Інтенсивність процесів ліпопероксидації у сперматозоїдах чоловіків із порушенням фертильності

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інтенсивність процесів ліпопероксидації у сперматозоїдах чоловіків із порушенням фертильності

Фафула Р.В.

Онуфрович О.К.

Єфремова У. П.

Наконечний Й.А.

Воробець З.Д.

Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького (м. Львів)

Резюме

Вивчено інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів у сперматозоїдах неплідних чоловіків із різними формами патоспермій та досліджено кореляційний зв'язок між вмістом вторинних продуктів ліпопероксидації (ТБК-позитивних продуктів) та основними показниками сперматограм. Виявлено значне підвищення вмісту ТБК-позитивних продуктів за умов патоспермії. Виявлені тісні кореляційні зв'язки між вмістом ТБК-позитивних продуктів і ступенем вираженості морфофункціональних змін за умов патоспермії.

Ключові слова: пероксидне окиснення ліпідів, ТБК-позитивні продукти, непліддя у чоловіків, сперматозоїди.

Резюме

Изучены интенсивность процессов перекисного окисления липидов в сперматозоидах бесплодных мужчин с различными формами патоспермий и исследована корреляционная связь между содержанием вторичных продуктов липопероксидации (ТБК-положительных продуктов) и основными показателями сперматограмм. Выявлено значительное повышение содержания ТБК-положительных продуктов в условиях патоспермии. Обнаружены тесные корреляционные связи между содержанием ТБК- положительных продуктов и степенью выраженности морфофункциональных изменений в условиях патоспермии.

Ключевые слова: перекисное окисление липидов, ТБК-положительные продукты, бесплодие у мужчин, сперматозоиды.

Abstract

It is well known that an imbalance between the activity of prooxidant and antioxidant systems leads to the accumulation of products of free radical peroxidation and development of oxidative stress, which is a potential precondition for the development of pathologies of different genesis. One of the most sensitive markers of lipid peroxidation and oxidative stress are thiobarbituric acid reactive substances (TBARS).

Oxidative stress of sperm cells is closely related to the disturbances in their spermatogenesis, motility, acrosomal reaction and process of sperm-egg interaction which leads to significative reduction of fertility potential.

The aim of present paper was to examine the intensity of lipid peroxidation processes in sperm cells of infertile men with different forms of pathospermia and to determine correlations between TBARS content and the nature of the pathological process.

The data of 72 men aged 21-39 years with infertility under conditions pathospermia were analyzed. All patients were divided into 4 groups: patients with oligozoospermia, astenozoospermia, oligoastenozoospermia and leukocytospermia. The intensity of lipid peroxidation processes in sperm cells was evaluated by accumulation secondary products of lipid peroxidation.

The statistically significant increase in TBARS content in sperm cells of infertile men compared with men with preserved fertility was found.

A significant increase in TBARS content as secondary products of lipid peroxidation indicates an intensification of free radical processes. This is due to the increased level of reactive oxygen species or inhibition of the antioxidant defense system.

As a result of the correlation analysis we found an inverse correlations between TBARS content in spermatozoa in infertile men and the number of sperm cells in the ejaculate, their motility, which indicates direct pathogenetic link between the level of lipid peroxidation and decrease in fertility potential. However, we have not found a clear correlation between TBARS content in sperm cells and the number of leukocytes in the ejaculate of patients with leukocytospermia. These results indicate a clear correlation between the intensity of free radical processes in sperm cells of infertile men and the changes in their morphological and functional characteristics.

Determination of TBARS can be a useful diagnostic tool for determining potential fertility of sperm cells and can have practical implications for the treatment of male infertility, particularly in idiopathic cases.

Keywords: lipid peroxidation, thiobarbituric acid reactive substances, male infertility, sperm cells.

Робота є фрагментом НДР Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького «Дослідження функціонально-метаболічних резервів стрес-лімітуючих систем організму за екстремальних умов з метою виявлення ефективних способів їх корекції», № державної реєстрації 0111U000121.

Стаття містить результати досліджень НДР «Молекулярно-біологічні регуляторні механізми порушення запліднювальної здатності сперматозоїдів і розробка нових імунобіохімічних методів діагностики фертильності у чоловіків», проведених за грантом Президента України (розпорядження № 97/2016-рп від 13.04.2016).

