19

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Возможности экспертных диагностических систем в онкоморфологии на примере опухолей предстательной железы, эндометрия и кишечника

14.03.02 - Патологическая анатомия

доктора медицинских наук

Федосенко Константин Владимирович

Санкт-Петербург, 2010

Работа выполнена в СПб ГУЗ «Городское патологоанатомическое бюро», на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Ковальский Георгий Борисович

Официальные оппоненты:

Ариэль Борис Михайлович, профессор, д.м.н., зав.отд.морфологии НИИ Фтизиопульмонологии

Аничков Николай Мильевич, чл.-корр. РАМН, ЗДН, профессор, д.м.н., зав.кафедрой пат.анатомии Медицинской академии им.И.И.Мечникова

Мацко Дмитрий Евгеньевич, профессор, д.м.н., зав.отделом морфологии НИИ онкологии им.Н.Н.Петрова

Ведущая организация: ФГУ ВПО Медицинская академия последипломного обучения

Защита состоится «_________»___________________ 2010 г. в _______ часов на заседании диссертационного совета Д.208.090.03 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова» (197089, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, д. 6/8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного Медицинского Университета им.акад. И.П.Павлова.

Автореферат разослан «_______» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Владимир Филиппович Митрейкин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Раки предстательной железы, эндометрия и толстой кишки являются одними из самых распространенных онкологических заболеваний, и смертность при них не снижается (Чиссов В.И., Старинский В.В., 1998, 2000; Давыдов М.И., 2000; Мерабишвили В.М., 2001; Ковальский Г.Б 2008). В известной мере это связано с тем, что возможности прижизненной морфологической диагностики новообразований ограничены объективными трудностями проведения границы между микроскопическими картинами злокачественной и доброкачественной опухоли, гиперпластическими изменениями в тканях и вариантами нормы. Диагностические проблемы представляют и те случаи, когда исследуемого материала мало, биопсийный материал взят вблизи опухоли, а не из основного патологического очага, особенно на этапе «предболезни».

В рекомендациях ВОЗ (2007) сделана попытка описания морфологических критериев дифференциальной диагностики патологических процессов. В ряде случаев могут существенно помочь гистохимические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические методы анализа.

Тем не менее, в практической работе нередко возникает определенный диагностический пробел, когда даже комплексная оценка биопсийного и операционного материала не позволяет подойти к его однозначной трактовке. Ситуация обусловлена объективными факторами, так как начальные изменения тканевой организации, связанные с нарушением тканевых и межклеточных взаимоотношений, - это комплекс неявных, морфологически неотчетливых изменений, предшествующих или сопровождающих развитие новообразования (Willis R.A., 1954; Susnik et al., 1994; Partin A.W., 1995-2000; Mairinger T., 1999; Bartels P.H., 1999; Montironi R., 1999; Bostwick D.G. et.al., 1999, 2000; Schlomm T. et.al., 2009).

Поскольку клетка является элементом многоклеточной системы - организма, она, естественно, взаимодействует с окружающими клетками и межклеточным матриксом, причем такая функция является основой для поддержания целостности морфологической структуры ткани и органа. Мезодермальные клетки играют ведущую роль в межклеточных взаимодействиях, а они, в свою очередь, определяют формирование различных тканевых систем и органов (Заварзин А.А., 1967, 1976, 1982, 1986).

Мысль о том, что строма опухоли может оказывать существенное влияние на биологические свойства новообразования, высказывалась во многих работах. Установлено, что развитие, дифференцировка, пролиферация и программируемая гибель эпителия в различных органах находятся под контролем стромального микроокружения. В связи с этим изучение эпителиально-стромальных взаимоотношений при канцерогенезе приобретает особое значение, так как уровень неопластической прогрессии детерминируется органоспецифической стромой. Результатом межклеточных сигналов является формирование «полевых эффектов» в ткани (Журавлева Т.Б., Прочуханов Р.А., 1970 - 1990; Cooper C.R., 2003; Chung L.W., 1988; Sung S.Y., Chung L.W., 2002).

Попытки изучения таких «полевых эффектов» предпринимались рядом исследователей, которые пришли к выводу, что в строме, граничащей с инвазивной опухолью, существует “фактор рассеяния”, который принимает участие в контакте мигрирующих клеток опухоли с внеклеточным матриксом (Wernert N., 1997). Тонкие изменения структуры ядерного хроматина появляются при предраковых изменениях в предстательной железе (Montironi R. et.al., 1993-1999). Было установлено также, что опухолевый молекулярный фенотип может выявляться и в нормальных тканях (Ananthanaryanan V. et al., 2006; Schlomm T. et.al., 2009).

Очевидно, одним из путей улучшения качества ранней диагностики новообразований и решения проблем прогноза является углубленная оценка эпителиально-стромальных взаимоотношений, как в самой опухоли, так и в прилежащих тканях - перитуморозной зоне.

Посвящая свою работу анализу тканевых изменений в перитуморозной зоне (зоне «опухолевого поля») с использованием этой информации для создания диагностических экспертных систем, хочется подчеркнуть особую актуальность исследований перитуморозной зоны. Это связано с тем, что речь идет о той зоне опухолевого поля, которая является тканевым источником роста бластомы и именно в ней происходят наиболее ранние изменения, связанные с зарождением новообразования. В повседневной работе патологоанатома часто бывает, что сама опухоль не попадает в анализируемый образец ткани. В таком случае материалом исследования становятся ткани, имеющие морфологию нормальных или с признаками доброкачественных гиперпластических и/или диспластических изменений. Корректное решение вопроса, есть ли злокачественное новообразование вблизи от верифицируемого образца ткани, с применением рутинных методов морфологической диагностики невозможно, так как собственно тканевого опухолевого субстрата в исследуемом материале нет.

Многие авторы акцентируют внимание на то, что, несмотря на ключевое значение патоморфологии для диагностики большого спектра заболеваний, высока вероятность ошибок, связанных с субъективностью патологоанатомических оценок. Так, по данным ВОЗ (2007), чаще всего в силу субъективных причин диагностические ошибки в онкоморфологии достигают 5% даже в лучших специализированных лабораториях. Известные же в настоящее время разработки информационных медицинских систем не всегда улучшают качество диагностики как в онкоморфологии, так и при других тяжелых заболеваниях. Это определяется, на наш взгляд, ограничениями, заложенными в самих принципах построения информационных систем, а также отставанием внедрения методов количественного структурного анализа в клиническую морфологию.

