Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Патохимические особенности и факторы повреждения сердца при сочетании сахарного диабета с хронической интоксикацией алкоголем

Индутный Антон Васильевич

03.01.04 - биохимия

Челябинск - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Терентьев Александр Александрович;

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Камилов Феликс Хусаинович;

доктор медицинских наук, профессор Львовская Елена Ивановна.

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита состоится 2010 г. на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан: 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Н.В. Тишевская.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Медико-социальная значимость исследуемой проблемы во многом обусловлена значительным уровнем инвалидности и смертности вследствие развития поздних осложнений сахарного диабета 2 типа, которым страдает в пределах 3% населения Российской Федерации (А.Г. Обрезан, 2008). Сердечно-сосудистая патология лидирует среди осложнений сахарного диабета 2 типа практически во всех странах мира (D. J. Betteridge, 2001). Нарушения липопротеинового спектра крови в комплексе с провоспалительной иммунологической перестройкой при сахарном диабете способствуют атерогенезу в коронарных сосудах и последующему развитию ишемических поражений (И. И. Дедов, 2004). Некоронарогенный механизм повреждения миокарда при сахарном диабете типа 2 связан с явлениями глюкозотоксичности и липотоксичности, а также с развитием окислительного стресса на фоне дефицита энергии и антиокислительных механизмов защиты сердца (M. Aragno, 2006). Инактивация оксида азота вследствие образования при гиперпродукции активных форм кислорода приводит к дефициту вазодилятации (J. E. Wright, 2006), способствует ишемии миокарда и является важным звеном механизма повреждения сердца при сахарном диабете (Y. Xia, 2007).

Сахарный диабет 2 типа нередко сочетается с другими заболеваниями, также способствующими поражению сердечно-сосудистой системы (Т. Melchior, 2000), что является фактором прогредиентности кардиальных осложнений и увеличивает риск развития сосудистых катастроф. С высокой частотой в формировании широкого круга подобной коморбидной патологии принимают участие различные аддиктивные состояния, среди которых по распространенности лидирует злоупотребление алкоголем (В.Я. Cемке, 2008). Хроническая алкогольная интоксикация сопутствует сахарному диабету 2 типа, по крайней мере, у 8,3% больных (П.И. Сидоров, 2002). Это сочетание повышает вероятность возникновения и способствует прогрессированию сосудистых осложнений сахарного диабета, а при длительном употреблении высоких доз алкоголя - ассоциировано с увеличением смертности вследствие сердечно-сосудистых нарушений (P. Diem, 2003). Наряду с прямыми повреждающими эффектами алкоголя, процессы и продукты его биотрансформации способствуют развитию окислительного стресса в кардиомиоцитах (V. R. Preedy, 1999) с реализацией цитоксического действия на уровне модификации биомолекул, мебранотропных эффектов и вмешательства в работу сигнальных механизмов, включая NO-зависимые каскады (X. Deng, 2007).

Биохимические аспекты развития структурных нарушений при алкогольном и диабетическом поражении сердца, как следует из анализа литературных данных, имеют некоторые общие черты. Тем не менее, не определены молекулярные механизмы и последствия влияния на сердце хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете 2 типа.

Цель исследования.

Установить патохимические механизмы формирования повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать патохимические признаки повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа и хронической интоксикации алкоголем.

2. Проанализировать уровень белков острофазового ответа, как возможных показателей активности течения кардиальной патологии при сахарном диабете 2 типа в сочетании с хронической алкогольной интоксикацией.

3. Исследовать воздействие хронической алкогольной интоксикации на качество гликемического контроля и липидный спектр крови при сахарном диабете 2 типа.

4. Изучить влияние хронической алкогольной интоксикации на антирадикальную и антиперекисную защиту в сердце при сахарном диабете 2 типа.

5. Определить интенсивность процессов липопероксидации и окислительной модификации протеинов как факторов повреждения миокарда при сахарном диабете 2 типа на фоне хронической алкогольной интоксикации.

6. Исследовать значение оксида азота (II) в развитии миокардиодеструкции при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической интоксикацией алкоголем.

7. Выяснить роль процессов апоптоза и некроза в формировании повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.

8. Оценить наличие особенностей патохимических механизмов и последствий кардиотропного влияния хронической алкогольной интоксикации на различных этапах развития сахарного диабета.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований, впервые, на основе применения современных методов, получены сведения о характере патохимических нарушений в сердце и системных метаболических сдвигах при сочетании сахарного диабета 2 типа и хронической алкогольной интоксикации. Установлено влияние хронической алкогольной интоксикации при сахарном диабете 2 типа на комплекс биохимических характеристик, отражающих механизмы развития кардиальных повреждений, включающий: биомаркеры повреждения миокарда и острофазовой реакции, показатели состояния углеводного, липидного и белкового обмена; параметры интенсивности свободнорадикальных процессов, антиокислительной защиты и активности апоптоза в сердце; уровень оксида азота (II). Получено клинико-экспериментальное биомаркерное подтверждение развития деструкции кардиомиоцитов при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Выявлено, что при сахарном диабете под влиянием хронической алкогольной интоксикации углубляется нарушение гликемического контроля. Обнаружено выраженное повышение содержания продуктов липопероксидации, окислительной модификации белков в крови и сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Определено, что в условиях сахарного диабета, под влиянием алкогольной интоксикации формируется существенный дефицит активности супероксиддисмутазы и каталазы в сердце. Идентифицированы проапоптотически направленные изменения в сердце в виде значительного увеличения активности каспазы-3 при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией. Установлено повышенное содержание конечных стабильных производных оксида азота (II) в плазме крови и сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Представлена интегральная характеристика уровня пероксид-зависимой инициации свободнорадикальных процессов в плазме крови и сердце при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Выяснено, что в зависимости от этапа развития сахарного диабета отмечаются особенности патохимических последствий влияния хронической алкогольной интоксикации и различная выраженность кардиальных повреждений.