Загальновідомо, що порушення балансу між активністю прооксидантних чинників та ефективністю систем антиоксидантного захисту призводить до накопичення продуктів вільнорадикаль- ного пероксидного окиснення (вільних радикалів та активних форм кисню) та розвитку оксидативного стресу, який є потенційною передумовою у розвитку патологій різного ґенезу [3,4,21]. Відомо, що продукти вільнорадикального пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) виступають біомаркерами ушкодження, оскільки за їх вмістом можна оцінити інтенсивність перебігу вільнорадикальних процесів. Первинні продукти ПОЛ є речовинами нестійкими, які досить швидко руйнуються з утворенням вторинних стабільних продуктів ліпопероксидації. Серед них одним із найбільш чутливих маркерів пероксидного окиснення ліпідів та оксидативного стресу є малоно- вий діальдегід (МДА) - продукт окиснення полінена- сичених жирних кислот, який утворюється в результаті їх деградації активними формами кисню (АФК). Також, актуальність вивчення вільнорадикальних процесів обумовлена їх важливою патогенетичною роллю як потужного фактора мембранодеструкції та розвитку мебранопатій.

Сперматозоїди особливо чутливі до гіпероксидації внаслідок наявності в складі їх мембран високої концентрації поліненасичених жирних кислот і через неможливість репарації ДНК.

Поліненасичені жирні кислоти є головними мішенями процесів гі- пероксидації, які ведуть до зниження в'язкості та інших структурних перебудов спермальних мембран [10,14]. Оксидативний стрес сперматозоїдів тісно пов'язаний із порушенням їх сперматогенезу, рухливості, акросомної реакції та процесу взаємодії сперматозоїд-яйцеклітина, що веде до зниження їх фертилізаційної здатності.

Рис. 1. Вміст ТБК-продуктів в сперматозоїдах неплідних чоловіків із різними формами патоспермій

сперматозоїд непліддя ліпопероксидація патологічний

Мета дослідження - вивчити інтенсивність процесів пероксидного окиснення ліпідів у сперматозоїдах неплідних чоловіків із різними формами патоспермій та визначити кореляційні зв'язки між їх вмістом і характером патологічного процесу.

Об'єкт і методи дослідження. Проаналізовано дані 72 чоловіків, що проходили первинне обстеження у зв'язку з непліддям у консультативній поліклініці Львівської обласної клінічної лікарні в період 20142016 роки. Середній вік пацієнтів становив 26,2±4,2 років. Критерії включення: вік 21-39 років, неплідність у шлюбі 1-10 років, чоловічий фактор неплідності за умов олігозооспермії або астенозооспермії. Критерії виключення: неплідність у шлюбі понад 10 років, азооспермія, надмірне вживання алкоголю і вплив будь-яких шкідливих фізико-хімічних чинників під час діагностично-лікувальних заходів.

Усіх пацієнтів було розділено на 4 групи. За показниками спермограм олігозооспермія була виявлена у 12 пацієнтів (16,7%), які увійшли в 1-шу групу, астенозооспермія у 17 пацієнтів (23,6%), що склали 2-гу групу, олігоастеноспермія у 10 пацієнтів (13,9%), які увійшли в 3-тю групу. У 39 (54,2%) обстежуваних неплідних чоловіків вміст лейкоцитів у спермі складав <1,0-106 /мл, лише у 33 (45,8%) пацієнтів відзначалася лейкоцитоспермія, тобто вміст лейкоцитів коливалося від 1,0-106 /мл до 3,0-106 / мл, що свідчило про наявність запального процесу у цього відсотка чоловіків. Вони складали 4-ту групу. До контрольної групи ввійшло 20 соматично здорових чоловіків віком від 22 до 39 років зі збереженою фертильністю й нормозооспермією та підтвердженим батьківством (перебувають у шлюбі протягом 3-10 років і мають 1-3 здорових дітей).

Матеріалом для дослідження були зразки сім'яної рідини, яку отримували після статевої абстиненції 3-5 днів. Показники спермограм (концентрація сперматозоїдів, їх рухливість, морфологія та відсоток живих форм) оцінювали за допомогою світ- лооптичної мікроскопії, згідно з директивами щодо їх проведення (ВООЗ, 2010) [26].