Целью исследования является улучшение качества ранней диагностики новообразований посредством разработки и практического внедрения экспертных автоматизированных систем диагностики опухолей.

Задачи исследования:

1. Разработка принципов формирования автоматизированных экспертных систем для решения вопросов диагностики и прогнозирования в онкоморфологии.

2. Создание автоматизированных диагностических систем выявления рака предстательной железы, эндометрия и толстой кишки по морфологическим изменениям тканей в перитуморозной зоне.

3. Оценка результатов практического применения экспертных диагностических систем в онкоморфологии и его перспектив.

4. Выявление особенностей эпителиально-стромальных взаимоотношений в перитуморозной зоне рака предстательной железы, эндометрия и толстой кишки.

5. Разработка методов количественной оценки эпителиально-стромальных взаимоотношений при фоновых процессах в перитуморозной зоне.

6. Оценка фоновых процессов в перитуморозной зоне в зависимости от локализации, степени злокачественности и пролиферативной активности в опухоли как таковой, а также с учетом отдаленности перитуморозной зоны от самой опухоли.

Научная новизна исследования. Сформулирован принципиально новый научный подход к использованию информационных технологий в диагностической онкоморфологии и представлено теоретическое обоснование целесообразности такого подхода. Показано, что одним из решающих моментов эффективной работы экспертной диагностической системы является наличие адекватного классификатора, при разработке которого необходимо принимать во внимание ряд априорных соображений, касающихся морфологической специфики той или иной опухоли. При этом разработка классификатора должна иметь конкретную адресную направленность, для того чтобы обеспечить высокую специфичность диагностического метода.

Проведено пилотное исследование, направленное на разработку экспертных систем диагностики раков предстательной железы, эндометрия и толстой кишки. Впервые дана качественная и количественная характеристика перитуморозной зоны опухолевого роста с использованием методов многомерной статистики и дискриминантного анализа и показана высокая специфичность и чувствительность методов морфологической диагностики опухолей с учетом особенностей перитуморозной зоны. С новых позиций многомерной статистики охарактеризован ряд особенностей эпителиально-стромальных взаимоотношений при оккультном раке. Показано, что с помощью предложенных в диссертации оригинальных инновационных технологий существенно расширяются возможности ранней диагностики рака даже при отсутствии в анализируемом препарате элементов опухоли как таковых.

Практическая значимость. Разработанные экспертные диагностические системы позволяют выявлять новообразования предстательной железы, эндометрия и кишечника не только по изменениям в тканях опухоли, но и по перифокальным процессам в зоне опухолевого поля. Результаты практического применения экспертных систем в патоморфологических лабораториях лечебных учреждений показали возможность ранней диагностики этих злокачественных новообразований по фоновому процессу, независимо от наличия в гистологическом препарате признаков, типичных для карциномы. Использование для верификации бластом других органов высокотехнологичных информационных методов, разработанных в данной диссертации, обеспечит их своевременное высоко эффективное распознавание. Такая вполне корректная экстраполяция должна способствовать расширению списка морфологических критериев диагностики патологических процессов, находящихся в распоряжении патологоанатомов в настоящее время.

Личное участие автора в получении результатов. Автор провел данное диссертационное исследование в полном объеме на всех этапах, включающих формирование базы данных, статистическую обработку клинико-морфологических наблюдений и обобщение научных результатов.

Автор принимал участие в организации и проведении лабораторного и инструментального исследования, провел гистологические, иммуногистохимические исследования операционного и биопсийного материла всех больных, включенных в данную работу.

Автором сформулированы цель, задачи, основные идеи планирования исследования с его дизайном, разработаны методические и методологические подходы к решению поставленных задач, выполнены сбор, статистическая обработка материала, созданы алгоритмы диагностики раков предстательной железы, эндометрия и толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Общими принципами разработки и создания автоматизированных экспертных диагностических систем для ранней диагностики злокачественных опухолей являются:

а) Создание классификатора - обучающей выборки на основе априорных знаний, позволяющих оценить систему эпителий - соединительная ткань;

б) Настройка классификатора путем добавления информативных признаков и удаления неинформативных признаков, создающих «информационный шум»;

в) Проверка чувствительности и специфичности классификатора.

2. Фоновые процессы в опухолевом поле при злокачественной пролиферации - это качественно иное состояние системы эпителий - соединительная ткань, которое включает количественные и качественные изменения отношений различных классов эпителиоцитов, отношений эпителий - стромальные клетки, отношений между стромальными клетками.

3. Практическое применение вероятностной диагностики злокачественных новообразований по фоновому процессу, независимо от наличия в препарате признаков, типичных для этого процесса, не только возможно в принципе, но и реализовано практически при диагностике раков предстательной железы, эндометрия и толстой кишки.

Реализация и внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу СПб Городского патологоанатомического бюро (ГПАБ), СПб Городского клинического онкологического диспансера и Ленинградского областного патологоанатомического бюро.

Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на съездах онкоморфологов в онкологическом научном центре им.Н.Н. Блохина (Москва, 1998, 1999, 2000 гг.), на 3 Съезде Российского общества патологоанатомов в 2009 г., на обществе патологоанатомов Санкт-Петербурга и Ленинградской области в 1997 г., 2006, 2007 г.г., на пленуме правления Российского общества урологов в 1998 г., на заседании 3-го биохимического общества в Санкт-Петербурге в 2002., на VII Всероссийском онкологическом съезде в Москве в октябре 2009 г.

По теме диссертации опубликовано 23 научные работы в том числе в журналах, рецензируемых ВАК Минобразования и науки, - 9, в иностранных научных изданиях - 2. Издано научно-методическое пособие для врачей патологоанатомов. Имеется патент на изобретение №216461 в соавторстве с Александровым В.П., Печерским А.В., Тороповым А.В., зарегистрированный 20 сентября 2000 года Российским агентством по патентам и товарным знакам.