Теоретическая и практическая значимость.

Результаты проведенного исследования представляют новые знания о патохимических механизмах развития повреждения сердца при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией и создают теоретические предпосылки для создания соответствующих методов профилактики, диагностики и терапии.

Практический интерес представляют полученные данные о некротическом характере развивающегося поражения миокарда при сахарном диабете 2 типа и хронической алкогольной интоксикации. Это свидетельствуют о целесообразности активного выявления хронического злоупотребления алкоголем среди больных сахарным диабетом 2 типа, с последующим скрининговым биомаркерным обследованием, направленным на обеспечение дальнейшей адекватной лечебно-диагностической тактики. Сведения о неблагоприятном влиянии хронической интоксикации алкоголем при сахарном диабете 2 типа на гликемический контроль и интенсивность свободнорадикальных процессов, представленные в настоящем исследовании, могут быть учтены при разработке способов патогенетически обоснованной профилактики и коррекции миокардиодеструкции у таких пациентов. Данные об отличиях в выраженности миокардиального повреждения при воздействии алкоголя на различных этапах развития сахарного диабета и о сопряжении этих различий с установленными патохимическими особенностями, могут иметь перспективное прогностическое и диагностическое значение. Фактически обоснованные выводы о взаимосвязи развивающегося повреждения сердца с гиперпродукцией оксида азота ставят вопрос о необходимости оценки возможности безопасного использования ряда лекарственных препаратов - доноров оксида азота (II) - у больных сахарным диабетом 2 типа, хронически злоупотребляющих алкоголем.

Внедрение результатов исследования.

Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе на кафедре биохимии Тюменской государственной медицинской академии; на кафедре биохимии и лабораторной медицины, на кафедре госпитальной терапии, а также на курсах клинической биохимии и клинической лабораторной диагностики Омской государственной медицинской академии.

Апробация работы.

Материалы исследования представлены на межрегиональной научной конференции биохимиков Урала, Западной Сибири и Поволжья (Оренбург, 2003), на V межрегиональной научной конференции «Актуальные вопросы наркологии» (Омск, 2003), на III конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на межрегиональной научной конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара, 2005), на юбилейной научной сессии, посвященной 85-летию ОмГМА (Омск, 2006), на заседании Омского отделения общества биохимиков и молекулярных биологов РАН (Омск, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов СО РАН (Новосибирск, 2008), на заседании Омского отделения научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики России (Омск, 2009), на межрегиональной научной конференции, посвященной памяти профессора Р. И. Лифшица (Челябинск, 2009), на совместном заседании кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО; кафедры психиатрии, наркологии и клинической психологии, кафедры общей и биоорганической химии ОмГМА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хроническая алкогольная интоксикация при сахарном диабете типа 2 способствует развитию некротического и апоптотического повреждения кардиомиоцитов в течение алкоголизации и в послеалкоголизационном периоде.

2. Углубление нарушения качества гликемического контроля, снижение обеспечения миокарда свободными жирными кислотами, окислительный стресс и активация каспазы-3 в сердце являются важными патохимическими факторами повреждения кардиомиоцитов при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией.

3. Высокое содержание оксида азота (II) и нитритивный стресс выступают ключевым звеном некротического повреждения миокарда при сочетании сахарного диабета 2 типа и злоупотребления алкоголем.

4. Выраженность повреждения и патохимических нарушений в сердце, развивающихся при сахарном диабете под влиянием хронической алкогольной интоксикации, достигает максимального уровня в условиях постинтоксикационного состояния, а в период алкоголизации - становится более значительной с увеличением продолжительности воздействия этанола.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ, Из них 13 - в рецензируемых периодических изданиях по перечню ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 202 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа содержит 34 таблицы, 14 рисунков и 1 схему. Список цитированной литературы включает 338 источников, в том числе 51 - на русском языке.

