Кардио- и эндотелиопротективное действие макролидных антибиотиков

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кардио- и эндотелиопротективное действие макролидных антибиотиков

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания (в том числе атеросклероз и его осложнения) являются основной причиной смертности и инвалидизации людей в развитых странах. По этим причинам любая новая информация о механизмах развития атеросклероза, а также разработка новых, более эффективных методов его лечения имеют огромное социальное значение. Несмотря на многочисленные исследования, проблема эффективной коррекции органных нарушений при ишемической болезни сердца далека от своего решения. Одной из возможных причин этого положения является традиционность подходов к разработке средств и способов лечения и профилактики атеросклероза как наиболее важной причины ИБС.

По современным представлениям, нарушение функции эндотелия является первым шагом в процессе атерогенеза, часто предшествующим появлению структурных изменений сосудистой стенки. Понятие эндотелиальной дисфункции (ЭД) включает наличие дисбаланса между релаксацией и констрикцией, между анти- и протромбогенезом, антипролиферацией и пролиферацией. Эндотелиальная дисфункция сопровождается снижением секреции оксида азота (NO), обладающего выраженными противовоспалительными, вазодилатирующими и антисклеротическими свойствами. NO, важнейший эндогенный вазодилататор, играет ключевую роль в эндотелиальной регуляции сосудистого тонуса. Нормально функционирующий эндотелий отличает непрерывная базальная выработка NO с помощью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) из L-аргинина. Это необходимо для поддержания нормального базального тонуса сосудов (Марков Х.М., 2001). В то же время NO обладает ангиопротективными свойствами, подавляя пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и моноцитов (Бабак О.Я., 2004) и, предотвращая тем самым патологическую перестройку сосудистой стенки (ремоделирование), прогрессирование атеросклероза, кроме того, он опосредует сосудорасширяющие эффекты эндотелийзависимых вазодилататоров (ацетилхолина, брадикинина, гистамина и др.), тормозит образование эндотелиального сосудосуживающего фактора эндотелина-1 и высвобождение норадреналина окончаниями симпатических нейронов, препятствует осуществлению чрезмерных эффектов других вазоконстрикторов (ангиотензина, тромбоксана А₂), обладает противовоспалительным и антитромбогенным эффектами, оказывает антиоксидантное действие (Марков Х.М., 2005, Forstermann U.T., 2006).

Недостаточная продукция NO в сосудистом русле является ранним признаком ЭД. С одной стороны, это связано со снижением биодоступности NO, с другой - со сниженной активностью eNOS, в результате присутствия эндогенных или экзогенных ингибиторов её функционирования или снижения доступности его субстрата, L-аргинина. В основе снижения биодоступности NO лежат изменения продукции синтезируемых сосудистыми эндотелиальными клетками биологически активных соединений, среди которых наибольшее значение имеют свободные радикалы кислорода, которые, соединяясь с NO, образуют избыточное количество такой реактивной формы кислорода (РФК), как пероксинитрит (ONOO^-) (Pacher P., 2007). Пероксинитрит, являясь высокотоксичным соединением, повреждает мембраны и ДНК клетки, вызывает мутации и перекисное окисление липидов низкой плотности (Annuk M., 2001). При этом возникает оксидантный стресс, активирующий большое количество оксидантчувствительных факторов транскрипции (таких как нуклеарный фактор каппа-В (NF-кВ), которые повышают экспрессию адгезивных молекул эндотелия (ICAM-1, VCAM-1), а также различного рода факторов роста и хемокинов, способствующих развитию воспалительных процессов, протекающих при атеросклерозе (Griendling K.K., 2003; Taniyama Y., 2003), что приводит к дисбалансу медиаторов, обеспечивающих в норме эндотелийзависимые процессы (Марков Х.М., 2005; Heitzer T., 2001; Deanfield J., 2005).

Изучение состояния сосудистой стенки и поиск возможностей целенаправленного лечения эндотелиальной дисфункции как предшественника атеросклероза являются важными клинико-экспериментальными задачами.

Несмотря на то что факторы риска атеросклероза на сегодняшний день хорошо известны (Харченко В.И., 2005), даже совокупность всех перечисленных факторов не объясняет более половины клинических случаев атеросклероза. Поэтому сегодня к списку факторов риска все с большей уверенностью причисляют и инфекционные болезни. Работами последних лет показана роль инфекционного и воспалительного фактора в развитии и волнообразном течении атеросклероза (цитомегаловирусы, Helicobacter pylori, Chlamydia Pneumoniaе) (Dunne M.; 2004, Stacey L.K., 2004; Goldschmidt-Clermont P.J., 2005; Mussa F.F., 2006), а также эффективность макролидов в отношении снижении риска сердечно- сосудистой патологии (Gurfinkel E., 1999; Pechere J.C., 2001; Gupta S., 2003; Melissano G., 2004).

Высказывается предположение о первичности антибактериального компонента в реализации кардио- и эндотелиопротективных эффектов макролидных антибиотиков (Rothstein N.M., 2001; Blessing E., 2002; Kutlin A., 2002). В то же время, представляется вероятной и альтернативная точка зрения на механизм защитного действия макролидов при повреждении эндотелия и миокарда, основанная на известных противовоспалительных и антиоксидантных свойствах этих препаратов (John P. et al. 2003; Andraws R. et al. 2005). Согласно литературным данным, противовоспалительное и антиоксидантное действие макролидов обнаруживается в диапазоне доз от 10 до 30 мг/кг и эти дозы макролидов проявляют эндотелио- и кардиотропные эффекты (Страчунский Л.С., 1998; Fong I.W., 1999; Ianaro A., 2000). При этом важное значение может иметь и направленный транспорт макролидов к очагу воспаления посредством лейкоцитов, концентрация в которых существенно выше, чем в плазме и миокарде (Parnham M.J., 2005), а также способность модулировать активность самих лейкоцитов (Карпов О.И., 2005).