Объем и структура и диссертации. Диссертация построена по общепринятой схеме и включает в себя главы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, изложение результатов собственных исследований, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы и список 330 литературных источников (иностранных - 298, отечественных - 32). Диссертация написана на 265 страницах, имеет 71 рисунок и 43 таблицы.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Объектом исследования послужил архивный операционный и биопсийный материал предстательной железы, эндометрия и толстой кишки, полученный в патологоанатомических отделениях Санкт-Петербурга - МСЧ № 7, Городского патологоанатомического бюро, Городского клинического онкологического диспансера и Городской онкологической больницы № 8. Оценивались клинические сведения - пол, возраст, особенности течения заболевания и стадия онкологического процесса по системе TNM. Для морфологического исследования у больных злокачественными новообразованиями использовались как сами опухоли, так и окружающие их ткани - перитуморозная зона (ПТЗ).

При заболеваниях предстательной железы исследовался материал от 225 больных. В 205 случаях это был архивный операционный материал, в 20 - биопсийный. У 75 пациентов установлен диагноз рака предстательной железы. В группу сравнения вошли 145 наблюдений нодозной гиперплазии предстательной железы и 10 случаев «нормальной» простаты, взятой у умерших от ИБС в течение 4 часов после констатации смерти.

Опухоли предстательной железы были получены при аденомэктомиях, трансуретральных резекциях, биопсиях предстательной железы. В 35 случаях индекс Глисона оказался ?6, в 20 - >6. У 24 больных гистологически выявлены лишь единичные микрофокусы рака, в 33 имелся сплошной рост опухоли в большинстве исследованных срезов. В работе оценивалась частота обнаружения простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН). При изучении материала больных с нодозной гиперплазией предстательной железы (НГПЖ) ПИН легкой степени констатировали в 59 случаях (41%), тяжелой степени - в 12 (8,2 %).

Кроме того, в работе исследован операционный и биопсийный материал 32 женщин с высокодифференцированной аденокарциномой эндометрия. Группами сравнения здесь стали 35 наблюдений железисто-кистозной гиперплазии и 34 полипоза эндометрия.

Фон рака толстой кишки изучали в материале, полученном от 25 больных, оперированных по поводу рака кишки. Группой сравнения явились 28 больных с гиперпластическими полипами толстой кишки, иссеченными при колоноскопии. стромальный перитуморозный рак предстательный

В работе использовался комплекс гистологических, количественных гистохимических, морфометрических, иммуногистохимических методов и способов многомерной статистики.

В 25 случаях рака предстательной железы и 15 наблюдениях НГПЖ в этом органе оценивалась активность ядрышковых организаторов по методу Howell Black с некоторыми модификациями (Мамаев Н.Н. и соавт., 1986), а также экспрессия антигенов Ki-67, Bcl-2, мутантного гена p53, число рецепторов андрогенов, эстрогенов и прогестерона. Использовались первичные антитела фирмы DAKO, стрептавидин-биотиновый метод визуализации, в части случаев система визуализации Envision DAKO.

Подсчет клеток, в которых экспрессировались антигены Ki-67, Bcl-2, рецепторы стероидных гормонов, проводился при увеличении х250 не менее чем среди 2000 клеток опухоли и 2000 клеток эпителия ПТЗ.

Из парафиновых блоков готовили срезы, на которых ставилась реакция на суммарные нуклеиновые кислоты по методу Эйнарсона при pH 1,2. Эта методика позволяет оценить пространственное расположение и число свободных фосфатных группировок нуклеиновых кислот (НК) и дает интегральную оценку активности контрольно-информационной системы клетки. Количественные оценки реакции по Эйнарсону осуществлялись на анализаторе изображений в лаборатории экспертно-биопсийного отделения СПб ГПАБ. Сканирование изображений проводилось в монохроматическом свете при длине волны 520 нм при увеличениях объектива х25 и х40. Учитывая особенности данных объектов, в качестве тканевого “модуля” изображения был выбран участок среза, включавший фрагмент железы с просветом и прилежащей к ней стромы.

В соответствии с разработанным алгоритмом в каждом препарате измерения проводились в 15-20 стандартных полях зрения, которые выбирались интерактивно, поскольку каждое поле должно было содержать не менее одного железистого фрагмента, то есть не менее 30 клеток эпителия желез предстательной железы, эндометрия или толстой кишки с прилегающим участком стромы. Программа идентификации тканевых и клеточных структур включала в себя выделение следующих компонентов изображения: просвет железы, ядра клеток эпителия и ядра клеток стромы. Выбирались такие участки, где имелся эпителий, занимающий около 1/3 изображения, и участок прилежащей стромы. Разделение эпителия и стромы на изображениях проводилось в интерактивном режиме.

Для количественной оценки элементов гистогематического барьера использовалась система анализа изображений с программным обеспечением “Neurovision”, позволяющая идентифицировать ядра клеток и описывать их базовыми признаками: 1) оптическая плотность НК ядра клетки; 2) дисперсия оптической плотности ядра; 3) площадь ядра; 4) коэффициент формы (КФ) ядра.

В автоматическом режиме удалось установить 3 группы эпителиальных клеток и 4 группы клеток стромы.

0 группа - это группа клеток эпителия с уровнем активности НК, меньшим диплоидного. В эту клеточную популяцию, как мы полагаем, входят малоактивные, а также некробиотические и апоптозные клетки. 1 группа - это группа эпителиальных клеток с уровнем активности НК в ядрах, близким к диплоидному. 2 группа - это группа эпителия с уровнем активности НК в ядрах выше диплоидного.

В строме определялись следующие 4 группы: 3 группа - это преимущественно лимфоциты, то есть стромальные клетки с округлыми ядрами (КФ>0,5) и относительно небольшими размерами (площадь ядер от 5 до 15 мкм²). Уровень активности НК этих клеток использовался в качестве “точки отсчета” диплоидного уровня других клеточных популяций. В 4 группу стромальных клеток, представленную в основном макрофагами, вошли большие округлые клетки с КФ > 0,45, площадь ядер 20 - 45 мкм². В 5 группу, преимущественно эндотелиоцитов, отобраны мелкие вытянутые клетки с КФ < 0,4 и площадью 10 - 20 мкм². 6 группа - это фибробласты и гладкомышечные клетки, то есть большие вытянутые клетки с КФ < 0,4 и площадью 21- 45 мкм². При сопоставлении результатов автоматизированного выделения клеток и их визуальной идентификации совпадение имело место в 80-90% и более случаев.