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

В соответствии с целью и задачами, исследование было выполнено как простое, одномоментное контролируемое. В разделе работы, сопряженном с изучением клинического биоматериала объектами исследования стали образцы плазмы венозной крови мужчин в возрасте от 40 до 60 лет, из числа пациентов, находивших на лечении в специализированных эндокринологических отделениях (Омской областной клинической больницы, городской больницы №2, больницы скорой медицинской помощи №2) и в 3-ем наркологическом отделении областного наркологического диспансера г. Омска в период с 2002 г. по 2003 г. Аналогичный биоматериал от клинически и лабораторно здоровых доноров данной возрастной группы, полученный в Омском областном центре крови, использовали для анализа контрольного уровня исследуемых показателей. Взятие венозной крови производили в условиях процедурного кабинета, утром натощак, после 12-часового голодания. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта использовали 5 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), который добавляли в количестве 0,1 мл на 5 мл цельной крови.

Исследование, в котором приняло участие 92 человека, было одобрено локальным этическим комитетом Государственного образовательного учреждения «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». От обследуемых лиц получено информированное согласие на их участие в проведении исследования.

Диагноз сахарного диабета типа 2 был установлен эндокринологом на основании общепринятых принципов диагностики (МКБ-10: Е.11.0 - Е.11.9). Для формирования выборки больных сахарным диабетом были разработаны критерии включения (информированное согласие пациента на участие в исследовании; установленный диагноз сахарного диабета 2 типа; мужской пол; возраст от 40 до 60 лет) и исключения (отказ пациента от участия в исследовании; терапия сахарного диабета препаратами, которые не относятся к группе II генерации производных сульфонилмочевины; приём лекарственных препаратов, отсутствующих в стандартах лечения сахарного диабета, фармакологически и фармакокинетически способных оказывать свое действие в период обследования; наличие других тяжелых хронических заболеваний, эндокринопатий, наследственных форм дислипопротеинемии, декомпенсации сахарного диабета с явлениями кетоацидоза на момент обследования; употребление спиртных напитков в течение ближайших 14 дней перед взятием крови). Применение указанных критериев в сочетании с оценкой признаков злоупотребления алкоголем методом П. П. Огурцова и соавт. (1997) по результатам физикального обследования и анкетирования 115 пациентов с сахарным диабетом 2 типа (совместно с врачами-эндокринологами) позволило выделить для дальнейшего участия в исследовании 48 человек, которые составили следующие выборочные группы: СД - пациенты с сахарным диабетом 2 типа без признаков злоупотребления алкоголем (25 человек); СД+АЛК - пациенты с сахарным диабетом 2 типа и признаками хронического злоупотребления алкоголем (23 человека).

Сведения о состоянии здоровья доноров, вошедших в группу контроля (ГК, 20 человек), получены из результатов диспансерного медицинского осмотра и лабораторного обследования. Группа сформирована после применения заданных отборочных критериев включения (информированное согласие на участие в исследовании; отсутствие клинических и лабораторных проявлений патологии; мужской пол; возраст от 40 до 60 лет) и исключения (отказ от участия в исследовании; наличие признаков хронического злоупотребления алкоголем; приём лекарственных препаратов, фармакологически и фармакокинетически способных оказывать свое действие в период обследования; употребление спиртных напитков в течение ближайших 14 дней перед взятием крови).

Диагноз хронического алкоголизма у лиц, составивших группу сравнения (АЛК, 24 человека) был установлен наркологами Омского областного наркологического диспансера на основании отраслевых стандартов. Для формирования выборки больных хроническим алкоголизмом после предварительно проведенной простой рандомизации были использованы следующие критерии включения: информированное согласие пациента на участие в исследовании; установленный диагноз хронического алкоголизма, 2 стадии, с синдромом активной зависимости (F 10. 302, F 10. 242; МКБ-10), мужской пол; возраст от 40 до 60 лет. Критериями исключения из числа обследуемых явились: отказ пациента от участия в исследовании; приём лекарственных препаратов, отсутствующих в стандартах лечения хронического алкоголизма, фармакологически и фармакокинетически способных оказывать свое действие в период обследования; наличие других тяжелых хронических заболеваний, эндокринопатий, наследственных форм дислипопротеинемии; употребление спиртных напитков в течение ближайших 14 дней перед взятием крови.

Объекты экспериментальной части исследования были представлены образцами плазмы крови и гомогенатов сердца половозрелых белых крыс-самцов породы Wistar массой 220-240 г. Животных, выращенных в виварии ОмГМА, содержали в условиях постоянной температуры и влажности при 12-ти часовом цикле день/ночь и использовали для исследования в соответсвии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также с положениями регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными и выводу их из эксперимента. Лабораторных животных содержали на сухом твердом корме. Стандартный сухой твердый корм включал 60% углеводов, 22% белка, 10% жиров (преимущественно растительные), 8% пищевых волокон и других ингредиентов. Сухой рацион с высоким содержанием жира включал 50% углеводов, 13% белка, 30% жира (преимущественно зоостеролы), 7% пищевых волокон и энергетически балластных веществ. Питание и жидкость были доступны ad libitum.