Многочисленные экспериментальные исследования показали, что макролиды наряду с иммуномодулирующей, антиоксидантной, антиагрегационной и противовоспалительной активностью, обладают также и эндотелиотропной активностью в опытах in vitro. Эндотелиотропная активность макролидов обусловлена усилением высвобождения NO, предупреждением деградации NO, активацией фермента еNOS, ингибированием продукции вазоконстриктора эндотелина 1 (Mitsuyama T., 1998; Berman M., 2005; Sharma М., 2007).

В связи с вышеизложенным являлось актуальным изучение кардиопротективного и эндотелиопротективного действия макролидных антибиотиков при различном экспериментальном моделировании эндотелиальной дисфункции и коронароокклюзионном инфаркте миокарда.

Работа выполнена по инициативному плану, включена в программу «Разработка и совершенствование методов ранней диагностики, лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний с целью улучшения качества и увеличения продолжительности жизни больных» на 2007-2012 гг. Номер государственной регистрации диссертационной темы 01.2. 007 05249.

Цель исследования: сравнительное изучение кардиопротективного и эндотелиопротективного действия в ряде макролидных антибиотиков.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методологию оценки кардио- и эндотелиопротективного действия в ряду макролидных антибиотиков, определить наиболее информативные показатели и направления разработки экспериментальных моделей развития эндотелиальной дисфункции.

2. Произвести качественную и количественную оценку развития L-NAME-индуцированной, реактивной поствакцинально-васкулитной (РПВВ-индуцированной) и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции по совокупности функциональных, биохимических и морфологических маркеров дисфункции нарушения функции эндотелия.

3. Исследовать кардиопротективную активность в ряде макролидных антибиотиков при моделировании острого коронароокклюзионного инфаркта.

4. Изучить эндотелиопротективную активность азитромицина, рокситромицина, кларитромицина, джозамицина и мидекамицина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

5. По результатам исследования кардио- и эндотелиопротективных свойств макролидных антибиотиков провести анализ структура - действие и выбрать для дальнейшего исследования наиболее активный препарат.

6. Исследовать эндотелиопротективную активность азитромицина при моделировании РПВВ-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

7. Исследовать эндотелиопротективную активность азитромицина при моделировании сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

8. Предложить рабочую гипотезу и обосновать возможные патогенетические «мишени» для объяснения механизма кардио- и эндотелиопротективного действия макролидных антибиотиков.

Научная новизна исследования. В работе сформировано новое направление в доклинической оценке эндотелиотропной активности фармакологических препаратов с использованием коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), проведением функциональных проб, определением биохимических маркеров и результатов морфологических исследований.

Разработаны новые модели эндотелиальной дисфункции воспалительного генеза: реактивной поствакцинально-васкулитной и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции.

В работе впервые предложен способ фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции в эксперименте с использованием 14-, 15-, и 16-членных макролидных антибиотиков. Используя впервые объединённый комплекс методических подходов, выявлено, L-NAME-индуцированная, реактивная поствакцинально-васкулитная и сепсис-индуцированная эндотелиальная дисфункции характеризуются изменениями соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением коэффициента эндотелиальной дисфункции в 5, 3,5 и 2 раза соответственно, резким нарушением продукции NO, отрицательной динамикой морфометрических показателей сердечно-сосудистой системы.

Впервые в сравнительном аспекте исследовано кардиопротективное действие макролидных антибиотиков в «малой» дозе - 10 мг/кг и «большой» дозе - 30 мг/кг при моделировании острого коронароокклюзионного инфаркта у крыс.

Впервые в сравнительном аспекте исследовано эндотелиопротективное действие макролидных антибиотиков в «малой» дозе - 10 мг/кг и «большой» дозе - 30 мг/кг при моделировании L-NAME индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс.

Впервые исследовано эндотелиопротективное действие антибиотика азитромицина на модели реактивной поствакцинально-васкулитной эндотелиальной дисфункции у кроликов.

Впервые исследовано эндотелиопротективное действие антибиотика азитромицина на модели сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс.

Научная новизна подтверждается получением 8 патентов РФ.

Практическая значимость.

1. Предложено теоретическое и экспериментальное обоснование возможности исследования макролидных антибиотиков как прототипа для создания бионаномашин на основе клеток, обеспечивающих клеточный иммунитет (макрофаги и лейкоциты), в качестве элементов направленного транспорта макролидов к участкам повреждённого эндотелия с целью реализации модулирующего влияния макролидов на активность эндотелиальной и индуцибельной NOсинтазы, локального антиоксидантного статуса и выработки провоспалительных цитокинов.

2.Исследована зависимость структура-действие и доза-эффект в ряде макролидных антибиотиков, что может служить теоретической предпосылкой для дальнейшего синтеза соединений с плейотропными противовоспалительными, иммуномодулирующими, антиагрегантными и эндотелиопротективными свойствами.

3.Сделан вклад в формирование системы доказательств неантибактериального (плейотропного) действия макролидных антибиотиков и других соединений, обладающих способностью модулировать выброс провоспалительных цитокинов, в объяснении данных эпидемиологических исследований о профилактическом эффекте макролидов в отношении волнообразного течения заболеваний с атеросклеротическим поражением сосудов различной локализации.

Внедрение результатов научных исследований. Материалы диссертационного исследования включены в регистрационное досье, направленное в Фармакологический Комитет МЗ РФ и ФГУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения Росздрава» для регистрации препарата «Азитрокс» 250 мг производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», получено регистрационное удостоверение № 001157/01 от 29.12.06, и препарата «Азитрокс» 500 мг производства ОАО «Фармстандарт-Лексредства», получено регистрационное удостоверение ЛСР-004203/08 от 30.05.08 г. Препараты промышленно выпускаются.

