Взаимосвязь между концентрацией HSP 70, активностью тиол-дисульфидной системы и степенью неврологических нарушений при моделировании острой церебральной ишемии

Взаимосвязь между концентрацией HSP ₇₀, активностью тиол-дисульфидной системы и степенью неврологических нарушений при моделировании острой церебральной ишемии

Беленичев И.Ф., Била Ю.В.

Abstract

Cerebral hypoxia starts pathobiochemical cascade of reactions, which are based on free radical oxidation process. To prevent this process thiol-disulfide antioxidant system is very important, it is able to capture and neutralize free radicals due to the presence of sulfhydryl -SH groups per molecule of reduced glutathione, as well as adjust glutathionylation proteins to maintain their functional activity. Another important participant of neuroprotection endogenous process is Heat Shock Proteins 70. Its properties, first associated with the presence of chaperone activity, but there is evidence of its direct neuroprotective action, which mechanisms finally clarified and requires more detailed study.

Aim. Analyze the values of HSP ₇₀ concentration, the activity of thiol-disulfide system and the level of neurological deficit in experimental animals with acute cerebral ischemia and to identify possible correlations between parameters.

Object and methods. In the conducted experiment was 110 Wistar rats aged 4-5 months, weighing 170-200 g. Simulation of acute cerebrovascular accident (ACVA) was carried out by an irreversible bilateral ligation of common carotid arteries under sodium thiopental anesthesia (40 mg/kg). Animals were randomly divided into group II: the first group contained the animals with stroke; the second group consisted of sham-operated rats, which reproduces the anesthesia, skin incision and the subsequent allocation of the arteries without ligation of vessels. Intensity of neurological disorders was determined daily on a stroke-index McGrow scale. On day 4 the concentration of HSP ₇₀ determined in cortex and hippocampus by Western-blotting. Level of thiol-disulfide system violations was determined by the concentration of recovery glutathione (G-SH), the activity of glutathione reductase (GR) and glutathione-S-transferase (G-S-T).

Conclusions. It was found that simulation of acute stroke in experimental animals formed neurological disorders of varying severity, which are interconnected with the activity of thiol-disulfide system and HSP ₇₀ level. High levels of activity of HSP ₇₀ stabilizes the thiol-disulfide system and, consequently, reduces the intensity of neurological deficits. The establishment of a direct one-way close correlation between the level of glutathione reduced and HSP ₇₀ confirms the important role of heat shock protein 70 in the endogenous mechanisms of neuroprotection.

Keywords: acute cerebral ischemia, heat shock proteins HSP , thiol-disulfide system, Western blotting, neurological deficit.

На сегодняшний день проблема мозговых инсультов особенно актуальна во всем мире. Ежегодно в Украине регистрируется приблизительно 110 тыс. мозговых инсультов, из которых около 40 тыс. приводят к летальному исходу [9]. Эти данные имеют динамику к постоянному росту, поскольку подкреплены распространенностью факторов риска цереброваскулярных заболеваний, таких как артериальная гипертензия, гиперхолестеринемия, сахарный диабет, курение и др. [9,11]. Основной причиной повреждения головного мозга при данной патологии является развитие острого нарушения мозгового кровотока. В условиях церебральной гипоксии запускается каскад патобиохимических реакций, в основе которых лежит процесс свободнорадикального окисления, ведущий к накоплению активных форм кислорода (АФК), свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов [1,12,13]. Нарастающий оксидативный стресс приводит к окислению функциональных сульфгидрильных групп белков и образованию межмолекулярных дисульфидных связей, вследствие чего происходит нарушение процессов сигналинга и клеточного метаболизма в целом. При этом избыточное накопление необратимых глутатионили- рованных белков предопределяет гибель нейронов [10,13].

В связи с этим можно оценить значимость тиол-дисульфидной антиоксидантной системы, которая способна улавливать и нейтрализовать свободные радикалы за счет наличия сульфгидрильных -SH групп в молекуле глутатиона восстановленного, а также регулировать глутатионилирование белков для поддержания их функциональной активности [10,17].

Кроме того, ряд авторов указывает на важную роль белков теплового шока 70 (HSP ) в процессах эндогенной нейропротекции как в условиях нор- моксии, так и в состоянии гипоксического стресса [2,16]. Установлено, что HSP ₇₀ обладает шаперонной активностью, которая заключается в способности поддерживать и восстанавливать нативную конформационную структуру белков, участвовать в трансмембранном транспорте этих полипептидов и дефрагментации поврежденных белков [15,18]. Также имеются данные о прямом нейропротективном действии белков теплового шока 70, не обусловленном их шаперонной функцией [2,15], однако механизмы этого действия достаточно противоречивы и требуют дальнейшего изучения и систематизации.

Цель исследования. Проанализировать значения концентрации HSP ₇₀, активность тиол-дисульфидной системы и степень неврологического дефицита у экспериментальных животных с острой церебральной ишемией и выявить возможные корреляционные зависимости между показателями.

Объект и методы исследования. Экспериментальная часть выполнена на 110 крысах линии Вистар возрастом 4-5 мес., массой 170-200 г, которые содержались в условиях вивария при природном освещении и стандартном рационе питания. Экспериментальные исследования проводились в соответствии с основными положениями Конвенции Совета Европы об охране позвоночных животных, которые используются в экспериментах и в других научных целях от 18 марта 1986 г [14], Директивы Европейского Союза 2010/10/63 EU от 22 сентября 2010 г о защите животных, которые используются для научных целей [7] и Закона Украины от 21 февраля 2006 г № 3447-IV «О защите животных от жестокого обращения» [8].