Экспериментальный сахарный диабет, эквивалентный сахарному диабету 2 типа, моделировали по методике предложенной Zhang F.et al. (2003). Согласно рекомендациям авторов метода, на фоне вызванной алиментарным ожирением инсулинорезистентности производили однократное внутривенное введение стрептозотоцина (15 мг/кг массы тела) в боковую вену хвоста. Регулярный динамический контроль за развитием сахарного диабета проводили, определяя уровень глюкозы крови при помощи глюкометра OneTouch® Ultra™ (Johnson&Johnson, США), а также - регистрируя глюкозурию и кетонурию с использованием индикаторных полосок БИОСКАН^тм. Для формирования хронической алкогольной интоксикации крысам предоставляли свободный доступ к этанолу в качестве единственного источника жидкости C. Cascales (1983) в течение 2-х, а в пролонгированном варианте - 4-х месяцев. Суточное потребление составляло 5,35 +0,27 млкг^-1 абсолютного этанола в составе водного раствора концентрации 15 об.%.

Учитывая зависимость течения сахарного диабета от формы потребления алкоголя, экспериментально были смоделированы основные варианты сочетания сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации, наиболее приближенные к ситуациям, встречающимся в клинической практике. Для оценки возможного влияния алкогольной интоксикации на этапе возникновения сахарного диабета были созданы экспериментальные условия, при которых алкоголизацию крыс осуществляли в 2-х месячном периоде развития инсулинорезистентности и прекращали после введения стрептозотоцина. С целью выяснения характера воздействия алкоголя на изучаемые процессы при уже сформированном сахарном диабете моделировали 2-х месячную интоксикацию этанолом на вторые сутки после введения стрептозотоцина. Эффекты сочетания воздействия алкоголя на этапе развития инсулинорезистентности с его влиянием при уже сформированном сахарном диабете оценивали, производя хроническую интоксикацию этанолом в течение всех 4-х месяцев экспериментального моделирования сахарного диабета. Таким образом, в соответствии с поставленными задачами нами были образованы группы лабораторных животных, сведения о которых представлены в таблице 1. Лабораторных крыс выводили из эксперимента с соблюдением правил эвтаназии. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта использовали натриевую соль ЭДТА. Гомогенаты сердца готовили на 0,15 М растворе KCl в соотношении 1:5 (масса ткани/объем среды выделения), центрифугировали (4000 g, 10 мин) и полученный супернатант использовали для определения исследуемых биохимических параметров. Все процедуры выделения биоматериала проводили при температуре +4С°. Пробы плазмы крови и гомогенатов сердца помещали в пластиковые контейнеры и хранили в жидком азоте до момента исследования.

Таблица 1. Характеристика экспериментальных групп

Уровень кардиального тропонина I в экспериментальном разделе исследования определяли иммуноферментным методом (тест-система “Rat Cardiac Tn-I ELISA”, Life Diagnostics, West Chester, PA) с детекцией результатов анализа на планшетном фотометре «Multiscan EX» (Финляндия). В клиническом биоматериале оценку уровня данного кардиоспецифичного тропонина проводили с помощью иммунохроматографической системы «BIOCARD TROPONIN I» (ANI BIOTECH OY) полуколичественным методом. Положительными считали значения, равные или превосходящие 1,5 нг/мл, что соответствует лабораторно-диагностическому критерию миокардиального некроза. Определение содержания общего холестерина, холестерина ЛПВП, холестерина ЛПНП и триглицеридов сыворотки крови проводили с использованием тест-систем фирмы «HOSPITEX DIAGNOSTICS». Концентрацию общего белка в плазме крови определяли при помощи коммерческого набора “Протеин-НОВО” (ЗАО ВЕКТОР-БЕСТ, г. Новосибирск). Определение фруктозаминов в плазме крови проводили при помощи тест-системы «FRUCTOSAMINE (Modified NBT Method)» фирмы «HOSPITEX DIAGNOSTICS». Содержание тиобарбитурат-реактивных соединений (ТБК-РС) оценивали колориметрическим методом (Н. О. Стальная и соавт. 1977). Содержание ТБК-РС выражали в мкмольл^-1 плазмы крови и в мкмольмг^-1 белка ткани.

Окислительную модификацию белков оценивали спектрофотометрическим методом, предложенным Е. Е. Дубининой (1995). Содержание окисленных белковых производных выражали в нмоль^.мг^-1 белка гомогената сердца и в ммоль^.л^-1 плазмы крови. Концентрацию конечных производных оксида азота изучали по методу, предложенному Green L.C. et al. (1982) в модификации П. П. Голикова (2004).

Содержание свободных жирных кислот определяли энзиматическим методом в микропланшетном формате с помощью набора реактивов «Free Fatty Acid Quantification Kit» фирмы «BIOVISION» и выражали в мг-эквивалентах пальмитиновой кислоты на литр плазмы крови. Уровень С-реактивного белка изучали с использованием иммуноферментных систем высокочувствительного анализа: «C-reactive protein» производства «ALPCO Immunoassays» (клиническая часть) и «Rat C-reactive protein» компании «Immunology Consultants Laboratory» (экспериментальная часть). Альфа-1-кислый гликопротеин в клиническом биоматериале определяли иммунотурбидиметрически при помощи набора фирмы «Sentinel» (Италия) а в экспериментальном - иммуноферментным методом «Rat Alpha-1-Acid Glycoprotein EIA Kit» производства «Alpco Diagnostic». Концентрацию фибронектина изучали иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов: «Human Fibronectin EIA Kit» компании «American Diagnostica» (клинический биоматериал) и «Rat Fibronectin» фирмы «Immunology Consultants Laboratory» (экспериментальный биоматериал).