Материалы диссертационного исследования используются в экспериментально-фармакологических лабораториях Курского медицинского университета, Воронежской и Кубанской медицинских академиях.

Результаты исследований внедрены и используются в практике работы НИИ ЭМ КГМУ и в лекционных курсах кафедры фармакологии, клинической фармакологии КГМУ, кафедры фармакологии Орловского государственного университета и кафедры фармхимии и фармакогнозии Белгородского государственного университета.

Апробация работы. Материалы работы доложены на итоговых научных сессиях и международных конференциях молодых ученых КГМУ в 2002-2010гг.; VI Международной конференции «Биоантиоксидант»; VIII, XIV Национальных конгрессах «Человек и лекарство»; I, II Национальных конгрессах терапевтов; VII съезде аллерголов и иммунологов СНГ; VI Международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств»; II Российской научно-практической конференции; Российском национальном конгрессе кардиологов «От исследований к клинической практике»; Международной научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy - clinical practice»; XIV Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации. Апробация диссертации проведена на научно-практической конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии и фармакотерапии, инфекционных болезней, анатомии человека, ЛОР-болезней, микробиологии, вирусологии, иммунологии, биохимии и НИИ экологической медицины Курского государственного медицинского университета. По материалам диссертации опубликовано 37 печатных работ, в том числе 12 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые разработанные методики реактивной поствакцинально-васкулитной и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции в сочетании с моделью L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, характеризующиеся изменением соотношений сосудистых реакций на ацетилхолин (эндотелийзависимая вазодилатация) и нитропруссид (эндотелийнезависимая вазодилатация) с увеличением КЭД, нарушением продукции NO, повышением биохимического маркера воспаления ФНОб, а также отрицательной динамикой морфофункциональных показателей сердечно-сосудистой системы, являются адекватными и информативными моделями и полностью охватывают все возможные механизмы эндотелиальной дисфункции.

2. Эндотелио- и кардиопротективные эффекты исследованных макролидных антибиотиков на моделях коронароокклюзионного инфаркта миокарда, L-NAME-индуцированной, реактивной поствакцинально-васкулитной и сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического и клинического изучения данных препаратов в качестве потенциальных эндотелиопротекторов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 710 источников, из них 98 отечественных и 612 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 322 страницах машинописного текста, содержит таблиц - 23, рисунков - 58, схем - 7.

Материал и методы исследований

Опыты проводились на белых-крысах самцах линии Wistar массой 200-300 г и кроликах самцах породы шиншилла массой 3,0 - 3,5 кг.

В ходе экспериментального исследования животные подразделялись на следующие группы: группа интактных животных (n=10), группа с моделированием патологии (n=10), группа с коррекцией патологии макролидом в «малой» дозе 10 мг/кг (n=10), группа с коррекцией патологии макролидом в «большой» дозе 30 мг/кг (n=10).

Коронароокклюзионный инфаркт миокарда моделировали на крысах путем наложения лигатуры на переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии (Коган А.Х., 1979). На 2-е сутки гравиметрическим методом определяли массу некротизированной ткани в процентах от массы левого желудочка.

N^G-нитро-L-аргинин метиловый эфир (L-NAME) вводился крысам-самцам ежедневно один раз в сутки, внутрибрюшинно, в дозе 25 мг/кг. На 8-й день от начала эксперимента при моделировании L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота под наркозом вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей. Болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряли непрерывно посредством датчика и компьютерной программы «Bioshell». Функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (J.B. Laursen, 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Исследование сократимости миокарда после моделирования патологии проводили у наркотизированных крыс, находящихся на управляемом дыхании. Полость левого желудочка зондировали иглой через верхушку сердца и посредством датчика Р23ID «Gould» (США), АЦП L-154 и компьютерной программы «Bioshell» регистрировали показатели кардиогемодинамики (левожелудочковое давление (ЛЖД), максимальную скорость сокращения (+dp/dt max), максимальную скорость расслабления (-dp/dt max), частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности:

1. Проба на адренореактивность - внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1^.10^-5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г (Меерсон Ф.З., 1980).

2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30 сек (Меерсон Ф.З., 1980).

3. 3-х минутная гипоксия (Пашин Е.Н., 1993).

Биохимические маркеры эндотелиальной дисфункции. Использована модификация метода определения стабильных метаболитов NO, позволяющая после депротеинизации сыворотки крови проводить одноэтапное количественное определение суммарных нитратов и нитритов (Метельская В.А., Гуманова Н.Г., 2005). Принцип метода заключается в одновременном восстановлении нитратов в нитриты в присутствии хлористого ванадия и реакции диазотирования с последующим развитием окраски.

Определение ФНО-б в сыворотке крови выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью многоканального фотометра «Multiskan MCC-340» («Labsystems», Espoo, Финляндия). Оценка их уровня проводилась с помощью коммерческих тест-систем «Rat TNF-alpha»", ELISA производства Bender MedSystems GmbH (Австрия) и «TNF-alpha/TNFSF1A Recombinant Rabbit TNF-alpha» R&D Systems (USA) по инструкции производителя.

Моделирование реактивной поствакцинально-васкулитной ЭД (РПВВ ЭД) проводили на кроликах-самцах путем введения вакцины Salmonella Typhi («Тифивак» вакцина брюшнотифозная спиртовая сухая, Р№ 000661/01, Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов) однократно подкожно в дозе 0,02 мл/кг. Температуру тела животного измеряли электронным термометром per rectum каждые 8 часов в течение 3 суток (Hingorani А., 2000). Через 8, 24, и 48 часов после вакцинации брались анализы крови из краевой вены уха. На вторые сутки от начала эксперимента под наркозом проводили функциональные пробы: внутривенное введение ацетилхолина (40 мкг/кг) (Laursen J. B., 1997) и нитропруссида натрия (30 мкг/кг) (Галаган М.Е., 1991).