Результаты измерений каждого клеточного ядра в исследованных препаратах сохранялись в памяти компьютера и использовались в дальнейшем для оценки морфофункционального состояния элементов системы эпителий - соединительная ткань.

При обработке результатов измерений в настоящем исследовании использовался комплекс статистических методов: вычисление средних значений, оценка достоверности различий средних по t-критерию Стьюдента, корреляционный анализ, метод главных компонент и дискриминантный анализ (программа Statistica 6.0), а также оригинальные программы, написанные совместно с сотрудниками кафедры вычислительной техники СПб Государственного кораблестроительного университета - доцентами Муравьевым Е.А. и Ухиной Н.А, за что автор приносит им искреннюю благодарность.

Экспертная диагностическая система для выявления опухолей предстательной железы по изменениям в перитуморозной зоне

Под классификацией мы понимаем, как это общепринято, подразделение исследуемых объектов на классы в зависимости от их различия по существенным свойствам. Основной идеей классификации в математическом понимании является разделение объектов с различными свойствами в многомерном пространстве признаков. При этом под признаками в контексте решаемых в данной работе биологических задач понимаются различные количественные признаки исследуемых морфологических объектов, такие как размер, форма клетки и число клеток различных типов. Совокупность количественных признаков, описывающих состояние исследуемого объекта, формирует пространство признаков. Тот или иной класс объектов занимает в таком гиперпространстве признаков определенную более или менее четко очерченную область.

В настоящем исследовании в качестве классов объектов выступали наблюдения с заведомо известными различными диагнозами. В случае предстательной железы - это группы НГПЖ и фона рака предстательной железы; в случае эндометрия - группы полипоза, железисто-кистозной гиперплазии и фона рака эндометрия. При заболеваниях толстой кишки - это группы полипов толстой кишки и фона аденокарциномы.

Создание классификатора можно разделить на несколько этапов. Принципиальными этапами являются следующие.

Выбор модельных состояний на основе априорных знаний. Например, перитуморозная зона - доброкачественный процесс в том же органе.

Оценка модельных состояний по отдельным признакам.

Поиск информативного уровня исследования для решения поставленных задач.

Отбор информативных признаков.

Создание параметрической модели.

Разработка обучающей выборки - базы данных.

Оценка качества классификации, то есть проверка обучающей выборки в отношении качества диагностики.

Настройка обучающей выборки.

Тестирование классификатора слепым методом с целью установления чувствительности и специфичности классификатора для решения задач диагностики и прогнозирования.

Характеристика параметрической модели

Любое измеренное поле зрения (это может быть препарат предстательной железы, эндометрия, толстой кишки или любого другого органа и ткани) можно описать, например, одним-двумя признаками и более. Можно создать многомерное гиперпространство из 4, 5 и более признаков, в котором каждое наблюдение будет иметь определенное место в зависимости от выбранных параметров - признаков (Рис.1). Иначе говоря, речь идет о создании параметрической модели различных биологических состояний.

Рис. 1. Пример многомерного пространства признаков

Все используемые в построении параметрической модели признаки преобразовывались в главные компоненты, и уже в пространстве главных компонент строилась окончательная параметрическая модель патологического процесса. При этом использовалось такое число главных компонент, которое объясняло не менее 80% дисперсии признаков. С целью наглядности многомерное пространство визуализировалось в виде двухмерного в проекции двух первых главных компонент.

Целью дискриминантного анализа является создание такого многомерного пространства, в котором наблюдения, составляющие заведомо различные клинико-морфологические группы (в нашем случае зона фона рака предстательной железы и доброкачественная гиперплазия), занимали бы различные, максимально непересекающиеся области многомерного пространства. Первым этапом дискриминантного анализа и было создание базы данных, то есть обучающей выборки для всех исследованных случаев НГПЖ и фона рака предстательной железы (ФРПЖ) в многомерном пространстве признаков.

Первой проблемой в создании обучающей выборки являлся отбор признаков, описывающих наиболее биологически значимые свойства исследуемой выборки. Далее проводился поиск признаков, максимально отличающих фоновые раковые и доброкачественные гиперпластические процессы в предстательной железе.

Оценка информативности признаков

Одним из основных этапов создания классификатора является отбор типообразующих признаков (факторов-детерминантов), т.е. признаков, наиболее отличающих исследуемые явления, детерминирующих их.

Для оценки информативности отбирались признаки, наиболее различающие исследуемые явления по t-критерию Стьюдента и критерию Вилкоксона-Манна-Уитни. Для построения классификатора брались признаки, имеющие максимальные различия при попарном сравнении в различных группах.

Для создания наиболее информативного набора признаков проводился корреляционный анализ. Если коэффициенты корреляции между признаками оказывались больше 0,85 по модулю, то в дальнейшем при построении классификатора учитывался только один из признаков, имеющий больший биологический композиционный смысл.

Для оценки информативности признаков использовался также метод главных компонент. При этом исходные признаки преобразуются в производные на основании их дисперсий, а каждая главная компонента вбирает в себя информацию обо всех первично включенных признаках. Применение метода главных компонент позволяет решить две существенно важные статистические задачи: во-первых, повысить информативность производных признаков, во-вторых, уменьшить размерность многомерного пространства.

Таким образом, в работе использован синтез методов отбора информативных признаков. С одной стороны, выбирались признаки, максимально отличающиеся в исследуемых классах объектов, с другой, - отбрасывались признаки, сходные в пределах исследуемых групп.

Изначально нами использовано 92 признака для описания состояния исследуемых объектов - полей зрений, сканированных с анализатора изображений. Из них отобраны следующие: 1) некоррелирующие между собой; 2) имеющие максимальные различия при попарном сравнении по t-критерию Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни; 3) дающие наибольший вклад в главные компоненты.