Измерение активности супероксиддисмутазы проводили по методике, предложенной Сирота Т. В. (1999), основанной на ингибировании реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде в присутствии супероксиддисмутазы. За единицу активности СОД принимали уровень 50%-го ингибирования реакции окисления адреналина и выражали в данных принятых условных единицах на 1 мг белка. Об активности каталазы судили по убыли перекиси водорода при л=230 нм (R. F. Beers, 1952) и выражали в международных единицах.

Активность каспазы-3 в гомогенатах сердца определяли колориметрическим методом с помощью набора реактивов «Caspase-3/CPP32» фирмы «BIOVISION» и выражали в рекомендованных разработчиками условных единицах оптической плотности. Активность МВ-фракции креатинкиназы определяли в условиях иммуноингибирования других изоферментов с помощью коммерческой тест-системы фирмы «Human» и представляли в международных единицах.

С целью определения уровня антиперекисной защиты проводили анализ пероксид-зависимой хемилюминесценции изучаемых объектов. Н₂О₂-индуцированную хемилюминесценцию плазмы крови и гомогенатов сердца регистрировали по предложенной методике (А. К. Журавлев, 1985) и оценивали по величине светосуммы за 1 мин (S) в расчёте на 1 мл плазмы крови или гомогената сердца (имп·10³·мин^-1·мл^-1).

Иммунохимический и колориметрический анализ с детекцией результатов на планшетном фотометре “Multiscan EX” (Финляндия), проводили в центральной научно-исследовательской лаборатории (зав. лабораторией, доктор медицинских наук, профессор Т. И. Долгих) Омской государственной медицинской академии. Спектрофотометрические, колориметрические, иммунотурбидиметрические и хемилюминесцентные исследования выполняли в лаборатории кафедры биохимии и лабораторной медицины ОмГМА с использованием хемилюминометра БХЛ-06 и спектрофотометра «UNICO 2802S UV/VIS».

При анализе результатов исследования использованы методы описательной и вариационной статистики с применением корреляционного анализа. Данные представлены как

min-Me(LQ-HQ)-max,

где min - наименьшее значение, Me - медиана, LQ - нижний (25-й) квантиль, HQ - верхний (75-й) квантиль, max - наибольшее значение. Численность выборок обозначена n. Различия между значениями показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни и ч-квадрат теста. Нулевой считали гипотезу о совпадении медианных значений двух независимых выборок. Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез принимали pU=0,05. При корреляционном анализе использовали определение коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с применением пакета статистических программ SPSS 11.5 (SPSS Inc., США).

Результаты исследования и их обсуждение.

В проведенном исследовании получено биомаркерное свидетельство о более высокой степени выраженности деструкции кардиомиоцитов у больных сахарным диабетом 2 типа, имеющих признаки хронического злоупотребления алкоголем. От умеренного повышения проницаемости кардиомиоцитарных биомембран, отмеченного при течении диабета у лиц без признаков хронической алкогольной интоксикации (табл. 2), почти у половины пациентов, злоупотребляющих алкоголем, процесс достиг уровня некротического характера поражения, что отражают сведения о распространенности позитивных результатов определения уровня кардиального тропонина I (cTnI) в плазме крови таких больных (табл. 3).

Таблица 2. Активность МВ-изофермента креатинфосфокиназы в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа, имеющих признаки хронического злоупотребления алкоголем (МЕ·л^-1)

Примечание: n - численность выборки, pU - статистический уровень значимости отличий по отношению к соответствующей группе, указанной нижним индексом (U-тест Манна-Уитни).

cTnI-манифестное повреждение кардиомиоцитов, в соответствии с полученными результатами, происходит на фоне выраженного острофазового ответа, что характеризуется увеличением концентрации С-реактивного белка (С-РБ) в 2,03 раза (p<0,001) и б₁-кислого гликопротеина (б₁-КГП) - в 1,7 раза (p=0,001). Выявленная напряженность острофазовых механизмов может являться дополнительным аргументом в пользу некротического генеза наблюдаемой биомаркерной реакции. Вместе с тем, повышение уровня С-РБ непосредственно способствует поражению сердца, а также потенцирует увеличение некротической зоны, активируя каскады системы комплемента. А рост концентрации б₁-КГП, в свою очередь, может быть проявлением декомпенсации сахарного диабета при его сочетании со злоупотреблением алкоголем. Кроме того, повышение уровня б₁-КГП может быть обусловлено прямым влиянием хронической алкогольной интоксикации на процессы синтеза сиалированных белков. Важен и тот факт, что с активацией провоспалительных гуморальных механизмов связано усугубление инсулинорезистентности, что также можно рассматривать в ряду причин обнаруженного более выраженного повреждения кардиомиоцитов. Таким образом, при сахарном диабете 2 типа под влиянием хронической алкогольной интоксикации формируются агрессивные в отношении миокарда тенденции со стороны гуморальных механизмов неспецифической резистентности.