Матеріал отримували відповідно до передбачених заходів, спрямованих на забезпечення задовільних умов збереження здоров'я пацієнта, дотримання його прав, людської гідності та морально-етичних норм. Умови відбору дослідних зразків відповідали вимогам принципів Гельсінської декларації охорони прав людини, конвенції Ради Європи про права людини і біомедицину та положенням відповідних законів України. Перед включенням до дослідження всі чоловіки були ознайомлені з інформаційним листком пацієнта та давали інформовану згоду на участь в дослідження.

Сперматозоїди відмивали від плазми еякуляту 3-разовим центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 10 хв. у середовищі, яке містило (ммоль/л): NaCl - 120, KCl - 30, Hepes (рН 7,4) - 30. Вміст загального протеїну в пробах визначали методом Лоурі [23] з використанням набору виробництва НВФ «Simko Ltd» (Україна).

Інтенсивність процесів ліпопероксидації у сперматозоїдах оцінювали за накопиченнямтіобарбітуратактивних (ТБК) продуктів, основним з яких є МДА [6].

Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням програми «MS Excel-2003» для Windows. Для оцінки достовірності різниці між статистичними характеристиками двох альтернативних сукупностей даних обчислювали коефіцієнт Стьюдента. Для оцінки кореляційних взаємозв'язків між показниками застосовували коефіцієнт кореляції Пірсона. Для всіх видів аналізу статистично значущими вважали відмінності при p<0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Вторинні продукти ПОЛ мають вагоме діагностичне значення, оскільки вони є стабільними продуктами процесів ліпопероксидації. Одним із розповсюджених у дослідженнях біомаркерів вільнорадикальних процесів ПОЛ є МДА, визначення вмісту якого проводять у реакції з тіобарбітуровою кислотою (ТБК). Проте даний метод не є високоспецифічним, оскільки ТБК реагує не лише з МДА, але й з іншими альдегідами. Тому, фактично визначають вміст ТБК- позитивних продуктів (реактантів), який свідчить про інтенсивність ПОЛ [2]. ТБК-позитивні продукти є маркером оксидативного стресу та потенційним маркером для прогнозування результатів у допоміжних репродуктивних технологіях [26].

У результаті проведених нами досліджень виявлено статистично достовірне збільшення вмісту ТБК-позитивних продуктів у сперматозоїдах неплідних чоловіків порівняно з аналогічним показником контрольної групи чоловіків зі збереженою фертильністю (рис. 1).

Так, їх рівень у групі чоловіків з олігозооспермією збільшується в 1,6 рази з 162,2±15,6 нмоль/мг протеїну до 260,4±20,10 нмоль/мг протеїну (р<0,001). У чоловіків з астенозооспермією та олігоастенозо- оспермією вміст цього показника в сперматозоїдах перевищує контрольний показник вдвічі і становить 320,2±25,2 та 315,4±45,6 нмоль/мг протеїну відповідно (р<0,001). У чоловіків із лейкоцитоспермією вміст ТБК-позитивних продуктів досяг максимального значення - 440,8±45,6 нмоль/мг протеїну, що в 2,7 рази (р<0,001) перевищує цей показник у чоловіків із збереженою фертильністю.

Очевидно, такі розбіжності у інтенсивностях зростання продуктів ліпопероксидації у різних досліджуваних групах можуть бути спричинені різним рівнем метаболічних процесів у сперматозоїдах за умов оліго-, астено- та олігоастенозооспермії з одного боку, та впливом зовнішніх факторів - з іншого (при лейкоцитоспермії). Результати досліджень вмісту вторинних продуктів ПОЛ доводять, що вільнорадикальні процеси найінтенсивніше відбувались у сперматозоїдах чоловіків із лейкоцитоспермією. Встановлений факт, на нашу думку, пояснюється тим, що лейкоцити можуть утворювати АФК у високих концентраціях, у такий спосіб пригнічуючи рухливість і функціональну активність сперматозоїдів [25]. У пацієнтів із лейкоцитоспермією відбувається максимальна інтенсифікація процесів ліпопероксидації, що сприяє утворенню вторинних продуктів ПОЛ та мембранодеструкції, інактивуючи мембранні протеїни, йонні помпи та інші ензими. Інтенсифікація процесів ПОЛ призводить до розвитку оксидативного стресу, що спричиняє зміни в активності мембрано-зв'язаних ензимів.