Моделирование сепсис-индуцированной ЭД проводили на белых крысах-самцах линии Wistar массой 200-300 г. На спине фиксированных и наркотизированных животных выбривали шерсть и, соблюдая правила асептики и антисептики, подкожно вводили 0,1 мл стафилококкового анатоксина (анатоксин стафилококковый очищенный адсорбированный производства Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва). Через 24 часа вводили подкожно свежую взвесь Staphylococcus aureus (штамм 603, взятую из музея кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии КГМУ) в концентрации 60 миллиардов микробных тел в 1 мл (в то же место, что и анатоксин). Проводили ежедневный компрессионный, пневматический массаж в течение 10 минут (Мержвинский И.А., 1998). Забор крови в количестве 5 мл с тщательным соблюдением асептики и антисептики производили из правого желудочка сердца на 3, 6, 9, 12 и 15-е сутки после проведения функциональных проб. Для подтверждения диагноза «сепсис», вызванного именно Staphylococcus aureus 603, проводился бактериологический посев крови, после чего культура идентифицировалась как исходная (Staphylococcus aureus 603) с помощью определения факторов патогенности и фаготипа. Кроме этого, подсчитывали количество колониеобразующих единиц стафилококка в 0,1 мл крови.

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и комплексной оценки эффективности препаратов проведено гистологическое исследование сердца и почек. Для этого кусочки данных органов фиксировали в 10% нейтральном формалине на 0,1 М фосфатном буфере рН= 7,2 и заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 7-10мкм окрашивали гематоксилином Рего и эозином. При иммерсионном увеличении микроскопа в почках определяли количество ядросодержаших клеток в одном клубочке, а в сердце с помощью окуляр-микрометра измеряли толщину кардиомиоцитов среднего (циркулярного) слоя миокарда левого желудочка.

Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективных эффектов исследуемых препаратов.

Для комплексной оценки функциональных характеристик сосудистой реактивности, сократимости миокарда, нитроксидергической системы и морфологических характеристик миокарда на основе интегрального анализа всего спектра проводимых исследований мы представили значение каждого показателя в виде вектора. Все вектора, каждый из которых соответствовал определенной нагрузочной пробе, были построены на плоскости в прямоугольной декартовой системе координат Оху, полюсом для всех векторов было выбрано начало прямоугольной декартовой системы координат, полярной осью служило положительное направление оси Оу, длина вектора равнялась величине каждого показателя функционально-морфометрической оценки эндотелио- и кардиопротективного эффекта нагрузочной пробы. Направление каждого вектора задавалось жестко, 1-й вектор - САД (систолическое артериальное давление) совпадал с осью 0у, последующие вектора располагались в порядке проведения нагрузочной пробы по часовой стрелке, угол между соседними векторами составлял 60°. Следующими векторами соответственно обозначены показатели - ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; КМЦ - диаметр кардиомиоцитов - нагрузка объемом; NO_х - суммарное количество нитратов и нитритов (Total NO); ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия). Площадь векторной диаграммы рассчитывали по формуле:

,

где S - площадь векторной диаграммы,

х_i и у_i-- прямоугольные координаты соответствующих векторов,

n - количество векторов.

Различия между соответствующими функциональными, биохимическими и морфологическими показателями при проведении исследований между изучаемыми группами интактных, контрольных и опытных групп животных отражаются площадью диаграмм, образованной соединением конечных точек векторов вышеуказанных показателей.

Обоснование доз и дизайн эксперимента. Исследована эндотелиотропная и кардиотропная активность макролидных антибиотиков: 15-членного азалида азитромицина (азитромицин - субстанция азитромицина моногидрата, серия 0001/2 (Chem-East LTD)), 14-членных макролидов: рокситромицина (Рулид^® таб. 150 мг, Aventis/ «Hoechst Marion Roussel», Индия), кларитромицина (Клабакс^® таб. 250мг («Ranbaxi», Индия)); 16-членных макролидов: джозамицина (Вильпрафен^® таб. 500 мг («Yamanouchi Pharma», Италия)) и мидекамицина (Макропен^® таб. 400мг («KRKA», Словения)) в дозах 10 и 30 мг/кг.

В хронических экспериментах при моделировании L-NAME-опосредованного дефицита оксида азота макролиды вводились в соответствующих дозах один раз в сутки внутрижелудочно в течение 7 дней за 20 минут до введения L-NAME. При моделировании РПВВ ЭД азитромицин вводился один раз в сутки внутрижелудочно за 20 минут до введения вакцины. При моделировании сепсис-индуцированной ЭД азитромицин вводился один раз в сутки внутрижелудочно за 20 минут до проведения компрессионного массажа в течение 6 дней. При моделировании острой модели коронароокклюзионного инфаркта макролиды вводили внутрижелудочно однократно в дозах 10 и 30мг/кг.

Принятая схема соответствует основной массе экспериментальных исследований и соответствует данным доступной литературы (Ianaro A., 2000; Parchure N., 2002; Stone A.F., 2002; Aktan B., 2003; Hillis G.S., 2004) и выявляет эффективное кардиопротективное действие препаратов в экспериментах, ранее проведённых в нашей лаборатории.

Достоверность наблюдавшихся при действии исследованных препаратов изменений параметров как абсолютных, так и в приростах от исходного уровня определяли разностным методом описательной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней ошибки средней арифметической (m) и вероятности возможной ошибки (р), рассчитанной с использованием t-test для групп с различной дисперсией. Различия оценивали как достоверные, при р<0,05. Для расчётов использовали программу для статистического анализа Microsoft Excel 7.0.