Таковыми признаками оказались следующие: N3/N - доля лимфоидных среди всех клеток стромы; N5/N - доля эндотелиоцитов среди всех клеток стромы; OD5/OD1 - отношение оптической плотности НК ядер эндотелиоцитов к оптической плотности НК ядер эпителиоцитов диплоидного уровня; ODS5/ODS1- отношение интегральной оптической плотности (произведение оптической плотности на площадь клетки) НК ядер эндотелиальных клеток к оптической плотности НК ядер эпителиоцитов диплоидного уровня; OD5/OD0 - отношение оптической плотности НК ядер эндотелиальных клеток к оптической плотности НК ядер эпителиоцитов ниже диплоидного уровня; OD6/OD0 - отношение оптической плотности НК ядер фибробластов к оптической плотности НК ядер эпителиоцитов ниже диплоидного уровня; OD3/OD5 - отношение оптической плотности НК ядер лимфоцитов к оптической плотности НК ядер эндотелиоцитов.

Как видно из этого перечня, наиболее информативными оказались те признаки, которые условно можно назвать «стромальными» и «стромально - эпителиальными». В наибольшей степени ПТЗ и НГПЖ различались по признакам, отражающим состояние лимфоидных и эндотелиальных компонентов стромы, а также взаимоотношения между компонентами стромы (лимфоидными, эндотелиальными, фибробластами) и диплоидными низкоактивными эпителиоцитами. Каждое наблюдение - поле зрения представлено в многомерном пространстве в виде точки с определенными координатами. При этом для наглядности многомерное пространство преобразуется в двухмерное в проекции первых двух главных компонент (рис. 2).

Рис. 2. Исходная база данных измеренных полей зрения предстательной железы.

Примечание. Точками в правой половине рисунка отображены поля зрения перитуморозной зоны фона рака предстательной железы, в левой - нодозной гиперплазии.

Как видно из этого рисунка, все исследованные поля зрения в значительной степени пересекаются в центральной части пространства, хотя и намечается какая-то тенденция к разделению. Иными словами, в многомерном пространстве исследуемые группы имеют, по-видимому, некоторые различия.

С целью отсева «выскакивающих» значений, нами отброшены все наблюдения по правилу «трех сигм». Те наблюдения, которые в созданном признаковом гиперпространстве были удалены от центроидов областей более чем на 3 сигмы, в дальнейшем не брались в базу данных. В конечном итоге для создания базы данных отобрано 49 измерений фона рака и 54 - НГПЖ.

Для улучшения качества разделения (создания обучающей выборки) применен следующий подход. Сущность его в создании первоначальной базы данных из всех наблюдений с последующим отбрасыванием случаев, не удовлетворяющих требованиям к качеству классификации. Программа итераций, разработанная специально для этого исследования совместно с доцентом кафедры вычислительной техники СПб Кораблестроительного университета Е.А. Муравьевым, позволила отбросить случаи - поля зрения, не удовлетворявшие условию максимальной близости к центроиду области гиперпространства. Таким образом, все исследуемые поля зрения оказались в непересекающихся областях гиперпространства (рис. 3). Этот подход привел к существенному улучшению разделения наблюдений, так что в выбранном признаковом гиерпространстве уже изначально удалось выделить области, в которых сосредоточены либо доброкачественные, либо преимущественно фоновые процессы.

Практическое применение экспертной системы представляет собой оценку вероятности принадлежности каждого исследованного поля зрения к одной из областей гиперпространства. Так, если большинство полей зрения тестируемого наблюдения диагностируются как фоновый процесс, то и диагноз по данному случаю выставляется как фон рака. Когда же большинство полей зрения диагностируются как доброкачественный процесс, то выставляется диагноз НГПЖ. При этом созданную базу данных - классификатор можно считать удовлетворительной, если большинство тестируемых наблюдений диагностируются правильно, то есть попадают в свою достаточно изолированную область гиперпространства (рис. 3).

Рис. 3. Пример успешной диагностики фона рака предстательной железы.

Примечание. Точки в левой части рисунка - ФРПЖ, справа - зона НГПЖ. Цифры 1, 2, 3 и так далее - проекции полей зрения тестируемого образца в многомерном пространстве признаков. В правой половине рисунка представлена часть таблицы вероятности принадлежности каждого тестируемого образца к одной из областей базы данных. Черными крестиками обозначены центроиды соответствующих областей гиперпространства. Так как практически все исследуемые поля зрения в этом примере диагностируются как фон рака предстательной железы, можно сделать диагностический вывод - исследуемая ткань является перитуморозной зоной.

На следующем этапе определялось качество диагностики всех имеющихся наблюдений - 92 случая фона рака и 72 случая НГПЖ.

Нами установлено, что первоначальная база данных позволяет правильно диагностировать 58 случаев фона рака (63%) и 45 случаев НГПЖ (62,5%). При этом значительное число наблюдений попадают как в одну, так и в другую область гиперпространства, что не позволяет поставить однозначный диагноз. Подобный результат проверки базы данных, оказавшийся не вполне удовлетворительным, позволил сделать вывод о необходимости выделения дополнительных подгрупп в пределах, как фона рака, так и нодозной гиперплазии.

Принцип выделения подгрупп, использованный нами, был следующий. Все случаи ФРПЖ, которые диагностировались неверно или неопределенно, составили подгруппу 1. НГПЖ, диагностируемая неверно или неопределенно, составили подгруппу 2. Случаи ФРПЖ и НГПЖ, диагностированные верно, составили подгруппы 3 и 4 соответственно (рис. 4 и 5).



Рис. 4. База данных после 8 итераций

Примечание. Красные точки - 1 подгруппа (фон рака). Зеленые - 2 подгруппа (НГПЖ). Синие - 3 подгруппа (фон рака). Желтые - 4 подгруппа (НГПЖ). Iter=8 - число выполненных итераций, Delete=0,56 - доля полей зрения, отброшенных из базы данных после итераций, True= 0,96, 0,85, 0,77, 0,83 - вероятность принадлежности оставшихся полей зрения к своим областям базы данных. Крестиками обозначены центроиды областей. После большого отсева полей зрения (56%) оставшиеся наблюдения заняли довольно четко разграниченные, непересекающиеся области пространства признаков, что позволяет использовать такую базу данных для диагностики неизвестных случаев (рис. 5).