Отримані результати свідчать, що в сперматозоїдах інфертильних чоловіків інтенсивність ліпопероксидних процесів є вищою, що збігається з думкою більшості дослідників. Зокрема, підвищення вмісту МДА виявлено в сім'яній плазмі неплідних чоловіків з астенотератозооспермією та олігоастенотерато-зооспермією [14]. Підвищений рівень МДА виявлено в сім'яній плазмі неплідних чоловіків із порушеннями сперматогенезу та варикоцеле [7,15,16,18,22].

Істотне зростання вмісту ТБК-позитивних реактантів, як вторинних продуктів ПОЛ, свідчить про інтенсифікацію вільнорадикальних процесів, що пов'язано або з підвищенням рівня АФК, або з інгібуванням системи антиоксидантного захисту [5]. Стан оксидативного стресу виникає як через посилене утворення вільнорадикальних субстратів, так і внаслідок виснаження систем антиоксидантного захисту. У наших попередніх роботах виявлено виснаження компенсаторних механізмів глутатіонової антиоксидантної системи у сперматозоїдах неплідних чоловіків за умов патоспермій [1]. Оксидативний стрес, який проявляється порушенням балансу між утворенням АФК та активністю систем антиоксидантного захисту, порушує структуру і функції сперматозоїдів і, в кінцевому результаті, веде до зниження фертиліза- ційної здатності та чоловічого непліддя [9,20].

Враховуючи виявлені зміни інтенсивностей процесів ліпопероксидації в сперматозоїдах неплідних чоловіків із різними формами патоспермій нами проведено кореляційний аналіз з метою встановлення ступеня тісноти та значущості зв'язків між вмістом ТБК-реактантів та основними морфо-функціональними показниками сперматограм. Проведений кореляційний аналіз виявив вірогідний зворотний кореляційний зв'язок середньої сили між вмістом ТБК-продуктів і концентрацією сперматозоїдів (КС) в еякуляті неплідних чоловіків із порушенням сперматогенезу за типом олігозооспермії та олігоастенозооспермії (r =- 0,75; р<0,001) (рис. 2). У чоловіків із порушенням фертилізаційного потенціалу встановлено, що рівень ТБК-реактантів обернено корелював з рухливістю сперматозоїдів (РС) (r =- 0,6; р<0,01) (рис. 3). Таким чином, в результаті проведеного кореляційного аналізу нами встановлено зворотну кореляційну залежність між вмістом ТБК- реактантів у сперматозоїдах неплідних чоловіків із кількістю сперматозоїдів в еякуляті та їх рухливістю, що прямо вказує на патогенетичний зв'язок між рівнем вільнорадикального пероксидного окиснення ліпідів і зниженням фертилізаційного потенціалу сперматозоїдів. Водночас, нами не виявлено чітких кореляційних зв'язків між вмістом ТБК-реактантів у сперматозоїдах із кількістю лейкоцитів в еякуляті у пацієнтів із лейкоцитоспермією (рис. 4).

Рис. 2. Кореляційний зв'язок між вмістом ТБК- продуктів і концентрацією сперматозоїдів в еякуляті неплідних чоловіків із порушенням сперматогенезу за типом олігозооспермії та олігоастенозооспермії

Рис. 3. Кореляційний зв'язок між вмістом ТБК-продуктів і рухливістю сперматозоїдів неплідних чоловіків із порушенням сперматогенезу за типом астенозооспермії та олігоастенозооспермії

Таким чином, тісні кореляційні зв'язки між концентрацією продуктів вільнорадикального пероксидного окиснення ліпідів, концентрацією та рухливістю сперматозоїдів вказували на їх патогенетичну роль в ушкодженні репродуктивної системи у чоловіків.

Отримані нами результати підтверджують думки інших дослідників у тому, що інтенсивність перебігу вільнорадикальних реакцій у сперматозоїдах неплідних чоловіків корелює з порушеннями основних морфо-функціональних характеристик сперматозоїдів.