Результаты исследований и их обсуждение

1. Исследование влияния макролидов на летальность и зону некроза при моделировании острого коронароокклюзионного инфаркта миокарда (ИМ)

По результатам исследования влияния макролидов на летальность животных в первые сутки после коронароокклюзии обнаружено существенное улучшение выживаемости животных по сравнению с контрольной группой. Малые дозы препаратов оказались менее эффективными. По степени эффективности воздействия препараты в дозе 10 мг/кг можно расположить в следующей последовательности: рокситромицин >азитромицин >джозамицин >мидекамицин, кларитромицин. В большей дозе максимальный эффект в снижении летальности показали азитромицин и кларитромицин, затем следует рокситромицин, и далее мидекамицин. Дозозависимость проявили 14- и 15-членные макролиды (рис. 1).

Рисунок 1. Влияние макролидов в дозах 10 и 30 мг/кг на летальность крыс в первые сутки после моделирования коронароокклюзионного инфаркта миокарда. Примечания: * - при р<0,05 в сравнении с контрольной группой ИМ; ^{у -} при р<0,05 в сравнении с дозой 10 мг/кг.

На вторые сутки коронароокклюзии гравиметрическим методом у выживших животных определяли величину зоны экспериментального некроза миокарда. Полученные данные свидетельствуют об отчетливом кардиопротективном эффекте препаратов в отношении ограничения некротизированного участка (рис. 2). Малые дозы макролидов оказались в целом менее эффективными. Наиболее успешными оказались азитромицин и рокситромицин, затем следовали кларитромицин и джозамицин. Мидекамицин же проявил себя минимально.

Дозозависимость обнаружена среди 14- и 15-членных макролидов. При этом наблюдалась определенная связь между степенью эффективности препаратов по параметрам летальности и снижения зоны некроза миокарда.

Важно отметить, что кардиопротективный эффект макролидов в отношении способности ограничивать зону некроза миокарда сопоставим с действием в эффективных дозировках в-блокаторов, антагонистов кальция и нитратов, раннее исследованных в нашей лаборатории (Лебедев А.В., 1989; Пашина И.В., 1992; Конорев Е.А., 1985) (рис. 2).

Рисунок 2. Снижение зоны некроза левого желудочка крыс при моделировании коронароокклюзионного инфаркта миокарда в % на фоне применения препаратов различных фармакологических групп.

Данная модель патологии характеризовалась значительным повышением уровня провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли альфа (ФНОб). Наиболее эффективный препарат азитромицин в дозе 30 мг/кг снизил концентрацию ФНОб с 63,0±2,0 до 45,3±1,4 пг/мл (рис. 3), что свидетельствует о противовоспалительном действии азитромицина уже ко вторым суткам острого инфаркта миокарда.



Рисунок 3. Концентрация ФНОб в сыворотке крови животных с моделированием коронароокклюзионного ИМ.

Примечание: * - р<0,05 - по сравнению с интактными животными; **-р<0,05 - по сравнению с инфарцированными животными.

Развитие инфаркта миокарда происходило на фоне негативных изменений сосудистой стенки в виде пикноза, набухания, слущивания эндотелия и отека мышечного слоя (рис. 4 а). Коронароокклюзия на фоне предварительного введения макролидов сопровождалась менее выраженными поражениями стенок сосудов миокарда (рис. 4 б).

Морфологические исследования миокарда обнаружили протективное действие макролидов на эндотелий и кардиомиоциты ишемизированного очага. Таким образом, применение 14-, 15- и 16-членных макролидных антибиотиков, независимо от химической структуры препарата, оказывает значительный позитивный эффект при ишемическом повреждении миокарда.



Рисунок 4. а - инфаркт миокарда: выраженные изменения эндотелия сосудов миокарда в виде пикноза, набухания и слущивания; отек стенки артерии; б - инфаркт миокарда на фоне введения азитромицина. Изменения стенки артерии менее выражены - имеется пикноз ядер со слущиванием единичных клеток; отека стенки сосуда нет. Окраска гематоксилином и эозином; а, б - х280.

2. Исследование эндотелиопротективной активности азитромицина, рокситромицина, кларитромицина, джозамицина и мидекамицина при L-NAME-индуцированной модели дефицита NO

Внутрибрюшинное введение крысам-самцам L-NAME в дозе 25 мг /кг однократно в течение 7 суток, привело к стойкому повышению артериального давления (АД) (рис. 5). Обнаружено, что изучаемые препараты в разной степени снижали АД. Однако целевой уровень АД не достигался, и значения давления были выше значений интактных животных во всех сериях экспериментов. Максимальное снижение САД и ДАД наблюдалось лишь в группе с введением кларитромицина (10 мг/кг) и мидекамицина (30 мг/кг).

Рисунок 5. Влияние макролидов в дозах 10 и 30 мг/кг на систолическое АД (САД) и диастолическое АД (ДАД) при моделировании L-NAME (25 мг/кг внутрибрюшинно однократно в течение 7 дней) индуцированного дефицита NO.

Примечание: *- p<0,05 - по сравнению с интактными животными; ^# - при р<0,05 по сравнению с L-NAME.

При проведении функциональных проб с оценкой реакции на эндотелий-зависимое и эндотелийнезависимое расслабление нами использован коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющийся отношением площади среднего артериального давления на нитропруссид к площади среднего артериального давления на ацетилхолин (Покровский М.В., 2006).

В наших экспериментах КЭД в группе интактных животных составил 1,1±0,1, при L-NAME-индуцированном дефиците оксида азота - в 5 раз больше, его значение составило 5,4±0,6. Терапия макролидами различных групп в обеих дозах привела к достоверному снижению этого показателя до уровня интактных животных, что характеризует выраженное эндотелиопротективное действие исследуемых препаратов (рис. 6).

