це спостереження дозволяє припустити, що існують хвороба-залежні зміни, які неможливо пояснити лише наслідками внутрішньоклітинного накопичення глюкоцереброзиду. Фундаментальні молекулярно-генетичні дослідження істотно змінили і конкретизували уявлення про структуру генів, взаємини ген-білок, ген-ознака і генотип-фенотип, що має не тільки теоретичне, а і прикладне значення для трактування клінічного, біохімічного і морфологічного фенотипу хворих. Таким чином, виявлення генетичних маркерів, які ймовірно призводять до виникнення вторинних патологічних змін, є на сьогодні пріоритетним напрямком наукових досліджень.

Ген глюкоцереброзидази (GBA) знаходиться на довгому плечі першої хромосоми в локусі 1q21 та має довжину майже 7,5 т.п.н. [7]. За даними Human Genome Mutation Database (http://www.hgmd.cf.ac. uk), на сьогодні описано близько 300 мутацій в гені GBA, пов'язаних з розвитком хвороби Гоше. У пацієнтів з ХГ в європейському регіоні найчастіше (близько 70% випадків) зустрічаються місенс-мутації р.N409S та р^483Р [16]. У пацієнтів з хворобою Гоше з України (63 особи) найчастіше хвороба була викликана саме цими двома замінами, а також заміною р.R159W (сумарна частота 54,8%), що обумовило три найрозповсюдженіші генотипи р.N409S/р.N409S у 5 хворих, р.N409S/р.L483P у 13 хворих та р.N409S/р.R159W у 5 хворих. Саме в цих трьох групах пацієнтів було проведено нами дослідження клінічної, біохімічної та генетичної гетерогенності фенотипу.

Як видно з даних, наведених у таблиці 1, клінічні прояви захворювання та вік його маніфестації у пацієнтів в межах груп з однаковим генотипом значно варіював. Так, у трьох пацієнтів з генотипом р.N409S/р.

N409S хвороба маніфестувала на першому 10-річчі життя і на момент встановлення діагнозу мала середню ступінь тяжкості (SSI < 7), обумовлену, перш за все, наявністю кісткових болей вираженою органомегалією. Тоді як у двох пацієнтів (пацієнти 3 та 4) з таким же генотипом захворювання маніфестувало значно пізніше і на момент встановлення діагнозу не супроводжувалось кістковими болями, внаслідок чого хвороба була класифікована як легка (SSI=4). Більшість пацієнтів з генотипом р.N409S/р.L483P (9 із 13-ти) мали середню ступінь тяжкості захворювання на момент встановлення діагнозу (SSI < 7), тоді як четверо (пацієнти 9, 16, 17 і 18) демонстрували більш виражену органомегалію і тяжкі ураження кісткової системи, в тому числі ознаки аваскулярного некрозу, що спричинювали патологічні переломи кісток.

Таблиця 1 Клінічна, біохімічна та молекулярно-генетична характеристика пацієнтів з хворобою Гоше

Таблиця 2 Розподіл алельних поліморфізмів генів IL1b і IL8 у хворих з «легшим» та «тяжкішим» перебігом хвороби Гоше