Моделирование острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) проводили путем двухсторонней необратимой перевязки общих сонных артерий под тиопентал натриевым наркозом (40 мг/ кг интраперитонеально) [5]. Животные рандомно были разделены на II группы: первая группа - животные с ОНМК, вторая группа - ложнооперированные крысы, которым воспроизводились наркотизация, кожный разрез и выделение артерий без последующей перевязки сосудов.

Выраженность неврологических нарушений определяли ежедневно по шкале stroke-index McGraw. Во внимание принимали вялость, замедленность движений, слабость конечностей, одно- и двусторонний полуптоз, одно- и двусторонний птоз, парезы, параличи, манежные движения, тремор, коматозное состояние. Тяжесть состояния регистрировали по трем категориям: до 3 баллов - легкая степень, от 3 до 7 - средняя степень, выше 7 баллов - тяжелая степень неврологического дефицита [6].

На 4 сутки животных выводили из эксперимента путем декапитации под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). Из полученных полушарий головного мозга выделяли зону гиппокампа и кору, которые затем гомогенизировали при помощи гомогенизатора Silent Crusher S (Heidolph) в сахарозном буфере (250 мМ, ЭДТА 1мМ, рН 7,4) t=+4⁰C [6]. Последующим центрифугированием при 13 000 об/мин получали супернатант цитозольной фракции.

Концентрацию HSP ₇₀ определяли методом Вестерн-блоттинга. Предварительное разделение белков проводили с помощью денатурирующего электрофореза в 10% полиакриламидном геле в течение 1 часа. Перенос белков на нитроцеллюлозную бумагу проводили в течение 1 часа при силе тока 0,35 А и напряжении 100 В. Для идентификации HSP ₇₀ использовали первичные антитела (Monoclonal Anti-HSP70 antibody, Sigma) 1:5000 и вторичные антитела (Mouse ExtrAvidin Peroxidase Statining Kit, Sigma) 1:2,500. Количественное содержание HSP ₇₀ выражали в усл.ед./г белка [6].

Степень нарушений со стороны тиол-дисульфидной системы определяли по уровню глутатиона восстановленного (Г-SH), активности глутатионредуктазы (ГР) и глутатион-трансферазы (Г-S-T) [6].

Результаты обработаны с применением статистического пакета лицензионной программы «STATISTICA® for Windows 6.0» (StatSoftInc., № AXXR712D833214FAN5), а также «SPSS 16.0», «Microsoft Excel 2003». Нормальность распределения определяли по критерию (W) Shapiro-Wilk. Данные представлены в виде среднего и стандартной ошибки репрезентативности выборочного среднего значения. Достоверность различий (р) экспериментальных данных рассчитывали с использованием t-критерия Стьюдента при нормальном распределении и U-критерия Уитни-Манна при отсутствии нормальности. Корреляционно-регрессионный анализ проводили с использованием коэффициента Пирсона (r). Различия считали значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате необратимой двусторонней перевязки общих сонных артерий у всех животных контрольной группы на 4 сутки эксперимента наблюдались неврологические нарушения различной степени тяжести. Согласно шкале stroke-index McGraw все крысы были разделены на 3 группы по степени неврологического дефицита. У ложнооперированных животных (ЛО) неврологических отклонений практически не наблюдалось. В группе с легкой, средней и тяжелой неврологической симптоматикой средний балл по шкале stroke-index С. Р McGraw по сравнению с ложнооперированной группой был выше на 1,95; 5,55 и 12,65 баллов соответственно (табл. 1).

Таблица 1. Средний балл по шкале stroke-index С. Р. McGmw у крыс с моделированием острого нарушения мозгового кровообращения

На следующем этапе эксперимента определяли состояние тиол-дисульфидной системы. Уровень глутатиона восстановленного в контрольных группах снижался. Так, при легкой степени неврологического дефицита его значение в коре было ниже на 21,4%, при средней степени на 34,5%, при тяжелой степени на 52,4% относительно ЛО группы. В гиппокампе наблюдалось более резкое падение уровня глутатиона, соответственно, на 25,7%, 46,2% и 66,6%.

Также отмечалось изменение активности ферментов тиол-дисульфидной системы. Уровень глутатион-S-трансферазы снижался, начиная с группы с легкой неврологической симптоматики, в коре на 19,5%, в гиппокампе на 20,4%. Критическое падение показателя наблюдалось в группе с тяжелой симптоматикой, в коре на 55,2%, в гиппокампе на 70,2%.

Активность глутатион редуктазы имела тенденцию к снижению на фоне прогрессирующего неврологического дефицита (табл. 2).

белок тепловой шок мозговой

Таблица 2. Содержание компонентов тиол-дисульфидной системы в цитозольной фракции коры мозга и гиппокампа крыс с моделированием острого нарушения мозгового

Методом Вестерн-блот анализа был установлен уровень HSP ₇₀ в коре и гиппокампе мозга экспериментальных животных. Отмечалось значительное повышение концентрации белков теплового шока 70 в группе с легкими неврологическими нарушениями: в 2,4 и 1,3 раза соответственно. В группе со средней степенью неврологического дефицита отмечалось разнонаправленное изменение концентрации HSP ₇₀, в коре сохранялся высокий уровень, выше, чем в ложнооперированной группе в 1,8 раза, а в зоне гиппокампа концентрация снижалась на 11,3% относительно ЛО. Минимальный уровень HSP ₇₀ наблюдался у группы с тяжелой неврологической симптоматикой в зоне гиппокампа - на 49,3% ниже, чем у ложнооперированных животных (табл. 3).

Таблица 3. Уровень HSP 70 в цитозольной фракции коры мозга и гиппокампа крыс с моделированием острого нарушения мозгового кровообращения