Таблица 3. Доля значений концентрации кардиального тропонина I в крови, превосходящих диагностический порог миокардиального некроза, у больных сахарным диабетом 2 типа и признаками хронического злоупотребления алкоголем

Примечание. Общее количество наблюдений в группе принято за 1,0

* - статистический уровень значимости отличий при p<0,05 (ч-квадрат тест) по отношению к группам: ГК, АЛК, CД

Хроническое злоупотребление алкоголем оказывает, согласно полученным нами данным, определенное влияние на ключевые характеристики компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа. Выявленные сдвиги по отношению к лицам, отрицающим злоупотребление алкоголем, касаются уровня глюкозы крови натощак (рис. 1). Это заключается в более значительной гипергликемии, отражающей углубление нарушений препрандиального гликемического контроля. В связи с этим, вероятна гиперактивация процессов гликирования, что способствует образованию большого количества поперечных сшивок между макромолекулами межклеточного матрикса, нарушает внутриматриксные и матрикс-клеточные взаимоотношения и повышает чувствительность миокарда к неблагоприятным воздействиям. Кроме того, к числу возможных последствий более высокой гипергликемии можно отнести подавление вазодилятационного эффекта NO продуктами гликирования, что значительно повышает риск развития ишемии миокарда.

Рисунок 1. Содержание глюкозы и фруктозаминов в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем

Примечание. Статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой обозначены: «**» - p<0,01; «***» - p<0,001; по сравнению с группой СД: «#» - p<0,05 (U - тест Манна-Уитни).

Аутоокисление возросших количеств неиспользуемой глюкозы сопровождается гиперпродукцией активных форм кислорода и развитием окислительного стресса, имеющего прямое отношение к цитодеструкции. В рамках метаболического синдрома имеется устойчивая связь между нарушением углеводного обмена и развитием атерогенных вариантов дислипопротеинемий. Однако наши результаты не обнаружили неблагоприятного влияния хронической алкогольной интоксикации на липидный состав крови при сахарном диабете 2 типа. Известно, что дислипопротеинемия не является основным патогенетическим фактором развития диабетической кардиомиопатии. Вместе с тем, отмеченное нами повышение уровня С-РБ может оказывать проатерогенное действие, независимое от нарушений липидного спектра крови. Этот факт, несмотря на условия нормолипидемии, предполагает существование возможности влияния коронарогенных механизмов на развитие зарегистрированного повреждения миокарда.

Нарушение гликемического контроля патохимически сопряжено с развитием окислительного стресса и свободнорадикальным повреждением сердечной мышцы. В дополнительную интенсификацию свободнорадикальных процессов у больных сахарным диабетом 2 типа, злоупотребляющих алкоголем, могут вносить свой вклад и прооксидантные эффекты, обусловленные биотрансформацией этанола. Однако при хемилюминесцентном анализе нами показано, что возникающее при диабете нарушение баланса между уровнем катализаторов плазмы крови, разлагающих перекись водорода по радикальному и нерадикальному путям, в сторону преобладания радикал-генерирующих процессов не подвержено влиянию хронической алкогольной интоксикации (табл. 3).

Таблица 3. Светосумма Н2О2-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови у больных сахарным диабетом 2 типа и признаками хронического злоупотребления алкоголем (имп·103·мин·мл-1)

Примечание: n - численность выборки, pU - статистический уровень значимости отличий по отношению к соответствующей группе, указанной нижним индексом (U-тест Манна-Уитни).

Это касается и обусловленной диабетом интенсификации процессов перекисного окисления липидов, которая практически не изменяется вследствие сочетания сахарного диабета со злоупотреблением алкоголем (уровень ТБК-РС, рис. 2). Следовательно, данные сдвиги находятся, в большей степени, в причинно-следственных взаимоотношениях с наличием диабета и, поэтому, не могут рассматриваться в аспекте механизма формирования выявленного повреждения сердца у больных сахарным диабетом 2 типа, злоупотребляющих алкоголем.

Особенностью сочетания сахарного диабета 2 типа и хронического злоупотребления алкоголем стало более выраженное накопление в крови окисленных белковых производных (рис. 2), чего не наблюдалось у пациентов без признаков хронической алкоголизации. Отсутствие сдвигов в антиперекисной защите плазмы, оцениваемой с помощью хемилюминесцентного анализа, позволяет предполагать наличие абсолютного или относительного дефицита антирадикальной активности. С учетом этого, к вероятным причинам роста концентрации ОБП в плазме крови можно отнести как избыточную генерацию активных форм кислорода, так и снижение антиокислительных резервов.

Рисунок 2. Уровень тиобарбитурат-реактивных соединений (ТБК-РС) и окисленных белковых производных (ОБП) в плазме крови больных сахарным диабетом 2 типа с признаками хронического злоупотребления алкоголем

Примечание. Обозначения - см. рис. 1.

Истощение антиоксидантной системы и генерация свободных радикалов вследствие алкоголизации может быть следствием индукции минорных путей детоксикации этанола и, в частности, цитохром-Р450-зависимой окислительной системы. Вероятно, что по этой причине, при равной степени липопероксидации (уровень ТБК-РС) и сходного уровня нарушения антиперекисной защиты (светосумма Н₂О₂-ХЛ), у данных пациентов более интенсивно протекает окислительное повреждение белков плазмы крови.