Рис 5. Пример диагностики фона рака предстательной железы.

Примечание. В виде точек на рисунке представлены области гиперпространства, соответствующие в данном примере НГПЖ и ПТЗ. Цифрами обозначены проекции различных полей зрения тестируемого образца на признаковое гиперпространство. В правой половине рисунка приведена таблица вероятностей принадлежности отдельных полей зрения к каждой выделенной области гиперпространства. Как видно из рис. 5, большинство полей зрения проецируется в область ПТЗ. Соответственно, тестируемый случай является перитуморозной зоной и, следовательно, вблизи с исследуемым образцом должна располагаться опухоль предстательной железы.

Выделение подгрупп в пределах фона рака и НГПЖ (промежуточной области гиперпространства) позволило существенно улучшить качество классификации.

Тестирование созданной базы данных проводилось слепым методом. При этом при классификации исследуемых наблюдений использовались следующие критерии. Если 70% и более полей зрения тестируемого образца проецировалось в соответствующую область гиперпространства, то это служило основанием для отнесения данного случая к данной области пространства. Например, если 9 из 12 тестируемых полей зрения попадали в область групп фона рака, то для данного случая делалось заключение - перитуморозная зона. Или если 12 из 15 полей зрения попадали в область НГПЖ, то выставлялся диагноз доброкачественной гиперплазии. Если исследуемые поля зрения тестируемого случая попадали как в область фона рака, так и НГПЖ, то диагностика считалась неопределенной.

Далее в соответствии с рекомендациями Г.Г. Автандилова (1999) определялась чувствительность и специфичность классификации. Всего оценивалось качество классификации 48 случаев фона рака и 48 наблюдений НГПЖ. При этом неопределенные результаты получены в 21 случае из 96 (21,9%).

Из 48 наблюдений нодозной гиперплазии истинно положительная диагностика была в 40 (83,3%) случаях, неопределенная - в 6 (12,5%), ложноотрицательная - в 2 (4,2%) наблюдениях. Из 48 случаев фона рака истинно положительная диагностика была в 32 (66,7%), неопределенная - в 15 (31,3%), ложноотрицательная в - 1 (2,1%). Следовательно, чувствительность при диагностике фона рака составила 66 %, а при диагностике гиперплазии - 83%. Специфичность при диагностике фона рака составила 94%, специфичность при диагностике НГПЖ - 97%. При оценке специфичности метода не учитывались случаи неопределенной диагностики.

Полученные результаты показали высокую специфичность созданных классификаторов. Что касается чувствительности метода, то он оказался выше при диагностике нодозной гиперплазии. Хотя нужно отметить, что имеется довольно значительное число случаев неопределенной диагностики - до 12,5% при НГПЖ и до 31,3% при фоне рака предстательной железы. Очевидно, что в случаях неопределенной диагностики целесообразно дополнительное исследование гистологического материала с назначением повторной биопсии или дорезка парафиновых блоков.

Общие особенности эпителиально-стромальных взаимоотношений при нодозной гиперплазии и в перитуморозной зоне при раке предстательной железы

Проведен сравнительный анализ перитуморозных зон 68 случаев рака предстательной железы и 78 нодозной гиперплазии. В перитуморозной зоне рака предстательной железы выявлено относительно более высокое число низко активных эпителиальных клеток («0» группа эпителия) (0,216±0,017 и 0,257±0,015, p<0,05) и относительно более низкое число высокоактивных пролиферирующих эпителиоцитов («2» группа эпителия) по сравнению с нодозной гиперплазией (0,474±0,028 и 0,422±0,027, p<0,05). (Рис. 6).



Рис. 6. Доля эпителиальных клеток с различной активностью нуклеиновых кислот.

Примечание. Светлые столбцы - группа НГПЖ, темные столбцы - ФРПЖ. N0/N - доля низкоактивных эпителиоцитов среди всех эпителиальных клеток, N1/N - доля диплоидных эпителиоцитов среди всех эпителиальных клеток, N2/N - доля активных эпителиоцитов среди всех эпителиальных клеток.

Как видно из рисунка 6, оптическая плотность нуклеиновых кислот ядер эпителиоцитов была достоверно ниже в перитуморозной зоне по сравнению с НГПЖ (при нодозной гиперплазии OD0, OD1, OD2 - 0,260±0,016, 0,286±0,013, 0,303±0,015; в перитуморозной зоне OD0, OD1, OD2 - 0,252±0,012, 0,252±0,012, 0,288±0,014, p<0,01).



Рис. 7. Оптическая плотность нуклеиновых кислот ядер эпителиальных клеток.

Примечание. Светлые столбцы - группа НГПЖ предстательной железы, темные столбцы - группа ФРПЖ. OD0 - средняя оптическая плотность НК ядер низкоактивного эпителия. OD1 - средняя оптическая плотность НК ядер эпителия диплоидной группы. OD2 - средняя оптическая плотность НК ядер активного эпителия.

В перитуморозной зоне число лимфоцитов и макрофагов оказалось больше (0,256±0,010 и 0,177±0,009; 0,142±0,008 и 0,116±0,008 соответственно), а эндотелиальных клеток и фибробластов меньше, чем при НГПЖ (0,214±0,010 и 0,279±0,010; 0,400±0,018 и 0,431±0.015, p<0,01) (рис. 8).



Рисунок 8. Относительное число различных клеток стромы.

Примечание. Светлые столбцы - группа НГПЖ, темные столбцы - группа фона рака предстательной железы. N3/N - доля лимфоидных клеток по отношению ко всем стромальным клеткам, N4/N - доля макрофагов по отношению ко всем стромальным клеткам, N5/N - доля эндотелиоцитов по отношению ко всем клеткам стромы, N6/N - доля фибробластов по отношению ко всем клеткам стромы.

Активность НК клеток стромы в перитуморозной зоне была ниже, чем при доброкачественной НГПЖ (табл. 1).

Таблица 1. Оптическая плотность НК в ядрах клеток стромы

	OD3	OD4	OD5	OD6
НГПЖ	0,262±0,010	0,248±0,010	0,238±0,012	0,253±0,013
ФРПЖ	0,245±0,009	0,223±0,011	0,216±0,011	0,237±0,010

Примечание. OD3 - оптическая плотность НК ядер лимфоцитов; OD4 - оптическая плотность НК ядер макрофагов; OD5 - оптическая плотность НК ядер эндотелиоцитов; OD6 - оптическая плотность НК ядер фибробластов.