Зокрема, показано негативний кореляційний зв'язок між вмістом МДА та рухливістю сперматозоїдів у чоловіків з олігоастенозооспермією [15]. У дослідженні Patel S et al. [17] виявлено негативний

кореляційний зв'язок між вмістом МДА та рухливістю і морфологією сперматозоїдів, що підкреслює мемб- ранодеструктивну дію вільних радикалів на цілісність спермальних мембран. Проте, у цьому ж дослідженні виявлено позитивний кореляційний зв'язок між вмістом МДА в сім'яній плазмі та концентрацією сперматозоїдів і лейкоцитів в еякуляті. Схожі кореляційні зв'язки між вмістом МДА і показниками спермато- грам (концентрацією сперматозоїдів, їх рухливістю, життєздатністю, кількістю атипових форм) продемонстровано і в ряді інших досліджень. Водночас, іншими, більш старішими дослідженнями не виявлено кореляційних зв'язків між вмістом МДА та показниками сперматограм [11,19].

Слід зазначити, що кожна форма патоспермії характеризується певним рівнем маркерів оксидативного стресу та активності ензиматичних систем антиоксидантного захисту. При різних патологіях, пов'язаних із непліддям, визначення цих параметрів може бути корисним для їх діагностики та прогнозування, а також може допомогти при вирішенні питання про можливе лікування специфічними антиоксидантними препаратами (добавками).

Висновки

У сперматозоїдах неплідних чоловіків виявлено статистично достовірне збільшення вмісту ТБК- позитивних продуктів порівняно з показниками у чоловіків зі збереженою фертильністю, причому максимальна інтенсифікація процесів ліпопероксидації спостерігається у пацієнтів із лейкоцитоспермією.

Рис. 4. Кореляційний зв'язок між вмістом ТБК- продуктів і концентрацією лейкоцитів в еякуляті неплідних чоловіків із лейкоцитоспермією

Водночас чітких кореляційних зв'язків між вмістом ТБК-реактантів у сперматозоїдах неплідних чоловіків і кількістю лейкоцитів не виявлено.

Перспективи подальших досліджень. Подальше вивчення пероксидного окиснення ліпідів та ензимів антиоксидантного захисту спертатозоїдів може бути корисним діагностичним інструментом для визначення фертилізаційного потенціалу цих клітин і мати практичне значення для лікування чоловічого непліддя, особливо в ідіопатичних випадках.

Література

1. Активність глутатіонзалежних ензимів сперматозоїдів за умов патоспермії О.К. Онуфрович, РВ. Фафула, Й.А. Наконечний [та ін.] // Медична та клінічна хімія. - 2016. - Т. 18, № 4. - С. 5-10.

2. Гончарук Є.Г Вільнорадикальне окислення як універсальний неспецифічний механізм пошкоджуючої дії шкідливих чинників довкілля: (огляд л-ри та власн. дослідж.) / Є.Г Гончарук, М.М. Коршун // Журнал АМН України. - 2004. - Т. 10, № 1. - С. 131-150.

3. Казимирко В.К. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия / В.К. Казимирко, В.И. Мальцев, В.Ю. Буты- лин, Н.И. Горобец. - К.: Морион, 2004. - 160 с.

4. Костюшова Н.В. Функціональна роль -SH і -S-S-груп у розвитку оксидативного стресу при гострому коронарному синдромі / Н.В. Костюшова Одеський мед. журн. - 2010. - Т. 119, № 3. - С. 61-64.

5. Поставный В.Е. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система в динамике лечения больных хроническим гастритом / В.Е. Поставный // Лікар. справа. - 2005. - № 8. - С. 33-38.

6. Тимирбулатов Р.Р. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидосодержащих компонентов крови и его диагностическое значение / Р.Р. Тимирбулатов, Е.И. Селезнев // Лаб. дело. - 1981. - № 4. - С. 209-211.

7. Abd-Elmoaty M.A. Increased levels of oxidants and reduced antioxidants in semen of infertile men with varicocele / M.A. Abd- Elmoaty, R. Saleh, R. Sharma, A. Agarwal // Fertil. Steril. - 2010. - V. 94. - P 1531-1534.

8. Agarwal A. Clinical relevance of oxidative stress in patients with male factor infertility: evidence-based analysis / A. Agarwal, S.A. Prabakaran, S.C. Sikka // Am. Urol. Assoc. - 2007. - V. 26. - P 2-11.

9. Agarwal A. Markers of oxidative stress and sperm chromatin integrity / A. Agarwal, A.C. Varghese, R.K. Sharma // Methods Mol. Biol. - 2009. - V. 590. - P 377-402.