Полученные результаты позволяют считать актуальной гипотезу о важной роли свободнорадикальной агрессии в развитии повреждения миокарда у больных сахарным диабетом 2 типа под влиянием злоупотребления алкоголем. Потенцирование окислительного стресса может быть обусловлено непосредственными эффектами алкогольной интоксикации, а также - находиться во взаимосвязи с обнаруженным нами более значительным нарушением гликемического контроля. Последнее может происходить, в том числе, и при участии выявленного напряжения гуморальных механизмов неспецифической резистентности, способствующего углублению дефицита эффектов инсулина.

Известно, что неблагоприятные явления в сердце при хронической алкогольной интоксикации связаны не только с процессами катаболизма этанола, они регистрируются и в постинтоксикационном периоде, сопровождая течение синдрома отмены алкоголя (В.С. Моисеев, 2009). Возникновение таких состояний на фоне сахарного диабета может повлечь за собой резкое снижение энергоподдержки миокарда в условиях диабетогенного повышения его чувствительности к ишемии и быть другой возможной причиной выявленного нами повреждения миокарда.

Учитывая зависимость течения сахарного диабета от формы потребления алкоголя, в экспериментальном разделе нами проведено изучение влияния алкогольной интоксикации на этапе возникновения сахарного диабета и проанализированы патохимические особенности его течения в условиях постинтоксикационного состояния. Также, охарактеризовано воздействие алкоголя на изучаемые процессы при уже сформированном сахарном диабете и эффекты сочетания воздействия алкоголя на этапе развития инсулинорезистентности с его влиянием при уже сформированном сахарном диабете. Распространение исследования на уровень соответствующих биохимических процессов в сердце позволило провести оценку характера локальных патохимических нарушений и их возможной роли в развитии повреждения кардиомиоцитов.

Хроническая интоксикация этанолом при сформированном вне алкоголизации экспериментальном сахарном диабете (группа СД+А2), согласно полученным нами данным, характеризуется резким проявлением нарушения целостности кардиомиоцитов. Уровень cTnI в плазме крови таких особей в 19,7 раза (pU_СД=0,008) превышает соответствующее значение при диабете вне алкоголизации (рис. 3). О наличии реактивного воспалительного процесса свидетельствует выраженный острофазовый ответ (рис. 4): содержание С-РБ и б₁-КГП в плазме крови становится повышенным по сравнению с течением диабета без воздействия алкоголя. При этом обнаруженное умеренное снижение уровня фибронектина может отражать его усиленное потребление при развитии тканевой деструкции. Развитие острофазового ответа при данном варианте сочетания сахарного диабета и алкогольной интоксикации может иметь патобиологическое значение в контексте усиления инсулинорезистентности под влиянием провоспалительных цитокинов, способствующей декомпенсации заболевания.

Действительно, биохимические проявления деструктивных процессов в сердце наблюдаются в условиях углубления патологии контроля гликемии, о чем свидетельствовала более высокая концентрация фруктозаминов в плазме крови (рис. 5). Это может отражать потенцирование дефицита эффектов инсулина вследствие воздействия алкоголя. Вместе с тем, по концентрации свободных жирных кислот (СЖК) в крови сделать такое заключение не представляется возможным, поскольку уровень данного показателя был снижен при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией (табл. 4). Такой эффект может быть следствием фермент-зависимого формирование этиловых эфиров жирных кислот при неокислительном катаболизме этанола. Данные производные из крови поступают в ткани, что снижает плазменный уровень СЖК, и оказывают мембранопатологическое действие, способствуя развитию повреждения. Кроме того, снижение уровня СЖК может способствовать углублению нарушений энергетического обмена в кардиомиоцитах, учитывая невозможность адекватного использования углеводных субстратов при дефиците эффектов инсулина. В связи с этим, наблюдаемое уменьшение содержания СЖК, вероятно, не вполне пропорционально и адекватно отражает степень инсулинорезистентности при хронической интоксикации этанолом. Но, с другой стороны, обнаруженное различие может быть косвенной характеристикой работы одного из звеньев возможного механизма наблюдаемого нами повреждения сердца. Нарушение сопряжения процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях под влиянием высоких концентраций этиловых эфиров жирных кислот в условиях энергетического коллапса может способствовать гиперпродукции активных форм кислорода и развитию окислительного стресса в кардиомиоцитах.

Таблица 4. Содержание свободных жирных кислот в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации (мг·л-1)

Примечание: Обозначения указаны в табл. 1.

Рисунок 3. Уровень кардиоспецифичного тропонина I в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией.

Примечание. Статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой обозначены: «*» - p<0,05; «**» - p<0,01; «***» - p<0,001; по сравнению с группой СД: «#» - p<0,05; «##» - p<0,01; «###» - p<0,001 (U - тест Манна-Уитни).