Анализ корреляционных взаимоотношений показал, что общее число сильных корреляций в перитуморозной зоне рака простаты намного больше, чем при гиперплазии. При НГПЖ отмечается определенная независимость эпителиального компонента от стромального. В перитуморозной зоне, наоборот, установлены сильные положительные корреляции между показателями активности НК в ядрах эпителия и клеток стромы, в частности, макрофагов и фибробластов.

Основные показатели пролиферативной активности и апоптоза эпителиальных клеток представлены на рис. 9.

Рисунок. 9. Показатели пролиферативной активности и апоптоза в эпителии предстательной железы.

Примечание. Индекс Bcl-2 - доля клеток, в которых выявлена экспрессия Bcl-2. Индекс Ki-67 - доля клеток, в которых выявлена экспрессия Ki-67. Nor - среднее число ядрышковых организаторов в ядре эпителиальной клетки (в %). N0/N - доля эпителиальных клеток с показателями активности НК меньше диплоидного по отношению к общему числу эпителиальных клеток. N2/N - доля эпителиальных клеток с показателями активности НК больше диплоидного к общему числу эпителиальных клеток. Некр. - доля эпителиальных клеток с уровнем НК менее 75% от уровня диплоидного (некробиотические клетки). Синие столбцы - РПЖ. Фиолетовые столбцы - ПТЗ. Желтые столбцы - НГПЖ.

Пролиферативная активность эпителия в ткани опухоли варьировала в значительных пределах, индекс Ki-67 колебался от 3,12 до 39,32% (в среднем 12,20±7,33%) и был достоверно выше, чем в перитуморозной зоне или при гиперплазии (p<0,01). Исследованные опухоли существенно отличались и по уровню ингибиции апоптоза. Число Bcl-2 позитивных клеток варьировало в них от 1,11 до 8,17 (в среднем 6,06±1,67%), однако достоверных различий в сравнении с ПТЗ и группой гиперплазии не установлено.

По экспрессии мутантного гена p53 опухоли составили 2 группы: в одних его экспрессия была лишь в единичных клетках, в других - в значительной части эпителиоцитов (не менее 20-25% клеток). При выраженной экспрессии p53 практически всегда наблюдалась высокая пролиферативная активность эпителия по экспрессии антигена Ki-67 и высокие значения ядрышковых организаторов. Активность ЯО оказалась выше в самой опухоли (3,50±0,21) по сравнению с перитуморозной зоной (2,47±0,10; p<0,01) и при НГПЖ (2,25±0,06; p<0,01). В ткани рака простаты отмечена достоверно большая доля эпителиоцитов с уровнем нуклеиновых кислот больше диплоидного (0,52±0,02; p<0,05), в сравнении с прилежащими тканями и группой гиперплазии, а также пониженная доля низкоактивных эпителиоцитов (0,19±0,02; p<0,05).

В целом же можно отметить, что раковый эпителий представляет собой довольно пеструю гистологическую картину. Встречались опухоли как с низкой пролиферативной активностью и низким уровнем апоптоза, так и, наоборот, - с высокой пролиферативной активностью и выраженным апоптозом. Практически во всех опухолях имелось большое число клеток с уровнем НК выше диплоидного.

Для эпителия ПТЗ установлена меньшая вариабельность по показателям пролиферации и апоптоза по сравнению с опухолевой тканью. Так, индекс экспрессии Ki-67 колебался от 1,62 до 5,40 % (в среднем 2,97±0,99%), что ниже, чем в ткани рака, и выше, чем при гиперплазии (p<0,05). Уровень Bcl-2 колебался от 3,59 до 10,01% (в среднем 5,18±1,11%, что ниже, чем при гиперплазии (p<0,01). Максимальный уровень Bcl-2 в нашем исследовании установлен при НГПЖ - 6,25±1,38%. Активность ЯО эпителия в перитуморозной зоне оказалась выше, чем при гиперплазии простаты (2,47±0,10 и 2,25±0,06 соответственно, p<0,05).

В ПТЗ выявлена достоверно большая доля эпителиоцитов с уровнем НК меньше диплоидного по сравнению с НГПЖ (0,257±0.025 и 0,216±0,019 соответственно, p<0,05) и особенно клеток с минимальной активностью нуклеиновых кислот (менее 75% от диплоидного уровня). Так, в ПТЗ доля таких клеток составила 0,211±0,011, а при НГПЖ - 0,130±0,012 (p<0,001). В то же время различия по количеству апоптозных телец (клетки с небольшими плотными ядрами) оказались недостоверными.

Средние значения оптической плотности НК в ядрах всех исследуемых групп эпителиоцитов в перитуморозной зоне оказались ниже, чем при НГПЖ. Изменения уровня НК эпителиальных клеток отмечались как непосредственно вблизи опухоли (в пределах 1-8 мм), так и на отдалении, то есть в тех препаратах предстательной железы, где опухолевого роста в исследуемом срезе не было.

Во всех группах наблюдения уровень активности ЯО был ниже в клетках фибробластического ряда (2,15±0,04 зон фона рака и 1,98±0,07 при гиперплазии, p<0,05) по сравнению с эпителием. Различия по активности ЯО фибробластов между группами фона рака и гиперплазии оказались недостоверными.