10. Aitken R.J. Reactive oxygen species and sperm function - in sickness and in health / R.J. Aitken, K.T. Jones, S.A. Robertson // J. Androl. - 2012. - V. 33 (6). - P 1096-1106.

11. Aleksandra K. Values of malondialdehyde in human seminal plasma / K. Aleksandra, K. Slawomir, B. Ewa // Progr. Med. Res. - 2004. - V. 2. - P 1-10.

12. Chaudhari A.R. Study of oxidative stress and reduced glutathione levels in seminal plasma of human subjects with different fertility potential / A.R. Chaudhari, P Das, R. Singh // Biomedical Research. - 2008. - V. 19 (3). - P 207-210.

13. Cocuzza M. Clinical relevance of oxidative stress and sperm chromatin damage in male infertility: an evidence based analysis / M. Cocuzza, S.C. Sikka, K.S. Athayde, A. Agarwal // International Brazilian Journal of Urology. - V. 33 (5). - P 603-621.

14. Colagar A.H. Correlation of sperm parameters with semen lipid peroxidation and total antioxidants levels in astheno- and oligoastheno- teratospermic men / A.H. Colagar, F. Karimi, S.G.A. Jorsaraei // Iran. Red. Cresc. Med. J. - 2013. - V. 15 (9). - P 780-785.

15. Hsieh YY Seminal malondialdehyde concentration but not glutathione peroxidase activity is negatively correlated with seminal concentration and motility YY Hsieh, C.C. Chang, C.S. Lin // Int. J. Biol. Sci. - 2006. - V. 2 (1). - P 23-29.

16. Human seminal oxidative stress: correlation with antioxidants and sperm quality parameters / G. Badade, K. More, G. Narshetty [et al.] // Ann. Biol. Res. - 2011. -V. 2 (5). - P 351-359.

17. Influence of oxidants and anti-oxidants on semen parameters in infertile males / S. Patel, S. Panda, R. Nanda [et al.] // J. Indian. Med. Assoc. - 2009. - V. 107 (2). - P 78-80.

18. Lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in infertile men: correlation with semen parameter / F. Ben Abdallah, I. Dammak, H. Attia [et al.] // J. Clin. Lab. Anal. - 2009. - V. 23 (2). - V. 99-104.

19. Lipid peroxidation and human sperm motility: protective role of vitamin E / S.A. Suleiman, M.E. Ali, Z.M. Zaki [et al.] // J. Androl. - 1996. - V. 17. - P 530-537.

20. Maneesh M. Role of reactive oxygen species and antioxidants on pathophysiology of male reproduction / M. Maneesh, H. Jayalekshmi // Ind. J. Clin. Biochem. - 2006. - V 21 (2). - P 80-89.

21. Packer L. Oxidant and antioxidant revisited. New concept of oxidative stress L. Packer, E. Cadenas // Free Rad. Research. - 2007. - № 9. - Р 951-952.

22. Parineeta M.S. Seminal Malondialdehyde Concentration And Superoxide Dismutase, Catalase Activity In Male Infertility / M.S. Parineeta, G.B. Zunjarrao, S.K. Madhuri, A. Deepak // Internet J. Health. - 2009. - V 11 (2). - P 1-7.

23. Protein measurement with the Folin phenolreagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P 265-275.

24. Relationship between Seminal Malondialdehyde Levels and Male Infertility D.A. Abdelaziz, A.K. Seleem, A.A. Zalata [et al.] // International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technology. - 2016. - V. 5 (10). - P 18190-18199.

25. Spontaneous variation of leukocytospermia in asymptomatic infertile males / J.E. Lackner, E. Lakovic, T Waldhor [et al.] // Fertil. Steril. - 2008. - V. 90 (5). - P 1757-1760.

26. The Effects of Oxidative Stress on Outcomes of Assisted Reproductive Techniques / O. Oral, T Kutlu, E. Aksoy [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. -2006. V. 23 (2). - P 81-85.

27. Vidya G. Relationship of Malondialehyde level in seminal plasma with sperm quality in men undergoing fertility investigation / G. Vidya, G.P Shashidha, D. Vijay // Journal of the Indian Society of Toxicology. - 2013. - V. 9 (1). - P 1-6.

Размещено на Allbest.ur