Рисунок 6. Влияние макролидов в дозах 10 и 30 мг/кг на коэффициент эндотелиальной дисфункции при моделировании L-NAME-(25 мг/кг внутрибрюшинно однократно в течение 7 дней) индуцированного дефицита NO. Примечание: * - p<0,05 - в сравнении с интактными,** - р<0,05 - в сравнении с L-NAME.

Развитие патологии привело к увеличению абсолютных значений ЛЖД при проведении пробы на адренореактивность. На фоне терапии макролидами обнаружено в разной степени предотвращение повышения адренореактивности (рис. 7).



Рисунок 7. Влияние макролидов в дозе 10 и 30 мг/кг на показатели сократимости левого желудочка сердца крыс при проведении пробы на адренореактивность при моделировании L-NAME (25 мг/кг внутрибрюшинно однократно в течение 7 дней) индуцированного дефицита NO.

Примечание: *- p<0,05 - в сравнении с интактными,** - р<0,05 - в сравнении с L-NAME.

Блокада NO-синтазы привела к снижению миокардиального резерва в пробе на нагрузку сопротивлением. Сократимость на 25-й секунде к 5-й секунде, взятой за 100% нагрузки, соответственно составила у интактных самцов 83,6±2,1, у животных с L-NAME-индуцированной патологией - 66,0±2,3%.

Весь ряд исследуемых препаратов предотвращал падение сократимости с 5-й на 25-ю секунду пережатия аорты, и результаты у животных, получавших макролиды в обеих дозах, оказались приближенными к интактной группе (рис. 8 А, Б). Учитывая, что проба на нагрузку сопротивлением направлена на выявление скрытой сердечной недостаточности, полученные результаты свидетельствуют о выраженном улучшении функционирования миокарда при введении исследуемых препаратов.



Рисунок 8. Влияние макролидов в дозе 10 мг/кг (А) и 30 мг/кг (Б) на показатели сократимости левого желудочка сердца крыс при проведении пробы на нагрузку сопротивлением на фоне моделирования дефицита оксида азота введением L-нитро-аргинин-метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно.

Примечание: * - р<0,05 - в сравнении с интактными; ^# - в сравнении со значениями контрольной серии (L-NAME).

Характерная динамика биохимических маркеров L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота представлена на рис .9. Так, концентрация нитрит-ионов (NOx) у животных, получивших L-NAME, составила 61,2±3,6, тогда как у интактных животных этот показатель был на уровне 114,1±4,1мкМоль.

Концентрация нитрит-ионов (NOx) под влиянием макролидов в больших дозах увеличивалась и статистически достоверно не отличалась от показателей интактных животных. Обращает на себя внимание, что малые дозы препаратов также увеличивали концентрацию нитрит-ионов NOx. Последнее позволяет предполагать, что обе дозы препаратов оказывают влияние на продукцию оксида азота на данной модели патологии. При этом дозозависимые эффекты наблюдались в группах 14- и 15-членных макролидов.

Рисунок 9. Влияние макролидов в дозе 10 мг/кг (А) и 30 мг/кг (Б) на концентрацию нитрит-ионов (NOx) в сыворотке крови интактных животных и животных с моделированием дефицита оксида азота введением L-нитро-аргинин-метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно (в мкМ).

Примечание: * - p<0,05 - в сравнении с L-NAME.** - р<0,05 - в сравнении с интактными.

Здесь и на следующем рисунке:

I - Интактные самцы

II - L-NAME

III - L-NAME+азитромицин

IV - L-NAME+ рокситромицин

V - L-NAME+мидекамицин

VI - L-NAME+ кларитромицин

VII - L-NAME+ джозамицин

Подтверждением функционально-биохимических показателей, отражающих развитие L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции, явились результаты морфологических исследований (рис. 10). На представленных гистологических препаратах а - интактные кардиомиоциты, б - кардиомиоциты животных с L-NAME-патологией. При этом очевидно резкое увеличение площади поперечного сечения кардиомиоцитов при сохраненном диаметре ядер в группе животных, получавших L-NAME. Морфометрические исследования показали, что у интактных животных поперечное сечение составило 9,1±1,2, а у животных с патологией 18,4±2,2 мкм (рис. 11). Данные морфометрических исследований продемонстрировали, что все изучаемые вещества в разной степени предотвращают развитие гипертрофии миокардиоцитов.

Рисунок 10. Морфология миокарда у интактных и опытных животных: а - гистологическая картина миокарда у интактных крыс. Цитоплазма и ядра имеют сходную величину, признаков гипертрофии нет; б - выраженная гипертрофия ядер и цитоплазмы кардиомиоцитов у крыс с артериальной гипертензией, индуцированной введением L-NAME. Окраска гематоксилином и эозином. а, б - х 280.



Рисунок 11. Влияние макролидов в дозе 10 мг/кг (А) и 30 мг/кг (Б) на диаметр кардиомиоцитов у животных с моделированием дефицита оксида азота введением L-нитро-аргинин-метилового эфира (L-NAME) в дозе 25 мг/кг внутрибрюшинно (в мкм).

Примечание: * - при p<0,05 - в сравнении с L-NAME; ** - при р<0,05 - в сравнении с интактными

Морфометрия диаметра кардиомиоцитов показала преимущество больших доз азитромицина (11,3±1,6), рокситромицина (13,1±2,2) и кларитромицина (13,3±1,5) в отношении предотвращения гипертрофии. Минимальный эффект наблюдался у 16-членных макролидов.

Интегральный векторный анализ гемодинамических, биохимических и морфологических показателей в комплексной оценке эндотелио- и кардиопротективной активности макролидов определяет характеристику функции эндотелия и сократимости миокарда с использованием нескольких основных параметров. Следующие показатели были представлены в виде векторов: систолическое артериальное давление; диастолическое артериальное давление; коэффициент эндотелиальной дисфункции; концентрация нитрит-ионов (NO_x) в сыворотке крови; диаметр кардиомиоцитов; нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия). Векторные значения выбранных показателей были представлены в процентном отношении от соответствующих значений группы интактных животных, принятых за 100%, площадь векторной диаграммы выражалась в условных единицах (усл. ед.).