Рисунок 4. Медианы уровня С-реактивного белка (С-РБ, мг·л^-1), б₁-кислого гликопротеина (АКГП, мг·л^-1), фибронектина (ФН, мг·л^-1) и общего белка (ОБ, г·л^-1) в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией.

Примечание. Обозначения - см. рис. 3..

Рисунок 5. Медианы уровня глюкозы (ГЛ, ммоль·л^-1) и фруктозаминов (ФА, мкмоль·л^-1) в плазме крови при сочетании экспериментального сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией

Примечание. Обозначения - см. рис. 3.

Рисунок 6. Светосумма Н₂О₂-индуцированной хемилюминесценции плазмы крови (ПК) и гомогенатов сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации

Примечание. Обозначения - см. рис. 3.

Рисунок 7. Содержание тиобарбитурат-рективных соединений в плазме крови (ПК) и гомогенатах сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см. рис. 3.

Рисунок 8. Активность супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) в гомогенатах сердца при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см. рис. 3.

Рисунок 9. Уровень окисленных белковых производных в плазме крови (ПК) и гомогенатах сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см. рис. 3.

Рисунок 10. Содержание конечных стабильных продуктов NO в плазме крови (ПК) и гомогенатах сердца (ГС) при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

Примечание. Обозначения - см. рис. 3.

Схема 1. Патохимические факторы миокардиодеструкции при сочетании сахарного диабета 2 типа с хронической алкогольной интоксикацией

Результаты нашего исследования показали, что при сформированном сахарном диабете хроническая алкогольная интоксикация оказывает своё неблагоприятное воздействие непосредственно в сердце, блокируя диабетогенную компенсаторную активацию антиперекисной защиты, и не влияет на антиперекисную защиту плазмы крови (рис. 6). Подобные сдвиги зафиксированы в отношении содержания продуктов липопероксидации в сердце и крови особей данной экспериментальной группы: концентрация ТБК-РС возрастала в сердце и сохранялась на прежнем уровне в плазме крови (рис. 7). Хроническое потребление алкоголя, как показано D. S. Jaya, (1993) и S. M. Bailey (2001), вызывает дефицит антиокислительных резервов тканей, что проявляется снижением активности глутатионпероксидазы и содержания восстановленного глутатиона, а также уменьшением активности каталазы в сердце.

С учетом этого, обнаруженные нами сдвиги могут отражать связь усиления липопероксидации в сердце при хронической алкогольной интоксикации в условиях сформированного сахарного диабета с блокирующим действием алкоголя в отношении реактивной активации системы антирадикальных и антиперекисных факторов защиты. Выполненное нами исследование активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) в гомогенатах сердца показало справедливость такого предположения. Повышение активности СОД и КАТ при сахарном диабете, в аспекте полученных нами данных об интенсификации свободнорадикальных процессов, можно рассматривать как отражение компенсаторно-приспособительной реакции антиокислительной направленности. Однако если при изолированном течении экспериментального сахарного диабета активность ферментов повышалась, то с присоединением к нему алкогольной интоксикации этого увеличения не происходило, или оно происходило, но в значительно меньшей степени (рис. 8). Таким образом, нами показано, что хроническая алкогольная интоксикация при сформированном сахарном диабете ингибирует важные ферментативные звенья антиокислительной защиты сердца.

Другой деструктивный фактор свободнорадикального генеза, способный находиться среди причин обнаруженного повреждения миокарда, - окислительная модификация белков. При хронической алкогольной интоксикации на фоне сформированного в отсутствии алкоголизации сахарного диабета повышение уровня окисленных белков происходит параллельно: в плазме крови и сердце (рис. 9) при практически равном уровне белка в исследуемом биологическом материале. Это указывает на более активную продукцию свободных радикалов и/или более выраженное снижение антирадикальной устойчивости белковых молекул. Окислительная структурная модификация тканевых и плазменных белков приводит к нарушению их функции, а накопление окисленных белков в ткани сердца является инициатором апоптоза, что определяет потенциальное патогенетическое значение выявленных сдвигов.

В условиях обнаруженного ингибирования адаптационных антиокислительных процессов и нарастания явлений оксидативного стресса при хроническом воздействии алкоголя на фоне развившегося сахарного диабета нами показан рост концентрации конечных стабильных производных оксида азота (NOx) в сердце и плазме крови (рис. 10). При этом, уровень NOx в сердце данных особей на 25,8% превысил значение при сахарном диабете вне алкоголизации (p=0,015). Это создает предпосылки к усиленному образованию токсичных продуктов взаимодействия оксида азота с активными формами кислорода. С другой стороны, это может отражать активацию синтеза NO в ответ на дефицит биологического действия, обусловленный его потреблением в данных реакциях, что вызывает повышение активности NO-синтазы и гиперпродукцию NO. Цитотоксический эффект NO, как правило, регистрируется при его повышенном уровне и обусловлен его свободнорадикальной химической природой. Показано, что NO ингибирует окислительное фосфорилирование в митохондриях, связываясь с цитохромоксидазой. При гиперпродукции супероксида и образовании высоких концентраций продукта его взаимодействия с NO - пероксинитрита угнетаются ферменты дыхательной цепи.