Особенности диагностики «латентного» рака предстательной железы

Все наблюдения рака предстательной железы были разделены на случаи, в которых выявлялись лишь единичные микрофокусы опухоли (1-4 очага по 1-3 мм), и наблюдения с диффузным ростом опухоли в большинстве тканевых блоков. В первой группе имелся так называемый «латентный» рак предстательной железы, а во второй - «прогрессирующий». Наиболее информативными признаками для разделения случаев латентного и прогрессирующего рака простаты оказались: N3/N - доля лимфоидных клеток по отношению ко всем клеткам стромы; N5/N - доля эндотелиоцитов по отношению ко всем клеткам стромы; OD5/OD1 - оптическая плотность НК эндотелиальных клеток по отношению к оптической плотности НК ядер диплоидного уровня; ODS5/ODS1 - интегральная оптическая плотность НК эндотелиальных клеток по отношению к интегральной оптической плотности НК диплоидного эпителия; OD5/OD0 - оптическая плотность НК эндотелиоцитов по отношению к оптической плотности НК низкоактивного эпителия; OD6/OD0 - оптическая плотность НК гладкомышечных клеток по отношению к оптической плотности НК низкоактивного эпителия; OD3/OD5 - отношение оптических плотностей НК лимфоидных клеток и эндотелиоцитов; OD0/OD1 - отношение оптических плотностей НК низкоактивного эпителия и эпителия с ядрами диплоидного уровня; ODS0/ODS1 - отношение интегральных оптических плотностей НК низкоактивного эпителия и эпителия диплоидного уровня; ODS0/ODS2 - отношение интегральных оптических плотностей НК низкоактивного эпителия и активного эпителия; OD3/OD4 - отношение оптических плотностей НК лимфоцитов и макрофагов; OD3/OD6 - отношение оптических плотностей НК лимфоцитов и фибробластов.

На рис. 10 приведен пример диагностики перитуморозной зоны фона рака в случае со сплошным ростом рака предстательной железы.



Рис. 10. Пример диагностики фона рака в случае со сплошным ростом опухоли.

Примечание. Микрофокусы рака, распространенный рак, нодозная гиперплазия предстательной железы - зоны гиперпространства, соответствующие названным группам. 1, 2, 3 и так далее - проекция полей перитуморозной зоны случая со сплошным ростом рака предстательной железы. В правой части таблицы приведены значения вероятности принадлежности части тестируемых полей зрения к соответствующим группам.

Чувствительность при диагностике МФ предстательной железы составила 64 %, при сплошном росте раке - 82%, при диагностике нодозной гиперплазии - 83%. Чувствительность классификатора оказалась выше при верификации рака в случаях сплошного роста. Специфичность диагностики фона рака (все случаи без разделения на группы «латентного» и «распространенного» рака) составила 93%, специфичность при диагностике НГПЖ 91%. В случаях оценки специфичности метода не учитывались наблюдения с неопределенными результатами диагностики.

Максимальная доля (N0/N) низкоактивных эпителиоцитов (0,260±0,018) и наибольшее отношение (N0/N2) низкоактивных эпителиоцитов к высокоактивным клеткам (0,753±0,084) отмечены в группе латентного рака, что достоверно отличается от группы со сплошным ростом опухоли и группы НГПЖ (p<0,01).

Как следует из табл. 2, при микрофокусах рака в перитуморозной зоне относительное число мононуклеаров (N3/N, N4/N) больше по сравнению с НГПЖ (p<0,05), а доля эндотелиоцитов меньше (p<0,01). При сплошном росте опухоли число мононуклеаров и лимфоцитов в перитуморозной зоне еще больше (особенно велико число лимфоцитов), тогда как доли эндотелиальных клеток и фибробластов меньше.

Таблица 2. Число клеток стромы в перитуморозной зоне при латентном раке и сплошном росте опухоли

	N3/N	N4/N	N5/N	N6/N
НГПЖ	0,177±0,015	0,116±0,013	0,279±0,023	0,431±0,044
Латентный рак	0,214±0,023	0,137±0,015	0,210±0,025	0,441±0,032
Сплошной рост РПЖ	0,300±0,029	0,158±0,018	0,174±0,015	0,385±0,031

Примечание. N3/N - доля лимфоцитов среди всех клеток стромы; N4/N - доля макрофагов среди всех клеток стромы; N5/N - доля эндотелиоцитов среди всех клеток стромы; N6/N- доля фибробластов среди всех клеток стромы.

У больных с микрофокусами рака предстательной железы в ткани самой опухоли уровень Вcl-2 колебался в незначительных пределах (5,41±0,71) и был ниже, чем в прилежащей перитуморозной зоне (6,41±1,81) (p<0,01) или при доброкачественной гиперплазии (6,25±1,38) (p=0,01). Микрофокусы рака характеризуются повышенной пролиферативной активностью по сравнению с их перитуморозной зоной и НГПЖ. Экспрессия Ki-67 составила в исследуемых группах соответственно 8,26±5,43, 2,76±0,45, 2,80±0,50%. (p<0,01). Следует отметить большую вариабельность экспрессии Ki-67 в опухолевой ткани (от 2,75 до 16,33%) (рис. 11), что видно по величине стандартного отклонения - 5,43.

Рис. 11. Индексы экспрессии Bcl-2, Ki-67 и активность ядрышковых организаторов в ткани опухоли.

Примечание. НГПЖ - нодозная гиперплазия предстательной железы, МФР - микрофокусы рака (латентный рак), РРПЖ - распространенный (прогрессирующий) рак предстательной железы, Bcl-2 - индекс экспрессии антигена Bcl-2, Ki-67 - индекс экспрессии антигена Ki-67, Nor - активность ядрышковых организаторов.

Активность ЯО также оказалась выше в опухолевых микроочагах по сравнению с перитуморозной зоной и узлами доброкачественной гиперплазии (3,15±0,07, 2,39±0,07, 2,25±0,06 соответственно, p<0,01).

При латентном раке предстательной железы в перитуморозной зоне индекс экспрессии Bcl-2 достоверно не отличался от соответствующего показателя при НГПЖ.

Число некробиотических эпителиоцитов в ПТЗ было больше по сравнению с НГПЖ и достигало 19,41±6,54% (p=0,001), число апоптозных телец в ПТЗ достоверно не отличалось от соответствующего показателя в группе доброкачественной гиперплазии и составило 0,39±0,02%. Вокруг очагов латентного рака доля низкоактивных, деградирующих клеток среди активных эпителиоцитов оказалась больше по сравнению с группой НГПЖ (p<0,01), что указывает на преобладание процессов апоптоза над пролиферацией. Вокруг микроочагов опухоли установлена более высокая экспрессия Ki-67 (3,03±1,70) и активность ядрышковых организаторов (2,39±0,07) в сравнении с группой гиперплазии (p<0,05) (рис. 12).

...