Сравнение площадей векторных диаграмм выявило выраженные различия между группой интактных животных, животных с моделированием L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота и групп животных с фармакологической коррекцией вышеуказанными препаратами. В группе интактных животных расчётная площадь составляет 5,48±0,3 усл. ед., в группе с моделированием L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота - 10,12±1,2 усл. ед., что отличается в 2 раза и принимается за наибольшую степень выраженности сочетанных сосудистых, гемодинамических, биохимических и морфологических нарушений. Различие в площади векторных диаграмм визуализирует комплексную характеристику морфофункционального состояния сердечно-сосудистой системы, отражая отличия между группами в степени изменения показателей артериального давления, КЭД, диаметра кардиомиоцитов, исчерпании миокардиального резерва и NO-продуктивной активности эндотелия (рис. 12).

Применение данного подхода комплексной оценки позволило выявить степени активности в группе изучаемых препаратов в отношении коррекции нарушений метаболического пути L-аргинина/NO при моделировании L-NAME-индуцированного оксида азота. Наиболее выраженной активностью в дозе 10 мг/кг обладают рокситромицин (6,15±0,2 усл. ед.) и азитромицин (6,35±0,5 усл. ед.), наименьшей - мидекамицин (7,16±0,2 усл. ед.) и кларитромицин (7,07±0,4 усл. ед.), промежуточное положение занимает джозамицин (6,80±0,3 усл. ед.).

Макролиды всех пяти групп в дозе 30 мг/кг достоверно усиливают интегральную протективную активность в отношении L-NAME-индуцированного дефицита оксида азота, что выражается в большом приближении значений площадей к группе интактных животных. Максимальное снижение площади происходило в группе с азитромицином и рокситромицином, далее следовал кларитромицин, мидекамицин и джозамицин, которые показали схожие цифры площадей, хотя и отличались несколько по форме (рис. 13).

Рисунок 12. Площади векторных диаграмм показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции макролидами в дозе 10 мг/кг.

Примечание: * -р<0,05 по сравнению с интактными; , ^#- р<0,05 - в сравнении с L-NAME; САД - систолическое артериальное давление; ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; КМЦ - диаметр кардиомиоцитов; NO - суммарное количество нитратов и нитритов (Total NO); ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия).

Из предложенных шести показателей - САД, ДАД, коэффициент эндотелиальной дисфункции (КЭД), диаметр кардиомиоцитов (КМЦ), суммарное количество нитратов и нитритов (NO_х), показатели миокардиальной пробы с нагрузкой сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия, ПА 5-25), при L-NAME-индуцированном моделировании дефицита оксида азота, только КЭД имеет дельту (?) по отношению к показателю у интактных животных в 500%, остальные показатели соответственно: САД - 138%, ДАД - 142%, КМЦ - 203%, NO - 54%, ПА 5-25 - 79%. Таким образом, сумма ?_{САД. ДАД, КМЦ, NOх, ПА 5-25}= 616% сопоставима с ?_КЭД. Отсюда, очевидно, что предложенный подход в своём интегральном виде преимущественно показывает эндотелиальную составляющую интегрального протективного эффекта при L-NAME-индуцированном дефиците NO.

Анализ эффективности изученных путей фармакологических воздействий на патогенетические механизмы развития ишемических повреждений миокарда и эндотелиальную дисфункцию показал, что все группы макролидов проявляют выраженную кардио- и эндотелиопротективную активность и при интегральной оценке эффективности располагаются в следующем порядке: 15-членный азалид азитромицин в дозе 30 мг/кг>14-членные макролиды рокситромицин и кларитромицин в дозе 30 мг/кг>15-членный азитромицин в дозе 10 мг/кг>14-членные макролиды рокситромицин и кларитромицин в дозе 10 мг/кг>16-членные макролиды мидекамицин и джозамицин в дозах 10 и 30 мг/кг.

Таким образом, для дальнейшего исследования выбран наиболее эффективный препарат азитромицин в дозе 30 мг/кг.



Рисунок 13. Площади векторных диаграмм показателей при коррекции эндотелиальной дисфункции макролидами в дозе 30 мг/кг.

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с интактными; ^# - р<0,05 - в сравнении с L-NAME; САД - систолическое артериальное давление; ДАД - диастолическое артериальное давление; КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции; КМЦ - диаметр кардиомиоцитов; NO - суммарное количество нитратов и нитритов (Total NO); ПА 5-25 - нагрузка сопротивлением (отношение прироста сократимости миокарда на 5-й сек пережатия аорты к 25-й сек пережатия).

3. Исследование эндотелиопротективной активности азитромицина при реактивной поствакцинально-васкулитной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований

Эпидемиологические и клинические исследования позволяют предположить связь между инфекцией или воспалением и риском сердечно-сосудистых заболеваний (Keaney J.J., 2002; Smeeth L., 2007). В нашем исследовании брюшнотифозная вакцина «Тифивак» была использована для индуцирования острой воспалительной реакции сосудистого русла интактных кроликов, что подтверждалось повышением температуры тела животного и ростом уровня провоспалительного цитокина ФНОб в крови. При адгезии Salmonella typhi на макрофагах кроликов происходит стимуляция экспрессии мРНК, кодирующих ИЛ-1в, ИЛ-6, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМКСФ), что приводит впоследствии к системному повреждению эндотелиальных клеток (Никитин А.В., 2004).

Уровень в плазме важнейшего регулятора воспалительных и иммунных процессов - провоспалительного цитокина ФНОб составлял 12,8±0,5 пг/мл. Через 8 ч после назначения полисахаридной вакцины наблюдалось значительное увеличение уровня ФНОб до 61,0±6,3 пг/мл. Затем в исследованные промежутки времени этот показатель постепенно повышался и на вторые сутки эксперимента достигал значения 84,1±0,3 пг/мл. В дальнейшем его содержание снизилось до 50,1±1,3 пг/мл, что отражало интенсивность происходящих воспалительных реакций в организме.

Показатели гемодинамики были определены у интактных животных и у вакцинированных кроликов через 48 и 72 часа после введения вакцины. Вакцинация не оказала эффект на кровяное давление или частоту сердечных сокращений (ЧСС). Так, среднее АД у интактных кроликов составляло 104,7±3,2 мм рт. ст., у вакцинированных животных существенно не изменилось - 114,4±4,2 мм рт. ст. (48 часов) и 102,3±1,7 мм рт. ст. (72 часа). ЧСС составляла 292,1±33,0 уд./мин в контрольной группе, 302,4±20,1 уд./мин (48 часов) и 300,1±53,0 уд./мин (72 часа) соответственно при вакцинации.

В данном исследовании время сосудистой реакции на ацетилхолин через 48 ч после вакцинации было сокращено на 52,2% (с 72,8±5,0 до 38,0±3,5 сек). Следует отметить, что реакция на донор оксида азота (нитроглицерин) несколько увеличилась с 103,5±10,4 до 145,6±7,4 секунды. Эффект эндотелийзависимой вазодилатации вернулся к нормальному уровню через 72 часа.

Показатель, характеризующий степень эндотелиальной дисфункции, - КЭД составил 1,1±0,2 у интактной группы, 3,9±0,5 - через 48 часов у животных, получавших «Тифивак» (рис. 14 А). Через 72 часа КЭД снизился до нормальных значений. Полученная на 2-е сутки вакцинации достоверная разница КЭД в 3,5 раза может свидетельствовать о возможности использования модели реактивного васкулита в оценке фармакологической коррекции эндотелиальной дисфункции.

Животные на 2-е сутки вакцинации получали внутрижелудочно азитромицин в дозе 30 мг/кг, при этом КЭД достоверно снижался и соответствовал значению 0,9±0,1, что характеризует выраженное эндотелиопротективное действие азитромицина (рис. 14 А).

Противовоспалительная активность азитромицина подтверждалась данными о снижении содержания в крови ФНОб. Данный макролид достоверно понизил концентрацию провоспалительного цитокина на 51,8% (рис. 14 Б). При этом азитромицин 30 мг/кг несколько снизил содержание нитрит-ионов в плазме лабораторных животных на данной модели дисфункции эндотелия (с 123,9±3,0 до 111,6±4,4 мкМоль).



Рисунок 14. Влияние азитромицина (30 мг/кг) на коэффициент эндотелиальной дисфункции (А) и на концентрацию ФНОб в сыворотке крови (Б) на вторые сутки при моделировании реактивной поствакцинально-васкулитной ЭД путем введения вакцины Salmonella Typhi («Тифивак») однократно подкожно в дозе 0,02 мл/кг.

Примечание: * - p<0,05 - в сравнении с интактными, ** - р<0,05 - в сравнении с вакцинированными животными.

Здесь и на следующем рисунке:

I - интактные самцы

II - РПВВ ЭД

III - РПВВ ЭД+азитромицин

Морфологические исследования почек на 2-е сутки РППВ ЭД показали развитие картины острого гломерулита в виде резкого увеличения количества в клубочках ядросодержаших клеток - лейкоцитов, мезангиальных макрофагов, пролиферирующих эндотелиальных клеток (рис.15 а).

Введение азитромицина на фоне предварительного вакцинирования достоверно снижает степень иммуновоспалительной реакции в клубочках почек (рис 15 б, 16).



Рисунок 15. Почка кролика с экспериментальной аллергией (а). Количество ядросодержащих клеток в клубочках заметно увеличено (гломерулит). Почка кролика с экспериментальной аллергией на фоне введения азитромицина (б). Количество ядросодержащих клеток в клубочках близко к нормальному. Окраска гематоксилином и эозином. а, б - х 280.

Рисунок 16. Влияние азитромицина 30 мг/кг на среднее количество ядросодержащих клеток в почечном клубочке у кроликов разных экспериментальных групп.

Примечание: * - p<0,05 - в сравнении с интактными, ** - р<0,05 - в сравнении с вакцинированными животными.

Таким образом, позитивные морфологические изменения в клубочках почек подтверждают протективный эффект азитромицина на модели РПВВ ЭД.

4. Исследование эндотелиопротективной активности азитромицина при моделировании сепсис-индуцированной эндотелиальной дисфункции с использованием результатов функциональных проб, биохимических маркеров и морфологических исследований.

Исследования показали, что септический процесс влияет на функции эндотелия, в частности на эндотелийзависимую вазодилатацию, вызванную ацетилхолином. При этом максимальное повышение КЭД в 2 раза обнаружено на 6-е сутки эксперимента, когда его значение составляло 2,1±0,3 усл. ед. по сравнению с контрольной группой - 1,1±0,1 усл. ед. Далее наблюдалось постепенное снижение коэффициента эндотелиальной дисфункции: 9-е сутки - 1,8±0,4, 12-е - 1,8±0,5, и, наконец, на 15-е сутки значение КЭД приближался к уровню животных без патологии - 1,3±0,0 усл. ед. Причем при посеве гемокультуры, взятой в указанные промежутки времени, рост колоний золотистого стафилококка наблюдался в каждой из исследованных проб, за исключением последней. То есть на 15-е сутки в крови не обнаруживалось бактерий и реактивность эндотелия сосудов приближалась к исходным значениям (рис. 17).

...